茅臺鎮不同海拔酒廠環境可培養酵母多樣性分析

王星　譙露　周葉鳴　董醇波　韓燕峰　鄒曉

摘要：以中國醬香酒核心產區仁懷市茅臺鎮為研究區域，探索高溫大曲和環境中可培養酵母的物種多樣性，以及在不同海拔下的種群結構和相對豐度。結果顯示，從高溫大曲和環境樣品中最終分離474株酵母，鑒定為21屬32個種，其中從環境樣品中共分離269株酵母，鑒定為19屬28個種；從大曲中共分離205株酵母，鑒定為15屬18個種。Wickerhamomyces anomalus在環境和大曲中均作為核心酵母菌。環境中分離出的酵母菌多樣性指數高于高溫大曲。在不同海拔梯度上，環境樣品中酵母多樣性和豐度差異明顯，高溫大曲中酵母多樣性和豐度差異較小，主要的優勢菌群均保持一定的相似性和穩定性?？偟膩碚f，海拔500 m以上的酵母菌群落結構較為相似；海拔500～600 m的酵母菌群相對豐度及多樣性最高，海拔600 m以上酵母多樣性及豐度要低于海拔500 m以下。

關鍵詞：環境；大曲；可培養方法；不同海拔；酵母菌群多樣性

中圖分類號：TS262.33文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2023）06－0065－07國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.06.009

仁懷市位于貴州省西北部，地處赤水河中游，大婁山脈西段北側［1］。作為中國醬香型白酒的發源地和核心產區，仁懷市有著悠久的釀酒歷史、特殊的釀造環境和獨特的釀造工藝，代表著醬香白酒釀造的最高水準。醬香白酒作為我國的特色名酒，具有突出濃郁的酒體風格，是世界上最受歡迎的酒類之一［2］。其釀造工藝以“三高三長”著稱，即高溫制曲、高溫堆積、高溫蒸餾，大曲貯存時間長、基酒生產周期長、基酒酒齡長［3］。復雜的釀造工藝也造就了其他香型白酒無法比擬的特殊風味［4］。無法復制的釀造環境和常年釀酒所形成的特殊微生物區系也直接影響著發酵的產率和質量［5］。釀造過程微生物群系來源廣泛，主要有生產原料、大曲和發酵環境［6］。整個釀酒過程涵蓋著細菌、酵母、霉菌等菌群結構復雜的演替，其中酵母菌是白酒釀造發酵的主要動力［7］。酵母菌在釀造過程中大量存在，除高溫大曲自身提供的酵母外，釀造環境（如地面、空氣、使用工具等）、生產原料都能夠提供來源［8］。

茅臺鎮作為最大的醬香型白酒產地，位于仁懷西北部13 km處，屬河谷坡地。張亞麗［9］對茅臺鎮空氣微生物的群落結構進行分析，發現發酵微生物有一部分來源于當地的空氣微生物，即“離開茅臺鎮，就釀不出茅臺酒”［10］。特殊復雜的釀造工藝與不可復制的釀造環境造就了醬香型白酒獨特的風格特征，而釀造過程的極端環境，也迫使微生物經過長期生存馴化，從而形成了醬香酒釀造環境中特有的微生物菌群［11］。對釀造環境中的酵母進行研究已成為研究酵母類群的熱點。

茅臺醬香酒的工藝使得大曲能夠不斷從釀造環境中富集釀造酵母菌［12-13］，相對開放的環境也使得大曲中的酵母能夠被釋放到環境中，從而形成較為特殊的酒體風味。吳徐建［14］對醬香型白酒釀造2～7輪次環境、大曲及酒醅中的酵母進行分離鑒定，發現釀造空氣中幾乎包含了大曲中的酵母種屬。隨著茅臺醬香酒產業的發展需求增加，發酵性能好、產香性能好的酵母的分離成為研究的主要目的之一［15-16］。

研究表明，隨著海拔的變化，光照、水分、溫度、土壤養分、植物等因子也隨之改變，從而引起區域小氣候的微生物發生變化［17］。Wang等［18］跟蹤大曲發酵過程微生物的變化情況發現，大曲存放的位置不同，微生物群落的結構也會不同。因此，不同的小氣候可能會對酵母種類和數量產生影響，從而直接或間接影響醬香型白酒的發酵及其品質［19］。目前對茅臺鎮的酵母研究常限于某一輪次或某個酒廠，酵母群落結構在不同海拔層面上的關系還未揭示。因此，本研究根據茅臺鎮各酒廠在不同海拔的分布情況，大致可分為<500 m、500～600 m、>600 m等3個梯度，對不同海拔釀造環境及大曲中的酵母進行可培養分離，這有利于認識酵母菌在不同海拔上的群落結構分布差異，也為茅臺鎮的釀酒酵母研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試樣品

環境樣品及大曲樣品取自貴州省茅臺鎮核心釀酒區域，分別在海拔<500 m（H1）、500～600 m（H2）、>600 m（H3）各選取3家醬香型白酒公司，共9家（表1）。其中環境樣品采集包括：將各酒廠生產車間的窗戶玻璃、窗臺、晾堂及四周地面、墻面、墻角、行車梯子及上表面、配電箱上表面、消防箱上表面、儲酒罐和一些平時不易被打掃的角落等處的采樣點進行灰塵樣品等量采集并均勻混合，每個企業采集混合樣100 g。大曲樣品為曲房貯存使用的生產用大曲，每個企業采集混合樣500 g（取樣時間2022年7月—2023年3月）。同一海拔梯度采樣點采集的兩類樣品分別進行等量均值混勻，采集后立即裝袋密封運往實驗室。

1.1.2供試培養基

WL營養培養基：酵母粉5.0 g、酸水解酪蛋白5.0 g、葡萄糖50.0 g、磷酸二氫鉀0.55 g、氯化鉀0.425 g、氯化鈣0.125 g、硫酸鎂0.125 g、氯化鐵0.0025 g、硫酸錳0.0025 g、溴甲酚綠0.022 g、瓊脂17 g、pH值5.5±0.2。

麥芽汁液體培養基：麥芽膏粉130.0 g、氯霉素0.1 g、pH 5.6±0.2。

1.2試驗方法

1.2.1稀釋涂布平板分離

在無菌條件下分別稱取25 g大曲粉末和25 g環境樣品于225 mL無菌水中，搖床充分震蕩30 min，制成菌懸液。從菌懸液中取1 mL加到9 mL無菌水中，以10倍為稀釋單位，逐次稀釋到10-2～10-7倍，各吸取100 μL菌懸液于WL營養培養基中（3個平行）。放入30 ℃培養箱中倒置培養1～2 d，然后進行酵母計數。酵母菌的鑒定根據形態持征，參照《常見與常用真菌》中的方法鑒定［20］。

1.2.2劃線平板分離

根據稀釋涂布平板上的單菌落特征，挑取形態不同的菌株在平板上劃線純化2～3次，獲得酵母菌純培養物，純化后的菌株4 ℃斜面保存。

1.2.3酵母的分子生物學鑒定

將活化后的酵母菌株接入麥芽汁液體培養基中震蕩培養24 h后，取1 mL菌液離心后棄上清液，采用北京索萊寶科技有限公司的柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，按照說明書流程進行酵母基因組DNA提取。引物序列見表2，PCR反應體系（25 μL體系）及反應程序［21］：ITS1和ITS4各1 μL，DNA模板2 μL，Mix 12.5 μL，補充dd H2O至25 μL。94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環反應，最后72 ℃繼續延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠檢測擴增目標產物后，送上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.2.4系統發育樹構建

測序結果在NCBI（http：www.ncbi.nlm.nih.gov.blast）數據庫進行BLAST比對，初步確定分離菌株的分類地位，一般相似率為98%以上，即可認為是同一個物種。選取同源性較高的菌株作為參比對照，采用MEGA 7.0軟件進行多序列比對后，進行1000次的Bootstraps檢驗，用鄰接法（Neighbor-Joining）構建菌株系統發育樹［22］。

1.2.5數據分析

利用多樣性指數分析可培養酵母菌的物種多樣性，Sorenson相似性指數（S）比較樣本間酵母菌種類組成的相似程度。計算公式為［23］：

Shannon-Wiener指數（H）：H＝－Σ（PilnPi） （1）

Simpson指數（D）：D＝1－ΣP（2）

Pielou指數（J）：J=H/lnS （3）

Sorenson相似性指數S=2j/（a+b） （4）

式中：Pi為菌種i的個體在全部個體中的比例；S為總物種數。

使用Excel 2016處理數據并分析物種多樣性指數；Origin Pro 2021繪制相對豐度圖及和弦圖；韋恩圖由在線軟件繪制 （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）。

2結果與分析

2.1環境與大曲樣品中酵母菌的多樣性分析

如表3所示，大曲中的可培養酵母菌多樣性指數（Shannon-Wiener指數）、均勻度指數（Pielou指數）均小于環境中，兩者的Simpson指數相同，相似性（Sorenson相似性指數）程度略高。由此可知，環境樣品的酵母菌多樣性較大曲樣品豐富，這為大曲開放式獲取環境微生物提供了廣泛來源。

2.2環境和大曲中可培養酵母菌群落數量及組成

從表4可以看出樣品中酵母數量為103～105數量級，總數上大曲＞環境。結合多樣性指數分析結果來看，這離不開大曲開放式的生產、儲存、使用環境。大曲在堆積儲存過程中，實則是一個個獨立的固態發酵體系，能夠廣泛地自然接種和網羅環境中的微生物，在曲塊內形成豐富的核心菌系。雖然以前有研究認為高溫制曲的環境不利于酵母菌的生長［15］，但是通過在常溫存放的過程中，酵母的休眠體可能復蘇，同時環境中的酵母附著在曲中，因此依然蘊含著較多的酵母菌。

采用傳統培養法從3個不同海拔的環境和大曲樣品中共分離獲得474株酵母菌，其中環境269株，大曲205株。經菌落形態相似性初篩后，最終選擇106株菌送檢，鑒定為21屬32種（表5），其中環境28種，大曲18種。共有酵母菌有14種，大曲特有酵母菌有4種，環境中特有酵母菌14種（圖1）。

Pichia屬酵母菌是環境和大曲中的優勢屬，其中大曲中分離出3種，分別為P.kudriavzevii、P.farinosa和P.exigua；環境中分離出5種，分別為P.pastoris、P.kudriavzevii、P.farinosa、P.exigua和P.galeiformis。其次占優勢的是Candida屬酵母，在大曲中分離出1種，為C.albicans；環境中分離出3種，分別是C.vartiovaarae、C.solani和C.glabrata。

2.3不同海拔大曲酵母種群多樣性結構

從大曲中共分離出205株、18種酵母菌，在海拔梯度500～600 m均有分離得到，在海拔500 m以下分離出了其中12種，在海拔600 m以上分離出了其中13種。由此可知，在海拔500～600 m之間的大曲中富集了更多的酵母菌群。

從圖2可看出，大曲中的M.guilliermondii、W.anomalus、P.kudriavzevii、S.cerevisiae、S.paradoxus、Z.bailii、T.delbrueckii、T.ciferrii和Z.rouxii在3個海拔梯度中都有出現，平均相對豐度分別為13%、22%、11%、5%、4%、11%、7%、3%和2%。根據核心微生物的定義，即在樣本中分布頻率較大的普遍微生物群［24-25］，本研究發現M.guilliermondii、W.anomalus、P.kudriavzevii和T.delbrueckii是醬香型白酒大曲的核心酵母菌。

2.4不同海拔環境酵母種群多樣性結構

環境樣本中的可培養酵母菌共28種269株。經統計分析，M.guilliermondii、W.anomalus、C.vartiovaarae、C.glabrata、P.pastoris、P.kudriavzevii、Z.bailii、C.solani、P.farinosa、S.pombe、P.exigua、P.galeiformis和S.podzolica在不同海拔環境中的分布頻率為100%，平均相對豐度最大的依次為W.anomalus（20%）、M.guilliermondii（15%）、C.vartiovaarae（8%）、P.pastoris（6%），是醬香型白酒環境的核心酵母菌（圖3）。

2.5不同海拔環境及大曲中酵母菌種群和弦圖分析由圖4可知，在海拔500 m以下、500～600 m及600 m以上的環境樣品中分別分離到84株、106株和79株酵母菌。海拔500 m以下的主要優勢種為W.anomalus、M.guilliermondii和C.vartiovaarae；500～600 m的優勢菌與500 m以下相似；600 m以上的優勢種主要為P.kudriavzevii、M.guilliermondii和S.podzolica。M.guilliermondii在各個海拔梯度的環境中均廣泛存在。

在3個海拔的大曲樣品中分別分離到72株、79株和54株酵母菌。海拔500 m以下的主要優勢種為W.anomalus、P.kudriavzevii、Z.bailii；500～600 m的優勢種主要為W.anomalus和M.guilliermondii；600 m以上的優勢種主要為S.cerevisiae、W.anomalus、M.guilliermondii和Z.bailii。W.anomalus在各個海拔梯度的大曲中均廣泛存在。

2.6不同海拔環境及大曲酵母菌群落相似性分析

基于Bray-Curtis距離指數，對3個不同海拔環境及大曲酵母菌群落進行排序，通過點與點之間的距離，能夠反映不同海拔之間酵母菌組成的差異。大曲樣本中（圖5-a），第一軸的解釋率為59.1％，第二軸的解釋率為40.9％；環境樣本中（圖5-b），第一軸的解釋率為56.9％，第二軸的解釋率為43.1％，兩個樣本的總解釋率均達到100％?？偟膩碚f，海拔500 m上下的酵母菌群落組成差異較大，海拔500～600 m與600 m以上的酵母菌組成差異相對較小。說明以海拔500 m為界，酵母菌呈明顯的垂直分布特征。海拔越往上，酵母群落間的距離逐漸拉小，群落相似性也越高。

3結論與討論

本研究的環境樣品包括釀造空氣沉降灰塵、釀造車間地面灰塵、墻體表面的灰塵、粉塵、車間外地面、溝渠表面土質粉塵等，所采集樣品具有充分的代表性，能體現環境樣品特征性。采用可培養方法分離得到的474株高純度單個酵母菌株，豐富了醬香型白酒釀造的酵母菌資源，有利于菌種特性的探究和實際生產的應用。高溫大曲培養出的酵母菌數量是環境的42倍，這得益于釀造過程的開放式，使得環境中酵母菌不斷向大曲富集［26］。環境和大曲中的共有種14株，包括W.anomalus、M.guilliermondii、S.cerevisiae等常見的釀酒有益菌株。

Pichia屬是醬香大曲中常見的酵母屬，占酵母菌總數的絕大部分，可促進釀酒過程發酵和生香［27-28］。本研究從環境和大曲樣品中共分離出5種Pichia酵母，均在環境中存在，在大曲中存在3種。有研究者從醬香白酒酒醅中篩選出一株P.kudriavzeviil，發現它能夠高產乙酸苯乙酯，對白酒有提香提味作用［29］。在大曲和環境樣品中還分離到4種Candida屬酵母，該屬酵母菌具備較高的乙醇耐受性，使其在釀造過程中能夠持續貢獻產酯能力［30］。S.cerevisiae和W.anomalus作為環境和大曲中相對豐度較大的種，具有較好的產酒和產香能力，在白酒成品曲中也廣泛存在［31］。范光先等［32］從制曲發酵過程中分離得到微生物有97種，其中酵母18種。整個制曲發酵過程中發現的酵母種類主要有P.kudriavzevii、Z.cidrci、Hyphichia burtoniiai等［16］。相關醬香型白酒的研究表明，雖然酵母的數量相對于霉菌和細菌最少，但是酵母的種類和數量對酒的品質影響巨大，其中產酒酵母主要影響著酒質和出酒率［33］。產香酵母能夠產生大量的揮發性香氣化合物，能提高酒體中香味物質的含量，賦予酒體獨特的風格［34］。

3個海拔層面環境和高溫大曲中可培養酵母多樣性和豐度存在差異，環境中酵母多樣性和豐度差異明顯，高溫大曲酵母多樣性和豐度差異小。其中W.anomalus在環境和大曲中均為核心酵母菌。海拔500～600 m的酵母菌種類及豐度最高，這可能是受地勢、地形條件的影響，茅臺鎮境內氣候垂直分異較為明顯，區域分異較大，各海拔形成了獨特的小生境，影響著酵母菌群的分布［35］。其次，經調查發現，該海拔的酒廠較多，長期的釀酒活動也使得該海拔積累了豐富的酵母菌群。不同海拔的大曲和環境樣品可培養酵母菌群結構組成及豐度雖有所不同，但主要優勢菌群卻保持一定的相似性和穩定性。

通過對海拔間可培養酵母菌種群結構差異性分析，證實了不同海拔樣品中酵母菌之間存在一定的共性特征，中間海拔作為一個過渡的海拔梯度，富集了較多來自低海拔和高海拔的酵母菌群。海拔500 m上下的酵母菌呈明顯的垂直分布特征，群落差異較大。海拔越往上，群落相似性越高。本研究對環境和大曲中的酵母群落垂直分布結構有一個整體而系統的認識，也在一定程度為高溫大曲中酵母屬與海拔的關系進行了探討，為今后更好地認識和了解醬香酒品質提供科學參考。

（責任編輯：胡吉鳳嚴秀芳）

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Population Structure and Diversity of Culturable Yeast in Maotai Liquor at Different Altitudes in Maotai Town

Wang Xing Qiao Lu Zhou Yeming Dong Chunbo Han Yanfeng Zou Xiao

（1.Forestry Bureau of Renhuai，Renhuai 564500，Guizhou，China；2.Institute of Fungus Resources/College of Life Sciences，Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou，China）

Abstract：This paper explored the species diversity of culturable yeast in high-temperature Daqu and environmental samples，as well as the population structure and relative abundance at different altitudes，taking Maotai Town，Renhuai City，the core production area of Chinese Maotai-flavor liquor，as the research area.The results showed that 474 strains of yeast were finally isolated from high-temperature Daqu and environmental samples，and identified as 32 species in 21 genera.Among them，a total of 269 strains of yeast were isolated from environmental samples and identified as 28 species in 19 genera.A total of 205 strains of yeast were isolated from Daqu and identified as 18 species in 15 genera.Wickerhamomyces anomalus acts as a core yeast both in the environment and in Daqu.The diversity index of yeast isolated in the environment was higher than that of high-temperature Daqu.At different altitude gradients，the diversity and abundance of yeast in environmental samples were significantly different，while the differences in high temperature Daqu were less，and the main dominant yeast populations maintained a certain degree of similarity and stability.In general，the yeast community structure above 500 m was relatively similar，and the relative abundance and diversity of yeast community at 500～600 m were the highest，and both of them above 600 m were lower than those below 500 m.

Keywords：brewing environment; Daqu; culturable method；different altitudes；yeast community diversity