側柏葉顆粒劑對產氣莢膜梭菌Ⅳ型菌毛系統功能的抑制作用及其機制

吳玉臣,朱先鵬,李有志,侯云峰,聶 婧,尚小雷,鄧旭明,高 豐,呂強華,6*

(1.吉林大學 動物醫學學院,吉林 長春 130062;2.河南牧業經濟學院,河南 鄭州 450000;3.吉林省柳河縣農業綜合行政執法大隊,吉林 柳河135300;4.山東省飼料獸藥質量檢驗中心,山東 濟南 250022;5.山東金鑄基藥業有限公司,山東 濟南 271100;6.山東省農業科學院 畜牧獸醫研究所,山東 濟南 250100)

產氣莢膜梭菌(C.perfringens)是1892年由WELCH等[1]在約翰霍普金斯醫院的一起致命性主動脈瘤病例中首次分離得到的,也被稱為魏氏梭菌。它是一種厭氧革蘭陽性、產芽孢、大型桿狀菌,廣泛分布于人類和動物的胃腸道、食品和自然環境中[2]。目前,已知該菌產生的外毒素有12種(α、β、ε、ι、γ、δ、η、θ、κ、λ、μ和ν),根據外毒素不同可將其分為A～E 5種血清型[3]。產氣莢膜梭菌屬于典型的條件致病菌,既可導致地區性流行,又可引起散發性病例,每年都會造成大量人或動物感染和死亡。產氣莢膜梭菌感染可引起人類和動物的多種疾病,如氣性壞疽(人和動物)、壞死性腸炎(人和動物)、腸毒素血癥(動物)、人類食物中毒、抗生素相關性腹瀉和散發性非食源性疾病等[4]。在世界范圍內,產氣莢膜梭菌是引起食源性疾病暴發的重要病原之一,食源性傳播是產氣莢膜梭菌的主要傳播途徑,在英國和法國食源性疾病常見病因中位列第三,是美國食源性疾病的第二大常見致病菌[5]。

產氣莢膜梭菌可引起雞的壞死性腸炎,多見于2～6周齡的肉雞,發病率和病死率都很高,病死率甚至可達50%,嚴重危害全球養雞業的發展[6-7]?？咕幍牟缓侠硎褂煤蜑E用,引發致病菌對多種抗菌藥耐藥[8-9],導致臨床療效下降甚至治療失敗。我國農業部于2017和2018年分別制定了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃(2017—2020年)》[10]和《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案(2018—2021年)》[11],禁止在飼料端使用抗菌促生長劑,雞壞死性腸炎的發病率呈明顯上升趨勢[12]。隨著“減抗和限抗”政策的實施必然對臨床雞壞死性腸炎為代表的產氣莢膜梭菌感染造成巨大困擾,尋求新型抗菌藥物或抗菌策略對抗耐藥菌的感染迫在眉睫。研究表明,產氣莢膜梭菌在宿主腸道黏附過程主要依賴于菌體表面的Ⅳ型菌毛系統(type Ⅳ pili,TFP)[13],通過依賴于TFP促進細菌在宿主腸道內的定植、存活和復制增殖[14]。TFP在多種血清型產氣莢膜梭菌中保守存在,相比常規抗生素直接殺菌或抑菌的作用機制,以此為靶標的藥物研發成為一種理想策略。

在前期研究中,通過以TFP作為藥物篩選靶標,建立了產氣莢膜梭菌TFP抑制劑的篩選平臺,在中藥來源的天然化合物中進行大量篩選,最終獲得了活性良好的穗花衫雙黃酮。結合危害養雞業的產氣莢膜梭菌現狀,開發一種安全有效、療效確切、機制明確和無藥殘的新型中獸藥制劑。查閱大量文獻可知,側柏葉中穗花衫雙黃酮含量較高,可作為中藥制劑的候選中藥材。側柏葉,為柏科植物側柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉,一般采收于夏、秋兩季。側柏葉顆粒劑作為一種新型中獸藥制劑,目前未見抗產氣莢膜梭菌感染的報道。接下來,擬在前期基礎之上研究側柏葉顆粒劑對產氣莢膜梭菌TFP功能的抑制作用及機制,為臨床產氣莢膜梭菌感染的防控提供候選“減抗”中獸藥制劑和理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞及主要試劑側柏葉顆粒劑(批號:202012001),由保定冀中生物科技有限公司中試生產;產氣莢膜梭菌ATCC13124菌株,購自美國模式培養物集存庫(ATCC);BHI培養基、TSB培養基、厭氧產氣包、血紅素、維生素K1,購自青島海博生物技術有限公司;結晶紫試劑,購自Sigma;結腸癌細胞系Caco-2細胞,購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心;RPMI-1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶,購自Gibco;Triton X-100,購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

A.側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌在半固體培養基上滑動運動的影響;B.滑動運動率統計。NS.P>0.05;*.P<0.05;**.P<0.01。下同

1.2 主要儀器超凈工作臺(SW-CJ-IF)、恒溫培養箱(HPS250)和生物安全柜(HDL2600),購自哈爾濱東聯有限公司;恒溫振蕩器(THZ-82),購自上海躍進醫療器械廠;電子天平(BSA124S/224S-CW),購自德國賽多利斯;全自動樣品快速研磨儀(JXFSTPRP-24),購自上海凈信生物科技有限公司;免疫熒光顯微鏡(IX-83),購自日本奧林巴斯;電泳儀(PowerPacBasic)、小型垂直電泳槽(Mini Gel Tank)、半干轉轉膜儀(170-3940)和熒光定量PCR儀(CFX96),購自美國Bio-Rad;化學發光成像系統(Tanon 4200),購自上海天能科技有限公司;透射電鏡(HT8700),購自日本日立。

1.3 側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌TFP表型功能的影響

1.3.1滑動運動試驗 產氣莢膜梭菌ATCC13124接種至BHI液體培養基,置于2.5 L厭氧培養箱中37℃過夜培養。取1 mL過夜培養菌液,10 000 r/min離心5 min,重懸于100 μL BHI培養基中,將10 μL菌懸液滴至0.7% BHI瓊脂平板中央,分別設置為陽性對照組(不含側柏葉顆粒劑)、側柏葉顆粒劑組(0.7% BHI瓊脂平板中含側柏葉顆粒,質量濃度為1.3 g/L)和DMSO對照組(0.7% BHI瓊脂平板中含等體積的DMSO溶劑),置于2.5 L厭氧培養箱中37℃靜置培養72 h后,測定滑動運動數據,并采集圖像。

1.3.2生物被膜試驗 取1 mL過夜培養菌液6 000 r/min離心10 min,PBS洗滌3次,重懸于TSB培養基中,調至D600 nm=0.1,加入24孔板內,每孔400 μL。分別加入不同體積的側柏葉顆粒貯存液,使其終質量濃度分別為0,0.65和1.30 g/L,設陽性對照組(不含側柏葉顆粒)和陰性對照組(不含菌液和側柏葉顆粒),置于2.5 L厭氧培養箱中30℃靜置培養120 h。棄掉培養過后24孔板內上清,PBS洗滌3次,置于37℃電熱恒溫干燥箱烘干1 h,加入400 μL 結晶紫(0.1%),室溫染色1 h,PBS洗滌3次,加入33%乙酸400 μL溶解混勻后取100 μL 置于新96孔板中,測定D570 nm值,根據下列公式計算生物被膜形成率。生物被膜形成率=(D570 nm 樣品組-D570 nm 陰性組)/(D570 nm 陽性組-D570 nm 陰性組)×100%,以陽性對照組為100%計算。

1.4 側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細胞的影響

1.4.1細胞培養 將Caco-2細胞培養于含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的1640培養基中,于37℃和5% CO2培養箱培養16 h。

1.4.2菌懸液的制備 產氣莢膜梭菌ATCC13124接種至BHI液體培養基中,置于2.5 L厭氧培養箱中37℃過夜培養。次日,用BHI調至D600 nm=0.4備用。

1.4.3LDH法檢測側柏葉顆粒對Caco-2細胞的毒性 將Caco-2細胞接種于96孔培養板中,密度為2×104cells /孔,置于37℃和 5% CO2培養箱過夜培養。棄掉培養基,加入1640培養基,加藥,設陽性對照組(0.2% TritonX-100)、陰性對照組(僅含1640培養基)、藥物組(側柏葉顆粒終質量濃度分別為0,0.65,1.30,2.60和5.20 g/L),每組3個重復,置于37℃和5% CO2培養箱培養6 h。1 000 r/min離心10 min,取100 μL上清液至新96孔板,向各孔內加入LDH工作液100 μL,避光孵育30 min。用酶標儀測定各孔D492 nm值,計算樣品的LDH釋放率。LDH釋放率=(D492 nm 處理組-D492 nm 陰性組)/(D492 nm 陽性組-D492 nm 陰性組)×100%,以陽性對照組LDH釋放率為100%計算。

1.4.4側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細胞的影響 Caco-2細胞接種于24孔培養板中,密度為3×105cells/mL,置于37℃和 5% CO2培養箱過夜培養;每孔加入10 μL菌懸液,分為陽性對照組、陰性對照組和藥物組。1 000 r/min離心10 min后37℃靜置培養2 h;用滅菌PBS洗去未黏附細菌,每孔洗3次,加入1 mL高壓滅菌的蒸餾水,震蕩5 min充分釋放和裂解細胞,倍比稀釋涂布于BHI平板,37℃厭氧過夜培養,計數菌落形成單位(CFU)。黏附率=處理組CFU/陽性對照組CFU×100%。

1.5 側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌TFP基因轉錄和菌毛形態的影響

1.5.1qRT-PCR檢測產氣莢膜梭菌TFP基因轉錄 產氣莢膜梭菌ATCC13124置于BHI培養基過夜培養,第2天20倍稀釋擴培,加入終質量濃度為0和1.30 g/L的側柏葉顆粒,37℃厭氧培養4 h。使用TRIzol法提取細菌總RNA,使用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA,配制RT-PCR反應體系見表1,使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進行檢測,qRT-PCR反應條件見表2。引物由上海生工生物科技有限公司合成,序列信息見表3。試驗完畢,按照2-△△Ct法對數據進行統計分析。

表1 qRT-PCR反應體系

表2 qRT-PCR反應條件

表3 引物序列信息

1.5.2側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌TFP形態的影響 使用BHI培養基將產氣莢膜梭菌過夜培養物的D600 nm調整至0.1,取6 mL調后的菌液,分裝至2個試管,每管2 mL,向其中分別加入側柏葉顆粒貯存液,使其終質量濃度為1.3 g/L,同時等量DMSO的對照組,37℃靜置厭氧培養8 h。在4℃和10 000 r/min條件下離心10 min,棄上清,收集菌體,PBS洗滌3次,棄上清。使用負染色法處理樣品,在透射電鏡(TEM)下觀察產氣莢膜梭菌菌體TFP的形態。

2 結果

2.1 側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌TFP表型功能的影響

2.1.1側柏葉顆粒抑制產氣莢膜梭菌的滑動運動 如圖1所示,經37℃厭氧培養72 h后,產氣莢膜梭菌ATCC13124在0.7% BHI瓊脂平板呈現滑動運動趨勢。相比于陽性對照組,側柏葉顆粒處理組滑動運動半徑明顯減小,差異顯著;DMSO組滑動運動趨勢與陽性對照組無統計學差異。結果表明,側柏葉顆粒顯著抑制產氣莢膜梭菌的滑動運動。

2.1.2側柏葉顆粒抑制產氣莢膜梭菌生物被膜的形成 如圖2所示,與陽性對照組相比,在側柏葉顆粒的質量濃度范圍內(0.65～2.60 g/L),產氣莢膜梭菌生物被膜的形成率呈劑量性降低,表明側柏葉顆粒顯著抑制產氣莢膜梭菌生物被膜形成。

圖2 側柏葉顆粒抑制產氣莢膜梭菌生物被膜形成

2.2 側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細胞的影響

2.2.1側柏葉顆粒對Caco-2細胞無明顯檢測毒性 如圖3所示,與陰性對照組相比,不同質量濃度的側柏葉顆粒處理Caco-2細胞后,培養體系中LDH釋放率差異并不顯著,表明在受試質量濃度范圍內(0.65～5.20 g/L),側柏葉顆粒對Caco-2細胞無可檢測細胞毒性。

圖3 側柏葉顆粒對Caco-2細胞的細胞毒性

2.2.2側柏葉顆粒劑抑制產氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細胞 如圖4所示,陽性對照組黏附率為(71.05±3.70)%,不同質量濃度側柏葉顆粒組的黏附率分別為(51.15±2.23)%和(39.73±2.03)%,相比陽性對照組黏附率顯著降低。結果表明,側柏葉顆粒顯著抑制產氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細胞。

圖4 側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細胞的抑制作用

2.3 側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌TFP基因轉錄和菌毛形態的影響

2.3.1側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌TFP基因轉錄的影響 由圖5可知,質量濃度為1.3 g/L的側柏葉顆粒顯著降低產氣莢膜梭菌TFP相關基因virR、virS、pilA、pilD、pilT、pilC和pilM的mRNA轉錄。

圖5 側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌TFP相關基因轉錄的影響

2.3.2側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌TFP形態的影響 由圖6可知,在10 000倍視野中,陽性對照組菌體邊緣可見纖維狀菌毛存在,菌體周身呈絨毛狀;經側柏葉顆粒(1.3 g/L)處理后,菌體邊緣幾乎無纖維狀菌毛存在,菌體周身光滑。結果表明側柏葉顆?？梢砸种飘a氣莢膜梭菌TFP菌毛的形態,導致TFP結構缺失。

注:左側圖(×5 000);右側圖(×10 000)

3 討論

“減抗和限抗”的政策法令實施之前,畜牧生產中主要通過在飼料中添加抗生素來預防和控制病原微生物的感染,同時作為促生長劑,提升動物的生產性能,如桿菌肽和維吉尼亞霉素的應用等。隨著飼料端禁抗措施的實施,無疑給抗生素的研發、使用和銷售及臨床畜禽細菌性疾病的防控提出了新的挑戰。產氣莢膜梭菌導致的雞壞死性腸炎持續困擾養殖業的健康發展,抗生素的研發周期漫長和投資逐年增加的特點,導致新型抗生素的研發進入困境。開發新型治療策略或研制抗生素替代藥物進行畜禽疾病防控成為公認的思路。相比于傳統抗生素直接抑菌/抗菌的作用機制,通過抑制細菌生命過程非必需成分(如溶血素、菌毛、鞭毛和產氣莢膜梭菌TFP)為靶標的抗毒力藥物研發成為研究熱點。近年來,已有許多以細菌毒力因子為靶標的天然化合物和小分子抑制劑陸續被報道出來[15-17],也為新型藥物研發提供了科學范例。我國中藥資源和應用歷史悠久,尤其清熱解毒或補中益氣等藥性的中藥及方劑為抗感染藥物研發和臨床應用奠定了基礎。中藥具備來源廣、活性豐富、成本低、無藥物殘留和綠色環保等優勢,為抗細菌感染新藥研發提供了良好的資源寶庫。隨著如今人們生活水平的提高和環保意識的增強,對綠色健康養殖和動物性產品的安全性要求提出了新的要求,開發新型獸用中藥制劑成為抗生素替代藥物研發的突破點。本研究正是基于前期研究基礎,通過建立靶向產氣莢膜梭菌TFP的小分子抑制劑篩選平臺,在中藥來源的天然化合物中進行篩選,獲得了活性良好的穗花衫雙黃酮。通過選擇成藥性良好的側柏葉作為理想中藥材,經過提取工藝、處方工藝和制劑工藝研究制備出適合規?；B雞場群體給藥的側柏葉顆粒制劑,旨在研發含量較高、活性良好和含量穩定的防治雞壞死性腸炎的新型獸用制劑。

為了闡明側柏葉顆粒劑的藥理活性和作用機制,在前期研究基礎之上進行了后續研究。首先,通過滑動運動和生物被膜測試2種表型驗證側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌TFP功能的抑制作用;隨后,通過細胞黏附試驗測定側柏葉顆粒抑制產氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細胞的作用;最后,借助qRT-PCR測定側柏葉顆粒對TFP相關基因轉錄的影響,結合透射電子顯微鏡(TEM)觀察側柏葉顆粒處理對產氣莢膜梭菌TFP形態的影響,通過以上研究確證了側柏葉顆粒對產氣莢膜梭菌TFP功能的抑制作用,闡明抑制產氣莢膜梭菌TFP介導功能的作用機制。綜上所述,該研究為產氣莢膜梭菌感染的雞壞死性腸炎防治提供了新型中獸藥制劑,也為側柏葉顆粒劑的臨床開發和應用提供了科學依據。