牦牛ATG5多克隆抗體的制備及應用

高 翔,潘陽陽,2,王 萌,2,焦正興,王靖雷,馬文斌,王軍乾,余四九,2,崔 燕,2,王立斌,2*

(1.甘肅農業大學 動物醫學院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心,甘肅 蘭州 730070)

自噬(autophagy)是真核細胞中普遍存在的生命現象,是將細胞內變形、衰老或損傷的蛋白質和細胞器轉運到溶酶體腔中消化降解的一種代謝過程,在維持細胞正常功能中起著重要作用[1-2]。哺乳動物卵泡發育過程中,自噬有助于維持健康的原始卵泡數量、生殖細胞存活和去除黃體殘余物并誘導細胞凋亡[3-4],對卵巢閉鎖和生殖細胞發育進行調控[5-6]。自噬相關蛋白通過介導多種信號誘導自噬以維持雄性生殖細胞的發育過程[7]。當自噬相關基因在雄性生殖細胞中被破壞后,將導致精子頂體發育異常、線粒體重排以及多余細胞質殘留以及受精卵個體發育失敗[8]。研究表明,子宮內膜在卵巢激素的調控下發生自噬,導致免疫細胞浸潤,對子宮內膜脫落、組織修復和預防感染起著不可或缺的作用[9]。在胚胎附植過程中,子宮內膜自噬水平也發生顯著變化,附植前期子宮內膜細胞中自噬水平較高,隨著附植完成,自噬水平出現顯著下調[10],說明自噬在維持妊娠中發揮重要作用。

在已知的自噬相關 (autophagy-related,ATG)蛋白中,ATG5蛋白是自噬囊泡形成不可或缺的[11]。ATG5蛋白作為自噬與細胞凋亡之間的分子開關,它的缺失可導致細胞自噬水平下調或完全被抑制[12]。在自噬體囊泡伸長和成熟過程中,ATG7蛋白和ATG10蛋白促進ATG12蛋白和ATG5蛋白結合形成二聚體復合物 (ATG12-ATG5-ATG16L1),這是微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)之間形成共價鍵所必需的[13]。而LC3前體在ATG4蛋白的作用下轉化為LC3-Ⅰ,由ATG7蛋白激活并轉移到ATG3蛋白。ATG12-ATG5-ATG16L1 復合物促進LC3-Ⅰ從ATG3蛋白轉移到PE以產生LC3Ⅱ,它是自噬通量的標準標記,定位于自噬體的內膜和外膜[14-17]。

牦牛(Bosgrunniens)是生活在高海拔地區的特有畜種,常年放牧飼養,生活環境氣候條件非常惡劣,高寒低氧。牦牛主要分布在我國青藏高原,占世界牦?？倲档?5%,是當地居民重要的生活物資來源,有很高的經濟價值。受到自然環境的影響,牦牛的生產性能和繁殖性能比較低下,且人們對其生殖生理活動的研究相對較少。本研究通過合成牦牛ATG5基因,構建重組質粒,誘導重組蛋白表達,并用表達的蛋白免疫日本大耳白兔,制備牦牛ATG5多克隆抗體,并檢測ATG5蛋白在牦牛組織中的表達情況,為進一步利用輔助生殖技術提高牦牛的繁殖率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集

1.1.1實驗動物 日本大耳白兔購自蘭州獸醫研究所,10月齡,雌、雄各1/2,室內飼養,飲水充足,健康狀況良好。

1.1.2牦牛組織樣品采集 本研究所用的牦牛組織樣品采集自青海省西寧市某屠宰場。健康成年牦牛經頸動脈放血屠宰后,采集組織樣品,分別置于4%多聚甲醛溶液和液氮中用于后期試驗。牦牛輸卵管上皮細胞由甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心提供。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1主要儀器 超聲波細胞破碎儀,寧波新芝生物公司;酶標儀,美國Thermo公司;顯微拍照儀,日本Olympus公司。

1.2.2主要試劑 原核表達載體pET-32a由甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心保存; 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside,X-gal)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG),北京Solarbio公司;親和層析柱料和佐劑,默克(中國)有限公司;感受態細胞BL21(DE3),大連TaKaRa公司;磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline,PBS),Gibco (美國)公司;HistostainTM-Plus Kits免疫組化染色試劑盒,博奧森(北京)公司。

1.3 牦牛pET-32a-ATG5重組質粒的構建

1.3.1人工合成目的基因 根據GenBank公布的牦牛ATG5基因序列(登錄號:MK531791),由武漢戴安生物技術有限公司人工合成牦牛ATG5基因片段,長度為840 bp,包含限制性內切酶Hind Ⅲ和BamHⅠ位點。

1.3.2構建重組質粒 將獲得的ATG5基因片段與pET-32a(含有His與Trx標簽,蛋白相對分子質量大小為20 kDa)質粒連接,構建pET-32a-ATG5重組質粒。使用內切酶XhoⅠ和ApaBⅠ對重組質粒進行雙酶切驗證。

1.4 牦牛ATG5重組蛋白原核表達將pET-32a-ATG5重組質粒轉化至BL21(DE3)感受態細菌,恒溫箱培養過夜。挑選6個單克隆, 37℃ 220 r/min培養至菌液D600 nm=0.5～0.6時,加入終濃度0.5×10-3mol/L IPTG。20℃恒溫誘導3.5 h,通過SDS-PAGE篩選表達好的菌株。將表達良好的菌種接種至200 mL抗性培養基中,37℃ 220 r/min培養過夜。加入新鮮抗性培養液至800 mL,培養2 h,至菌液D600 nm=0.5～0.6,加入終濃度1 mol/L IPTG,37℃誘導3.5 h。

1.5 牦牛ATG5重組蛋白的純化將1.4所得菌液4℃條件下,4 000 r/min離心15 min收集菌體,棄上清。PBST重懸菌體,加入終濃度1×10-3mol/L PMSF,超聲破碎6 min。220 r/min,4℃孵育1 h;8 000 r/min 離心15 min,收取上層清液。加入含有400 μL 純化樹脂的層析柱中,4℃結合過夜。2 000 r/min 離心5 min,收集純化樹脂后用0.02 mol/L 咪唑洗滌液清洗2次;加入300 μL濃度為0.3 mol/L的咪唑洗脫液,4℃孵育1 h,離心收集上清。再次加入300 μL的洗脫液,靜置1 h,離心收集上清,將2次洗脫液合為1管。SDS-PAGE鑒定蛋白相對分子質量。

1.6 牦牛ATG5多克隆抗體的制備

1.6.1動物免疫及抗血清的獲得 利用純化后的ATG5重組蛋白免疫2只日本大耳白兔,首次免疫時使用弗氏完全佐劑,加強免疫使用弗氏不完全佐劑。4次加強免疫后,采集血清。置于4℃冰箱靜置過夜,使血清充分析出。4℃ 4 000 r/min離心5 min得到分離的抗血清,-80℃保存備用。

1.6.2Western blot檢測抗血清特異性 取ATG5重組蛋白,100℃水浴10 min 進行蛋白SDS變性。配置10%的分離膠溶液和5%的濃縮膠溶液,向樣品槽中分別加入15 μL樣品,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離蛋白。將蛋白轉移至PVDF膜,一抗為所制備的日本大耳白兔血清,稀釋比例為1∶1 000,4℃孵育過夜;洗滌后,孵育山羊抗兔二抗,稀釋比例為1∶8 000,室溫水平搖床孵育1 h,洗滌后曝光。

1.6.3牦牛ATG5多克隆抗體的純化 室溫下,將1 mg純化蛋白質與溴化氫活化的 Sepharose 4B柱顛倒混勻1 h,制備親和純化柱;10 mL抗血清與親和純化柱孵育過夜;pH=5.0的HCl預洗,除去雜抗體,pH=2.5,0.15 mol/L的甘氨酸電泳緩沖液洗脫,10×PBS緩沖液中和,制備親和純化抗體;對PBS緩沖液透析換液,-80℃ 保存備用。

1.7 牦牛ATG5多克隆抗體的效價及特異性檢測

1.7.1間接ELISA法檢測牦牛ATG5多克隆抗體的效價 使用碳酸鹽緩沖液稀釋純化的牦牛ATG5重組蛋白,按照每孔100 ng 加入聚苯乙烯96孔板中,4℃ 孵育過夜;牦牛ATG5多克隆抗體,按1∶10 000,1∶20 000,1∶40 000,1∶80 000,1∶160 000,1∶320 000,1∶640 000,1∶1 280 000,1∶2 560 000,1∶5 120 000,1∶10 240 000進行倍比稀釋(空白血清做陰性對照),每孔100 μL,溫室孵育1 h,棄去孔內液體,洗滌3次。每孔加入100 μL HRP標記的山羊抗兔IgG,37℃孵育40 min,棄去孔內液體,洗滌3次。每孔加100 μL顯色液,溫箱暗處放置30 min,加入50 μL終止液終止顯色。以D450 nm陽性血清/D450 nm陰性血清>2.1的最大稀釋倍數為抗體效價。

1.7.2免疫熒光檢測牦牛ATG5多克隆抗體的特異性 選取原代牦牛輸卵管上皮細胞,調整細胞密度為1×105個/mL,鋪于賴氨酸包備的蓋玻片上,培養箱培養5 h,使細胞貼壁;PBS清洗3次,1 min/次;2%多聚甲醛固定1 h;PBS清洗3次,5 min/次;0.5% Triton X-100透化20 min;PBS清洗3次,5 min/次;1% BSA封閉2 h;PBS清洗3次,5 min/次;牦牛ATG5多克隆抗體(1∶500)4℃孵育過夜;PBS 清洗3次,5 min/次;加入FITC標記的二抗(1∶1 000)避光孵育2 h;PBS清洗3次,5 min/次;DAPI避光染色3 min;PBS 清洗3次,10 min/次;甘油封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.8 牦牛ATG5多克隆抗體的應用

1.8.1牦牛ATG5蛋白在不同年齡牦牛睪丸組織中的表達 取2,4,6,8歲牦牛睪丸組織樣品提取總蛋白,與6×蛋白上樣緩沖液3∶1混合,100℃水浴10 min 進行蛋白SDS變性。配置10%的分離膠溶液和5%的濃縮膠溶液,進行SDS-PAGE分離蛋白。220 mA冰浴電轉1 h,將目標蛋白轉移至PVDF膜,使用PBST配制的5%脫脂奶粉溶液封閉2 h;以制備的牦牛ATG5多克隆抗體為一抗(1∶1 000),4℃孵育10 h;TBST 溶液清洗3次,每次10 min;生物素標記的羊抗兔抗體為二抗(1∶7 000),37℃ 孵育1 h;TBST溶液清洗5次,每次5 min,發光顯色后進行拍照。通過灰度值分析,以β-actin蛋白作為參照,采用相對定量方法比較不同組ATG5蛋白表達水平。

1.8.2免疫組織化學法檢測ATG5蛋白在不同年齡牦牛睪丸組織中的分布 制作常規組織切片,使用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復,室溫自然冷卻后,PBS洗滌3 min×3次;滴加3% H2O2,37℃ 孵育15 min,以阻斷內源性過氧化物酶活性,滴加封閉液(A液)室溫孵育15 min。滴加制備的牦牛ATG5多克隆抗體(1∶500),4℃ 濕盒孵育過夜,對照組滴加0.02 mol/L PBS替代一抗。滴加二抗(B液),37℃濕盒孵育15 min。滴加C液,37℃濕盒孵育15 min,加DAB試劑顯色,蘇木精復染,酒精脫水,二甲苯透明,樹脂封片,顯微鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 重組質粒pET-32a-ATG5的構建及驗證構建的pET-32a-ATG5重組質粒,經限制酶XhoⅠ和ApaBⅠ雙酶切形成2條帶,分別為1 862 bp(包含ATG5基因片段)和4 853 bp(圖1),試驗結果符合預期。成功構建的pET-32a-ATG5重組質?？捎糜贏TG5重組蛋白表達。

M.DL5000 DNA Marker;1.雙酶切后的產物片段;2.pET-32a-ATG5重組質粒

2.2 牦牛ATG5重組蛋白原核表達挑選轉化平板的6株BL21(DE3)-pET-32a-ATG5單克隆菌,經IPTG 誘導后SDS-PAGE檢測,6株單克隆菌均可表達蛋白相對分子質量約為53 kDa的重組蛋白(圖2A);經灰度值分析,菌株5的ATG5重組蛋白表達量最高(圖2B),可用于牦牛ATG5重組蛋白的純化。

A.SDS-PAGE檢測原核表達的重組蛋白(M.蛋白Marker;1～6.菌株);B.ATG5重組蛋白相對表達水平(1～6.菌株)

2.3 牦牛ATG5重組蛋白的純化IPTG誘導牦牛ATG5重組蛋白大量表達,并對其進行純化,經SDS-PAGE鑒定,牦牛ATG5重組蛋白相對分子質量約為53 kDa,(圖3A)。透析后,經SDS-PAGE鑒定,目的條帶單一無雜帶(圖3B)。ATG5重組蛋白純化效果良好,可用于動物免疫。

A.SDS-PAGE檢測純化蛋白(M.蛋白Marker;1.目的蛋白洗脫1;2.目的蛋白洗脫2;3.目的蛋白富集樣);B.SDS-PAGE檢測純化透析的蛋白(M.蛋白Marker;1.BSA;2.目的蛋白透析至PBS樣品)

2.4 牦牛ATG5多克隆抗體制備

2.4.1Western blot檢測抗血清特異性 免疫2只日本大耳白兔后,采集血清。通過Western blot檢測,抗血清與牦牛ATG5-His-Trx重組蛋白能發生特異性反應,蛋白相對分子質量為53 kDa(圖4),與預期結果一致。對抗血清純化后得到牦牛ATG5多克隆抗體。

1.重組蛋白1;2.重組蛋白2

2.5 牦牛ATG5多克隆抗體的效價及特異性檢測

2.5.1牦牛ATG5多克隆抗體效價檢測 通過間接ELISA驗證制備的牦牛ATG5多克隆抗體效價,根據D450 nm陽性血清/D450 nm陰性血清>2.1的最大稀釋倍數為多克隆抗體的效價,結果顯示,所制備的牦牛ATG5多克隆抗體效價大于1∶1 280 000。如表 1、圖5所示。

表1 不同稀釋度的D450 nm

圖5 牦牛ATG5多克隆抗體不同稀釋度的D450 nm

A.DAPI細胞核染色(藍色);B.ATG5多克隆抗體特異性染色(紅色);C.α-Tubulin內參多克隆抗體特異性染色(綠色);D.合并圖像后顯色(橙黃色)

A.ATG5蛋白表達檢測;B.ATG5蛋白相對表達水平(不同字母表示組間差異顯著,P<0.05)

2.5.2免疫熒光檢測牦牛ATG5多克隆抗體特異性 通過免疫熒光檢測牦牛ATG5多克隆抗體的特異性,結果如圖6所示,制備的牦牛ATG5多克隆抗體能與牦牛輸卵管上皮細胞中的ATG5蛋白發生特異性結合,ATG5蛋白主要分布在牦牛輸卵管上皮細胞細胞核周邊及胞質中。

2.6 牦牛ATG5多克隆抗體的應用

2.6.1牦牛ATG5蛋白在不同年齡牦牛睪丸組織中的表達 通過Western blot檢測不同年齡組牦牛睪丸組織中ATG5蛋白的表達。ATG5蛋白在各年齡組牦牛睪丸組織中均有表達(圖7A),且各組差異顯著(P<0.05)。2歲組ATG5蛋白表達水平最低,隨著年齡增長ATG5蛋白表達水平隨之升高,6歲組ATG5蛋白表達最高。隨著牦牛年齡繼續增長,8歲組ATG5蛋白表達水平出現下降(圖7B)。

2.6.2ATG5蛋白在不同年齡牦牛睪丸組織中的定位 通過免疫組化檢測ATG5蛋白在2,4,6,8歲牦牛睪丸組織中的表達,結果如圖8所示,2,4,6歲牦牛睪丸組織中,ATG5蛋白表達于支持細胞、精原細胞、初級精母細胞和精子細胞。8歲牦牛睪丸組織中,ATG5蛋白表達于支持細胞和精子細胞。

3 討論

本研究通過原核表達的方法獲得牦牛ATG5重組蛋白,經過蛋白純化,免疫日本大耳白兔成功獲得兔抗牦牛ATG5多克隆抗體。制得的牦牛ATG5多克隆抗體效價大于1∶1 280 000,張加姿等[18]制備的小麥ATG5多克隆抗體效價為1∶25 600,表明本研究所制備的兔抗牦牛ATG5多克隆抗體具有較高的靈敏度。

在原核表達、重組蛋白純化和抗血清特異性檢測過程中,SDS-PAGE測得重組蛋白的相對分子質量約為53 kDa,Western blot測得抗血清與重組蛋白結合的相對分子質量同為53 kDa。在應用多克隆抗體對不同年齡牦牛睪丸組織中ATG5蛋白表達檢測過程中,Western blot檢測結果顯示牦牛ATG5蛋白的相對分子質量約為33 kDa,這與張現偉等[19]對抗人ATG5單克隆抗體的相關研究結果一致。這是由于pET-32a載體自帶Trx標簽,位于pET-32a載體中目的基因的N-端。ATG5重組蛋白中,Trx蛋白標簽的相對分子質量大約為20 kDa。將重組蛋白用于免疫白兔,動物會對ATG5核心蛋白及Trx蛋白標簽分別產生相應抗體,但Trx蛋白標簽產生的抗體并不與天然蛋白產生特異性結合,并且試驗過程中Trx標簽也沒有對ATG5基因片段的表達造成干擾,不影響ATG5多克隆抗體的特異性。

在驗證牦牛ATG5多克隆抗體特異性的免疫熒光檢測試驗中,結果顯示,制備的牦牛ATG5多克隆抗體能夠與牦牛輸卵管上皮細胞表達的ATG5蛋白發生特異性結合,這與王靖雷等[20]對輸卵管組織ATG5蛋白表達的相關研究結果一致。同時,試驗還進一步發現ATG5蛋白在牦牛輸卵管上皮細胞的表達主要集中在細胞核周邊及細胞質中。研究表明,ATG5蛋白能在自噬早期階段標記正在擴展和生長的吞噬泡[21]。由ATG5蛋白標記的吞噬泡位于內質網(endoplasmic reticulum,ER)的外表面,在快速招募ATG8蛋白之后,最初的吞噬泡開始延伸,其邊緣存在著ATG5復合體。吞噬泡的膜一旦閉合,ATG5蛋白則離開該結構,同時,新產生的自噬小泡離開ER[22]。這與本研究在牦牛輸卵管上皮細胞免疫熒光檢測中得到的結果一致。

本研究通過Western blot和免疫組織化學法以不同年齡牦牛睪丸組織作為研究對象檢測ATG5蛋白的表達。Western blot結果顯示,ATG5蛋白在2,4,6,8歲牦牛睪丸組織中均有表達。免疫組化結果顯示,ATG5蛋白在各年齡段牦牛睪丸支持細胞中表達較為穩定。支持細胞是生精小管中唯一的體細胞,支持細胞不僅通過控制自身數量和功能來調節精子發生,還通過旁分泌作用來滋養支持細胞周圍的生殖細胞[23]。同時支持細胞還能通過吞噬作用迅速清除凋亡細胞,維持生精小管環境[24]。這可能表明ATG5蛋白參與精子生成的調節過程。根據灰度值分析不同年齡組ATG5蛋白相對表達水平,2歲組ATG5蛋白表達水平最低,隨著年齡增長ATG5蛋白表達水平隨之升高,6歲組ATG5蛋白水平顯著高于其他年齡組。隨著牦牛年齡繼續增長,8歲組ATG5蛋白表達水平出現下降。結合免疫組化結果2,4,6歲牦牛睪丸組織中ATG5蛋白分布于支持細胞、精原細胞、初級精母細胞和精子細胞。8歲牦牛睪丸組織中,僅觀測到ATG5蛋白位于支持細胞和精子細胞,精原細胞和初級精母細胞未見ATG5蛋白分布。公牦牛的初情期一般為2歲,種公牦牛配種能力最旺盛的時期為3～7歲,7歲以后生殖能力下降。這與本研究結果一致,推測牦牛睪丸組織中ATG5蛋白的表達與公牦牛生殖能力正相關,并且ATG5蛋白在牦牛睪丸組織中的表達極有可能受到下丘腦-垂體-性腺軸及相關激素的調控。