GRP94通過PI3K/AKT/mTOR信號通路促進牛肌肉衛星細胞分化

李 爽,付玉瑩,佟慧麗,李樹峰,嚴云勤*

(1.東北農業大學 生命科學學院 細胞與發育生物學實驗室,黑龍江 哈爾濱 150030;2.黑龍江省動物細胞與基因工程重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150030)

肌肉衛星細胞 (muscle derived satellite cells,MDSCs)是一種存在于成熟肌肉組織中的肌肉細胞的前體干細胞。正常條件下MDSCs保持靜息狀態,當肌肉受到損傷或刺激時,存在于基底膜的MDSCs被激活并開始增殖,或退出細胞周期、遷移并相互融合形成新的肌纖維,這個過程被稱為細胞分化[1-2],受許多因素和信號通路的調控。MyoG是轉錄因子家族的成員,在骨骼肌衛星細胞的分化時表達[3]。MHC為肌肉結構蛋白,它們是檢測骨骼肌衛星細胞分化的標志分子[4]。

葡萄糖調節蛋白 94 (glucose-regulated protein 94,GRP94),也稱為 gp96 或熱休克蛋白 90 kDa β成員1( heat-shock protein 90 β1,HSP90b1),是分子伴侶家族的成員,主要存在于內質網中[5]。研究表明,GRP94對于肌肉發育至關重要,GRP94基因敲除小鼠胚胎干細胞不能分化為肌肉組織,GRP94表達水平的降低會抑制C2C12細胞的分化。相反,GRP94 的過表達可以加速肌管的形成[6-7]。前期研究工作表明,GRP94促進小鼠C2C12細胞分化[8]。但是GRP94對牛MDSCs分化的影響及其作用的分子機制尚不清楚。

PI3K信號介導多種關鍵的生物學過程,如葡萄糖穩態、蛋白質合成、細胞增殖和存活[9]。PI3K的激活可以通過第二信使磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate,PIP3)向AKT傳遞信號,通過磷酸化激活AKT。 AKT進一步激活mTOR,調節細胞生命活動,如細胞生長、增殖和遷移等[10-13]。此外,PI3K/AKT/mTOR 抑制分化并促進 C2C12 的增殖[8]。但是,PI3K/AKT/mTOR信號通路與牛MDSCs分化的關系尚不明確。

本研究旨在探討GRP94對牛MDSCs分化的影響,闡明GRP94調節牛MDSCs分化的分子機制,挖掘調控牛MDSCs分化的功能基因,從而為牛肌肉品種改良和育種提供有利支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料細胞培養相關試劑購自Gibco公司與Sigma公司;Anti-GRP94(bs-0147R)、Anti-Desmin (bs-1026R)、Anti-PI3K (bs-2067R)、Anti-phospho-PI3K (bs-5570R)、Anti-AKT1+2+3 (bs-6951R)、Anti-phospho-AKT1+AKT2+AKT3 antibody (bs-5193R)、Anti-mTOR (bs-1992R)、Anti-Phospho-mTOR antibody (bs-5329R)、Goat Anti-Rabbit IgG H&L(bs-0295G)、Goat Anti-Rabbit IgG H&L/FITC (bs-0295G-FITC) 購自博奧森公司;PI3K抑制劑(LY294002)、mTOR抑制劑(Rapamycin)購自Selleck公司;T4連接酶、BbsⅠ酶購自NEB公司;pSPgRNA、SP-dCas9、SP-dCas9-VPR購自Addgene公司。

A.牛MDSCs未分化與不同分化不同階段(1,3,5 d)的免疫熒光染色結果(×100)(綠色熒光為GRP94蛋白,藍色為DAPI染色的細胞核);B～E.未分化與分化不同天數的牛MDSCs中GRP94、MyoG和MHC的蛋白表達。**.P<0.01;ns.P>0.05。下同

1.2 試驗動物及細胞培養本試驗用新生胎牛肌肉經黑龍江省東北農業大學動物保護委員會審查批準后獲取。取新生胎牛脛骨前肌(n=3),剪碎后加入0.1% 膠原酶Ⅰ,37℃水浴搖床孵育2 h,離心后PBS清洗沉淀物,接下來利用含0.25% EDTA的胰蛋白酶消化30 min,過400目銅網,離心去上清,向沉淀物中加入培養液,獲得原代牛MDSCs。

上述分離獲得的牛MDSCs培養在含10%FBS、含100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的高葡萄糖培養基中。每2 d更換1次培養基,當細胞匯合度達到50%～60%后利用含有0.1%EDTA的胰蛋白酶消化細胞,將細胞均勻接種至6孔板中。培養24 h后,細胞密度達到70%,可用于細胞分化或細胞轉染。用含2%馬血清的高糖培養基對細胞進行誘導分化,根據試驗需要分化培養不同的時間。

1.3 試驗方法

1.3.1GRP94基因sgRNA載體的構建 用 TRIzol 試劑從細胞中提取總RNA,針對牛 GRP94(NCBI 基因 ID:282646)啟動子序列(從-899～+1)設計sgRNA序列,在sgRNAs前面加上“CACC”,作為BbsⅠ酶切位點保護堿基,具體序列如表1。由上海生工合成后進行退火接合。將不同的sgRNA序列分別克隆到pSPgRNA載體中,并命名為 pSPgRNA-B(1～3)。

表1 針對牛GRP94基因啟動子區的靶序列

1.3.2采用CRISPR技術激活或抑制GRP94的表達 將細胞傳代至六孔板中,待細胞密度達到70%～80%時,利用PEI將構建好的質粒轉染細胞。其中,pSPgRNA-B(1～3)分別與SP-dCas9-VPR(VPR)載體共轉染細胞,利用CRISPR系統達到高效啟動GRP94基因的目的,以此激活GRP94基因的表達;pSPgRNA-B(1～3)與dCas9共轉染細胞,以此抑制GRP94基因的表達。轉染后分化培養細胞72 h,收集樣品。

1.3.3PI3K和mTOR抑制劑添加對細胞分化的檢測 在牛MDSCs分化培養過程中分別加入PI3K的抑制劑LY294002(10 μmol/L)及mTOR抑制劑Rapamycin(Rapa)(500 nmol/L),對照組在培養液中加入2 μL DMSO,分化培養細胞72 h。每個平行試驗重復3次。收集細胞用于后續Western blot及免疫熒光檢測。

1.3.4蛋白提取及Western blot 利用PBS清洗細胞3次,加入蛋白裂解液在冰上裂解細胞20 min,收集蛋白。利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。加入上樣buffer,煮沸10 min,離心10 min,儲存于-80℃冰箱中。配置濃度為5%濃縮膠和10%分離膠進行電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育等操作。最后利用ECL發光液及化學發光儀曝光,Image J軟件灰度掃描分析。

1.3.5免疫熒光染色 向上述試驗樣品中加入冷甲醇固定20 min。利用0.5%Triton X-100的磷酸鹽緩沖液(PBST)透膜處理15 min,加入含有5% BSA的PBST 37℃培養箱孵育1 h進行封閉。一抗4℃過夜。熒光標記二抗37℃孵育2～3 h。DAPI染液室溫染色。用倒置熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

2 結果

2.1 GRP94在牛MDSCs分化過程中的表達規律誘導牛MDSCs分化5 d,分別于未分化(0 d),分化1～5 d 收集蛋白樣品并固定細胞。利用免疫熒光染色檢測GRP94的表達,綠色熒光表示GRP94蛋白陽性信號。結果如圖1A所示,隨著細胞的分化,綠色熒光逐漸加深,GRP94表達顯著增加。Western blot對細胞分化標志基因MyoG及MHC的表達進行檢測,結果如圖1B～E所示,MyoG及MHC的表達顯著增加,表明細胞分化程度是逐漸增加的。同時隨著細胞分化的增加,GRP94表達顯著增加。綜上,隨著牛MDSCs分化的進行GRP94表達顯著增加。

2.2 GRP94對牛MDSCs分化的影響為了明確GRP94對牛MDSCs分化的影響,本研究利用CRISPR/dCas9基因編輯系統來體外調控GRP94的表達,檢測分化相關指標。

2.2.1激活GRP94對牛MDSCs分化的影響 在牛MDSCs中共同轉染VPR及靶向GRP94基因啟動子的sgRNA載體(pSPgRNA-B1、pSPgRNA-B2或pSPgRNA-B3),以實現GRP94表達的激活。Western blot結果表明,與對照組相比,pSPgRNA-B3處理組激活GRP94表達量的效果最顯著。以此用于后續激活GRP94表達的試驗研究。激活GRP94表達后誘導細胞分化至72 h,首先利用Western blot檢測MyoG及MHC的表達。結果如圖2C～F,GRP94表達增加后MyoG及MHC表達顯著增加。此外,Desmin的免疫熒光結果及肌管融合率顯示,激活GRP94表達后肌管明顯增多,與對照組相比肌管融合率增加了27.65%(圖2G、H)。上述結果表明,GRP94表達增加促進牛MDSCs分化。

A、B.GRP94激活表達載體的篩選;C～F.Western blot檢測激活GRP94表達后MyoG和MHC蛋白表達變化;G、H.免疫熒光檢測激活GRP94的表達對肌管融合的影響(×100)。綠色熒光代表Desmin染色,藍色為DAPI染色的細胞核。下同

2.2.2抑制GRP94對牛MDSCs分化的影響 利用SP-dCas9(dCas9)載體與靶向GRP94基因啟動子的sgRNA載體(pSPgRNA-B1、pSPgRNA-B2或pSPgRNA3)共同轉染細胞后,誘導細胞分化至72 h,檢測GRP94的表達。結果如圖3A、B所示,pSPgRNA-B3處理組顯著抑制GRP94的表達,以此用于后續試驗。Western blot檢測結果如圖3C～F所示,抑制GRP94后MyoG和MHC的表達顯著降低。免疫熒光Desmin染色結果顯示,抑制GRP94表達后,細胞中肌管減少(圖3G),肌管融合率減少了18.91%(圖3H)。上述結果表明,GRP94表達減少阻礙牛MDSCs分化。

A、B.GRP94抑制表達載體的篩選;C～F.抑制GRP94表達后MyoG和MHC蛋白表達量的檢測;G、H.免疫熒光檢測抑制GRP94的表達對肌管融合的影響

綜上,GRP94的激活或抑制能促進或阻礙牛MDSCs分化。因此,GRP94對牛MDSCs分化具有正向調控作用。

2.3 PI3K/AKT/mTOR信號通路對牛MDSCs分化的影響

2.3.1抑制PI3K對牛MDSCs分化的影響 由于PI3K信號通路對牛MDSCs分化的影響并不明確,本試驗在牛MDSCs分化過程中添加PI3K抑制劑LY294002后檢測細胞的肌管融合率及分化標志基因的表達。Desmin免疫熒光結果如圖4,添加LY294002后肌管顯著增多(圖4A),與對照組相比肌管融合率增加27.32%(圖4B)。Western blot檢測如圖4C～H所示,添加抑制劑后,p-PI3K、p-AKT及p-mTOR的表達量均減少,但MyoG和MHC的表達上調。上述結果表明,抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路活性促進牛MDSCs分化。

A、B.免疫熒光檢測抑制PI3K的活性后對細胞分化的影響;C～H.LY294002對MyoG和MHC表達的影響

2.3.2抑制mTOR對牛MDSCs分化的影響 為了明確mTOR對牛MDSCs分化的影響,在牛MDSCs分化過程中持續添加mTOR的抑制劑Rapa。免疫熒光結果如圖5A、B所示,添加Rapa后細胞分化顯著增加,統計結果表明肌管融合率增加25.73%。Western blot結果如圖5C～F所示,p-mTOR表達量減少后,MyoG和MHC的表達上調。以上結果表明抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路促進牛MDSCs分化。

A、B.免疫熒光檢測抑制mTOR的活性后對細胞分化的影響;C～F.mTOR抑制劑Rapa對MyoG和MHC表達的影響

2.4 GRP94對P3K/AKT/mTOR信號通路的影響為了明確GRP94促進牛MDSCs分化的機制,在激活GRP94表達的同時檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路的活化。Western blot結果表明GRP94表達增加后,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表達量下調(圖6A～E);在牛MDSCs中抑制GRP94表達,p-PI3K、p-AKT及p-mTOR的表達量顯著增加(6F～J)。上述結果表明,GRP94抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路活性。

A～E.激活GRP94表達對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響;F～J.抑制GRP94表達對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響(*表示P <0.05)

因此,GRP94可能通過負調控PI3K/AKT/mTOR信號通路促進牛MDSCs分化。

3 討論

GRP94是94 kDa的葡萄糖調節蛋白,是一種廣泛存在于細胞中的分子伴侶, 在內質網中含量豐富[14]。因此GRP94在內質網應激方面的研究獲得了廣泛關注,但是其在成肌細胞分化中的作用鮮有報道。本實驗室前期研究工作表明,GRP94可以調節小鼠C2C12成肌細胞的分化,同時在小鼠肌肉損傷時表達顯著上調,提示GRP94在成肌分化中具有重要作用[8]。本研究結果表明,GRP94的表達隨著牛MDSCs的分化而逐漸升高,其對牛MDSCs的分化具有正向調控作用。

本試驗采用CRISPR/dCas9基因編輯系統激活或抑制牛MDSCs分化過程中GRP94的表達。針對GRP94基因啟動子序列特點設計并構建了3個sgRNA表達載體(pSPgRNA-B1、pSPgRNA-B2和pSPgRNA-B3),分別通過與dCas9和VPR載體共轉染,實現對GRP94的干擾或激活。采用CRISPR技術對目標基因表達的調控具有高效性,已經被廣泛應用于基因編輯領域[15-16]。本研究設計了多個sgRNA干擾片段,以防止脫靶效應,最終高效激活或抑制GRP94的表達,以明確功能基因GRP94在MDSCs分化中的表達。為肉牛肉質改良及育種提供理論依據。

目前,對于PI3K/AKT/mTOR信號通路的研究主要聚焦于其在癌細胞增殖過程中的作用,其可能為癌細胞藥物作用的靶標。此外,亦有研究表明PI3K/AKT/mTOR信號通路在體內促進小鼠成肌分化[17]。本試驗通過向牛MDSCs中添加PI3K和mTOR的抑制劑表明,抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路促進牛MDSCs分化,這與本實驗室之前發表研究一致[18]。這與PI3K/AKT/mTOR能夠正向調控小鼠成肌細胞分化的報道不一致。推測其可能是由于物種的差異或者是體內、體外環境的不一致所致。因此,PI3K/AKT/mTOR信號通路對于成肌分化的調節作用亟待深入挖掘。

在許多類型的癌細胞研究中表明,GRP94通過PI3K/AKT信號通路發揮作用[19-20]。但沒有明確GRP94對PI3K/AKT/mTOR信號通路的作用,并且GRP94如何通過PI3K/AKT/mTOR信號通路促進牛MDSCs分化的機制并不明確。GRP94作為分子伴侶,能幫助多種受體蛋白折疊、分泌及運輸。前期研究表明其可能與PIK3IP1結合并影響PIK3IP1的表達(未發表數據),而PIK3IP1作為PI3K的負調節因子,推測其通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路促進牛MDSCs分化。因此,GRP94通過負調控PI3K/AKT/mTOR信號通路促進牛MDSCs分化,其機制亟待進一步研究。該機制的明確不僅能夠闡明GRP94調控牛成肌分化的新機制,也為肉牛育種及肉質改善提供新的思路。