右美托咪定對腹腔鏡氣腹致大鼠腸損傷的影響

張暖暖,寧夏青,艾麗平,孫 晨,張士霞

(河北農業大學 動物醫學學院,河北 保定 071000)

自1987年法國首次在電視腹腔鏡下成功完成了世界首例膽囊切除術以來[1],隨著實驗設備的迅速發展以及腹腔鏡手術具有對機體損傷小、術后恢復快和傷口美觀的優點,其在獸醫臨床上的應用逐步普及起來。腹腔鏡手術中常用到的氣體為CO2,CO2氣體充入腹腔使腹內壓升高,保持一定壓力在封閉的腹腔內造成一種類似腹腔室隔綜合征的現象,其對臟器的影響不容忽視。小腸微循環是末梢循環,對神經-體液調節極其敏感,CO2氣腹引起腹內壓的升高可使小腸黏膜的血流量減少,而氣腹解除后小腸黏膜的灌注及供氧增加,引起小腸黏膜缺血再灌注。研究發現,CO2氣腹引起的腸道損傷可能與炎癥反應[2]和氧化應激引起的腸黏膜屏障功能損傷有關[3]。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是臨床麻醉中常用的一種藥物,近年來研究顯示,DEX在一定程度上可以減少各臟器的缺血再灌注損傷,對各臟器有顯著的保護作用[4]。大量試驗表明DEX可從緩解氧化應激、抑制炎性反應、減少細胞凋亡等多方面減少臟器損傷,但其對腹腔鏡氣腹所致腸損傷的預防保護機制還不是很清楚。因此,本研究旨在探討DEX預處理對腹腔鏡所致腸損傷的保護作用,并從氧化應激和炎性反應探討其作用機制,為減輕獸醫臨床上腹腔鏡手術引發的機體損傷提供新的干預方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑Sprang-Dawley(SD)大鼠購自北京斯貝福生物技術有限公司;鹽酸右美托咪定由上海源葉生物技術有限公司提供;總蛋白定量測定試劑盒、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;大鼠白細胞介素-6(IL-6)、大鼠白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒由北京冬歌博業生物技術有限公司提供;TransZol Up Plus RNA Kit由北京全式金生物技術股份有限公司提供;PrieScript RT Master Mix試劑盒、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒由寶生物工程(大連)有限公司提供;β-actin一抗、HO-1一抗、Nrf2一抗、IKBα一抗、NF-κB一抗由沈陽萬類生物科技有限公司提供,辣根過氧化物酶標記的二抗由北京中杉金橋生物技術有限公司提供;其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2 分組與處理8周齡250～300 g SD大鼠,飼喂標準化大鼠鼠糧,飲水不限,飼養環境溫度、濕度穩定。18只大鼠隨機平均分為3組:假手術組(Sham)、CO2氣腹組(CO2)、DEX預處理組(DEX)。CO2和DEX組氣腹前30 min大鼠腹腔分別注射生理鹽水(1 mL/kg)和DEX(50 μg/kg),氣腹時對大鼠進行呼吸麻醉,待大鼠完全麻醉后將氣腹針刺入大鼠腹腔后在2 kPa(15 mmHg)壓力下維持90 min;Sham組除不給予腹腔壓力外,其余操作同CO2組。氣腹結束后6 h將大鼠在玻璃罩中呼吸麻醉后,處死大鼠并取回盲瓣以上2 cm處的回腸組織,一部分放入10%甲醛固定液中,用于病理切片制作;其余部分置于-80℃超低溫冰箱用于后續試驗的檢測。

1.3 小腸組織病理形態學觀察小腸組織于10%甲醛固定液中固定48 h后取出修剪成合適大小,流水沖洗24 h后,依次放入70%,80%,90%,95%,100%酒精中適當時間進行脫水,依次經過二甲苯透明、浸蠟、包埋處理、切片,HE染色后在光學顯微鏡下觀察小腸組織形態并拍照評估損傷程度。

1.4 小腸氧化應激指標檢測取-80℃超低溫冰箱凍存的小腸組織0.1 g,按照1∶9的比例加入900 μL生理鹽水后在勻漿機中制備10%的組織勻漿,4℃、2 500 r/min離心10 min,取上清,采用BCA法測定勻漿蛋白濃度,嚴格按照試劑盒注意事項和步驟測定小腸組織中MDA、GSH的含量變化。

1.5 小腸炎癥水平檢測小腸組織中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平用ELISA試劑盒雙抗夾心法進行檢測。具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。同1.4測定大鼠小腸勻漿中蛋白濃度后,按照試劑盒說明檢測MPO的活力。

1.6 小腸緊密連接蛋白相關基因 mRNA的檢測采用實時熒光定量法測定緊密連接基因ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA的相對表達。按照TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒說明書提取小腸組織總RNA。按照PrieScript RT Master Mix試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。按照TB GreenRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明用LightCyclerR96儀器進行實時熒光定量PCR。擴增條件:95℃ 30 s預變性;95℃ 5 s變性,60℃ 30 s退火延伸,40個循環。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成(表1)。采用2-△△Ct方法分析相關mRNA的相對表達量。

表1 基因序列

1.7 小腸組織相關蛋白表達的檢測采用Western blot檢測小腸組織HO-1、Nrf2、IKBα和NF-κB蛋白的相對表達量。取小腸組織100 mg加入900 μL RIPA裂解液提取組織蛋白,BCA法檢測蛋白濃度并調節蛋白濃度為一致后,水浴10 min使蛋白變性。選擇合適濃度的SDS-PAGE膠電泳分離蛋白,電泳結束電轉至NC膜,37℃封閉1 h,β-actin(1∶500)、HO-1(1∶500)、Nrf2(1∶500)、IKBα(1∶500)、NF-κB(1∶500)孵育一抗并4℃過夜,洗膜后按1∶6 000孵育二抗,再次洗膜后用ECL發光液進行化學發光,最后用Image J軟件掃灰度值并數據分析。

2 結果

2.1 大鼠小腸病理學形態觀察結果小腸光學顯微鏡觀察結果顯示,Sham組(圖1A)小腸上皮細胞形態正常,腸絨毛排列緊密有規則;CO2組(圖1B)腸黏膜上皮細胞完整性被破壞,組織結構紊亂,腺體受損,腸絨毛嚴重變形界限模糊且伴有炎性細胞浸潤現象; DEX組(圖1C)小腸上皮細胞少量腺體受損,腸絨毛排列雜亂僅部分脫落,整體損傷程度較CO2組有所緩解。

A.Sham組;B.CO2組;C.DEX組

2.2 小腸氧化應激指標水平變化小腸氧化應激指標測定結果顯示,與Sham組相比,CO2組MDA含量極顯著升高(P<0.01),DEX組MDA含量顯著升高(P<0.05);與CO2組相比,DEX組MDA含量極顯著下降(P<0.01)(圖2A)。與Sham組相比,CO2和DEX組GSH含量極顯著降低(P<0.01);與CO2組相比,DEX組GSH含量極顯著升高(P<0.01)(圖2B)。

A.大鼠小腸組織中MDA含量;B.大鼠小腸組織中GSH含量

2.3 小腸炎癥因子水平變化小腸炎癥水平測定結果顯示,與Sham組相比,CO2組小腸組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平和MPO活力均極顯著升高(P<0.01),DEX組IL-6水平顯著升高(P<0.05),IL-1β、TNF-α水平和MPO活力均極顯著升高(P<0.01);與CO2組相比,DEX組IL-6、IL-1β、TNF-α水平和MPO活力均極顯著降低(P<0.01)(圖3)。

A.小腸組織IL-6水平;B.小腸組織IL-1β水平;C.小腸組織TNF-α水平;D.小腸組織MPO活力

2.4 小腸緊密連接蛋白相關基因的變化小腸緊密連接蛋白相關基因mRNA測定結果顯示,與Sham組相比,CO2和DEX組小腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA相對表達量均極顯著降低(P<0.01);與CO2組相比,DEX組ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA相對表達量均極顯著升高(P<0.01)(圖4)。

A.小腸組織ZO-1 mRNA的表達;B.小腸組織Claudin-1 mRNA的表達;C.小腸組織Occludin mRNA的表達

2.5 小腸相關蛋白相對表達量的變化Western blot結果表明,與Sham組相比,CO2組小腸組織HO-1、Nrf2、IKBα和NF-κB蛋白表達量均極顯著升高(P<0.01),DEX組HO-1、Nrf2蛋白表達量極顯著升高(P<0.01),IKBα蛋白表達量極顯著升高(P<0.01),NF-κB蛋白表達量顯著升高(P<0.05);與CO2組相比,DEX組HO-1、Nrf2蛋白表達量進一步極顯著升高(P<0.01),IKBα蛋白表達量極顯著降低(P<0.01),NF-κB蛋白表達量顯著降低(P<0.05)(圖5)。

3 討論

腸黏膜屏障由機械屏障、生物屏障、化學屏障和免疫屏障組成,是一個極其復雜的體系,能夠保護機體免受外來細菌毒素的入侵。其中腸黏膜機械屏障也稱為物理屏障,作為腸道的第一道防線,在維持腸道正常生理功能中發揮著不可或缺的作用。有研究發現,CO2氣腹可導致腸黏膜屏障受損,發生細菌易位,繼而導致其他遠隔器官受損。腸上皮細胞及其緊密連接是腸黏膜機械屏障的主要組成部分。ZO-1、Claudin-1和Occludin是胃腸道中緊密連接的3個關鍵蛋白[5],成為了近年來腸黏膜屏障的研究熱點,并發現其在腸道中很多至關重要的作用。本試驗顯示CO2氣腹可導致小腸上皮細胞完整性被破壞,且有炎性細胞浸潤現象,小腸緊密連接蛋白 ZO-1、Claudin-1和Occludin mRNA的相對表達量極顯著降低,而DEX預處理后的mRNA的相對表達量均顯著回升,該結果說明CO2氣腹破環了小腸機械屏障,且DEX預處理可有效調節小腸上皮柱狀細胞的規則排列,使上皮細胞緊密連接蛋白的正常表達,達到保護小腸發揮其正常生理功能的效果。

腸黏膜機械屏障功能導致損傷可引起腸道有害細菌和內毒素入侵并引起機體一系列的病理反應,如機體氧化應激以及其他病理狀態等。Nrf2作為一種重要的內源性抗氧化應激調控因子,可誘導其下游調控基因血紅素加氧酶-1(HO-1)等抗氧化酶的表達增加[6],此誘導表達近年來被認為是細胞內最重要的抗氧應激化機制之一[7],Nrf2和HO-1的表達變化可引起其下游氧化應激指標ROS、SOD、MDA等的表達變化[8]。MDA是脂質過氧化反應的終產物,常作為衡量組織氧化應激損傷程度的指標之一[9]。HO-1是Nrf2的靶基因,能夠誘導血紅素以及活性氧(ROS)還原而抑制氧化應激。大量試驗表明[10-13],腹腔鏡氣腹過程中會引起機體的氧化應激反應并產生大量的ROS,激活氧自由基和抗氧化物信號。而谷胱甘肽(GSH)在腸道內含量豐富,是小腸抗氧化系統的關鍵還原劑[14],腸道的抗氧化能力可由其含量變化直接反應。與張蕾等[15]、張建濤等[13]研究結果一致,本試驗結果顯示,CO2組小腸組織中Nrf2和HO-1蛋白表達極顯著升高,表明腹腔鏡氣腹引起了大鼠小腸的抗氧化應激反應,使MDA含量升高、GSH含量降低,引起大鼠小腸嚴重的氧化應激,DEX預處理后小腸組織中Nrf2和HO-1蛋白表達進一步升高,MDA含量降低、GSH含量回升,小腸氧化應激損傷得到明顯改善,說明CO2氣腹可激活Nrf2/HO-1通路,DEX可通過減輕小腸氧化應激從而達到保護機體的作用。

此外,HO-1能夠抑制NF-κB 表達與活化,從而間接抑制機體炎癥反應[16]。NF-κB作為重要的基因轉錄因子之一,隨著其結構和功能的研究不斷深入,發現NF-κB信號轉導途徑的激活是引發腸道炎癥的關鍵環節[17]。氣腹引起的缺血再灌注過程可導致組織內皮細胞損傷[18],并會誘發一系列的炎癥級聯反應,進一步刺激趨化因子和炎癥介質的分泌[19]。NF-κB通路中的3個關鍵因子為IKKβ、IKBα和NF-κB。NF-κB未被激活時與IkB相結合形成三聚體位于細胞質中,在某些刺激因素作用下NF-κB與IkB解離,導致NF-κB的過度激活,被激活后可調節基因的轉錄,進而促進各種炎癥因子的產生,如TNF-α、白細胞介素(interleukin,IL)系列、急性期反應蛋白等[20]。王杏等[21]的研究發現當細胞受到刺激時可激活IKKβ,經一系列反應導致IKBα泛素化,NF-κB游離,細胞核內NF-κB增多,啟動下游炎癥反應和下游通路。很多研究表明,NF-κB均參與到缺血再灌注引起的機體損傷中[13,22]。因此,氣腹引起的機體炎性反應不可忽視。MPO作為中性粒細胞的激活標志和功能標志,其活性變化可反映嗜中性多形核白細胞(PMN)的功能和活性狀態。研究顯示,MPO的活性與中性粒細胞計數之間存在極顯著相關性,可間接反應組織的局部炎癥和損傷程度[23]。王永東等[24]、陳亞萍等[25]的研究發現DEX均可通過抑制炎性反應達到保護腸黏膜的作用。本試驗顯示CO2組腸組織IKBα和NF-κB蛋白表達升高,IL-6、IL-1β、TNF-α水平和MPO活力均升高,DEX預處理后分別不同程度上減輕以上因子的表達,提示DEX可能通過NF-κB信號通路減緩氣腹導致的腸炎性損傷。

綜上所述,CO2氣腹能引起小腸發生氧化應激、炎性反應進而引起小腸黏膜機械屏障損傷,DEX能通過降低機體氧化應激、減輕炎癥因子的釋放、改變緊密連接蛋白基因的表達等途徑緩解氣腹對機體的損傷,其減輕損傷的機制可能與NK-κB信號通路及Nrf2/HO-1通路有關。