高壓熱殺菌處理結合溶菌酶對枯草桿菌芽孢的滅活動力學研究

王旭娟,劉月,李佳佳,武思睿,王傳發,辛偉山,章中

(寧夏大學 食品與葡萄酒學院,寧夏回族自治區 銀川,750021)

芽孢是細菌營養體在特殊條件下形成的休眠態,對食物有致腐敗作用[1]。因此如何高效地殺滅芽孢是食品殺菌領域中的一個研究熱點。

高壓熱殺菌處理(high-pressure thermal sterilization, HPTS)是一種新型殺菌技術,由超高壓(400～900 MPa)和中溫(50～90 ℃)協同處理,能更好地滅活芽孢[2]。溶菌酶作為食品添加劑,對各類食品中的微生物有抑制和滅活作用[3]。研究表明,超高壓與溶菌酶具有協同殺菌作用[4]。且比熱殺菌技術更好地保留了食品的營養和感官品質[5-6]。ARAS等[7]發現溶菌酶協同650 MPa、50 ℃處理對解淀粉和嗜熱芽孢殺滅作用是顯著的。

通過構建殺菌動力學模型,可以對殺菌效果進行預測,目前常用的殺菌動力學模型主要有一級動力學模型和Weibull模型[8]。RAMASWAMY等[9]在研究HPTS殺滅梭狀桿菌芽孢時發現一級動力學模型能很好地擬合其滅活動力學曲線,郭全友等[10]在研究枯草桿菌芽孢在熱、Nisin和ε-聚賴氨酸處理下的滅活動力學時,發現Weibull模型能很好擬合其失活過程,而線性模型難以描述其失活動力學。目前關于HPTS結合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢的動力學尚無研究報道。

芽孢內膜具有高度不通透性,是保護芽孢的一層關鍵結構[11],內膜的損傷和變化是引起芽孢死亡的主要原因[12-13]。當內膜受損時,細胞的內容物會泄漏到膜外,如一些大分子核酸和蛋白。通常用OD600值來表征芽孢內容物釋放量[14],用OD260值和OD280值分別表征核酸與蛋白物泄漏情況[15]。探討芽孢滅活量與芽孢懸浮液OD600、OD260、OD280值之間的相關性可用于快速估計殺菌效果[16],但目前尚無相關研究報道。

本文研究了HPTS結合溶菌酶對枯草桿菌芽孢的滅活動力學并探討了芽孢滅活量與芽孢懸浮液OD600、OD260、OD280值之間的相關性,可為HPTS結合溶菌酶在食品殺菌技術中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),中國普通微生物菌種保藏管理中心;營養瓊脂,廣東環凱微生物科技有限公司;硫酸錳,江蘇源之源生物科技有限公司;溶菌酶,北京索萊寶科技有限公司;TSA-YE培養基,上海研生生化試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BXM-30R型高壓滅菌鍋,上海博迅醫療生物儀器股份有限公司;TGL-10B型離心機,上海安亭科學儀器廠;754PC紫外可見分光光度計,西安華辰樂天實驗室設備有限公司;DZ-500/2G型落地式真空包裝機,西安星火包裝機械有限公司;LRH-250型生化培養箱,青島明博環?？萍加邢薰?UV-9000S型雙光束紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司;超高壓設備,包頭科發高壓科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 枯草桿菌芽孢懸浮液的制備

參考劉月[17]的方法并稍加改進來制備枯草桿菌的菌懸液。將活化3代的枯草桿菌芽孢劃線接種至斜面培養,37 ℃培養7 d,用無菌水洗滌芽孢并收集于離心管中,在4 ℃、9 000 r/min、15 min的條件下洗滌芽孢3次,將其濃度調整為約1.5×109CFU/mL,4 ℃保存。使用前調節芽孢懸浮液濃度為1.5×108CFU/mL。

1.3.2 HPTS結合溶菌酶處理

將一定量的枯草桿菌芽孢懸浮液加入到離心管中,離心15 min(4 ℃、9 000 r/min),棄去上清液,加入配制好的同等體積溶菌酶溶液(質量分數0.05%、0.10%、0.30%),充分振蕩接觸。用無菌聚乙烯真空袋將處理后的芽孢懸浮液真空包裝,放入超高壓加壓釜中。設定壓力為600 MPa,處理溫度為65、75 ℃,保壓時間分別為5、10、15、20、25 min?？紤]到升壓時每100 MPa水的升溫約3 ℃,在進行600 MPa-65 ℃、600 MPa-75 ℃處理前,對高壓處理腔內水的溫度進行預調控,600 MPa-65 ℃處理前用水浴夾套將腔內水預熱到50 ℃左右,600 MPa-75 ℃處理前用水浴夾套將腔內水預熱到60 ℃左右;然后進行升壓處理,升壓到600 MPa,此時實際處理溫度在64～66 ℃、74～76 ℃;在保壓過程中高壓處理腔外的恒溫水浴夾套仍進行工作,以使得高壓處理腔內的溫度維持在一個較穩定的水平。采用計算機控制壓力、時間和溫度。在加壓過程中,K型熱電偶測量高壓處理腔中水的溫度。卸壓后冷卻,隨即放入4 ℃冰箱保存。

1.3.3 平板計數

參照MENG等[18]的方法進行平板計數。將處理前后的菌懸液梯度稀釋,并將1 mL的稀釋菌液和15～20 mL的TSA-YE注入培養皿中,37 ℃下恒溫培養48 h,對存活的芽孢進行計數。計數時,取3個相同稀釋度的平均值。

1.3.4 動力學模型及模型擬合度比較

本實驗所用HPTS設備升壓到600 MPa約需3 min,為排除升壓過程對實驗結果的干擾。我們首先做了升壓到600 MPa后立即泄壓的實驗,測定升壓過程對樣品的菌落總數、OD600、OD260和OD280值的影響,后續實驗結果均先減除了升壓過程的影響,然后進行動力學模型擬合和相關性分析。

1.3.4.1 一級動力學模型

該模型表示芽孢的滅活量和處理時間的變化是一種線性關系[19],其表達式如公式(1)所示:

(1)

式中:N0,初始芽孢的數量,CFU/mL;Nt,處理t時間后芽孢的存活數量,CFU/mL;D,滅活90%的芽孢所需的時間,min;t,處理時間,min。

1.3.4.2 Weibull一級動力學模型

Weibull模型是一種用于描述各種線性和凹凸型曲線的非線性模型[20]。其表達式如公式(2)所示:

(2)

式中:N0,初始芽孢菌落數量;Nt,時間t時芽孢的菌落數量;b,比例因子;n,形狀系數;t,時間。

1.3.4.3 動力學模型擬合度比較

用決定系數R2、準確因子Af、偏差因子Bf、均方根誤差(root mean square error, RMSE)等相關評估指標對模型擬合度進行評估。R2為實測值與預測值進行線性擬合得到的回歸系數。其中,精確因子Af為實測值與預測值之間的一致性,偏差因子Bf代表實測值與預期值偏差的程度,RMSE描述模型的可靠程度。研究表明,決定系數R2越大,RMSE越小,Af越小且Bf越接近1,模型的擬合度愈好[21-22];公式(3)～公式(5)為Af、Bf、RMSE的計算方法:

(3)

(4)

(5)

式中:n為試驗次數。

1.3.5 OD600值的測定

將芽孢懸浮液振蕩均勻,在600 nm波長處測定處理前后枯草桿菌芽孢懸浮液的吸光度[23]。

1.3.6 紫外吸收物質泄漏量的測定

將處理前后的芽孢懸浮液于4 ℃、9 000 r/min離心15 min,上清液為工作液,以無菌水為空白對照測定260 nm波長(核酸)和280 nm波長(蛋白質)處的吸光度[24]。

1.4 數據處理與分析

用均值±標準誤差表示實驗結果。采用SPSS 26.0軟件進行方差分析,P<0.05為顯著差異的標準。采用Origin 2019.0軟件進行統計分析并作圖。所有實驗至少重復3次。

2 結果與分析

2.1 HPTS結合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢效果分析

圖1為不同條件下的HPTS結合溶菌酶對枯草桿菌芽孢滅活效果的關系曲線。由圖1可知,在600 MPa-65 ℃下,處理時間為5、10、15、20、25 min時,枯草桿菌芽孢的滅活量分別為1.06、2.17、2.90、3.28、3.43 lg CFU/mL,保持溫壓不變,600 MPa-65 ℃-25 min相較于600 MPa-65 ℃-5 min芽孢滅活量高2.37 lg CFU/mL。當保壓時間為25 min時,在600 MPa-75 ℃下,芽孢的滅活量為5.14 lg CFU/mL,比600 MPa-65 ℃高1.71 lg CFU/mL,表明在一定的壓力和保壓時間下,溫度升高能促進芽孢失活。在600 MPa-65 ℃-0.05%溶菌酶處理5～25 min后,枯草桿菌芽孢的滅活量分別為1.28、2.38、2.91、3.68、3.96 lg CFU/mL,在相同溫壓和處理時間下,經過0.30%溶菌酶處理后,其滅活量分別增加至1.67、3.06、4.11、4.44、4.83 lg CFU/mL,表明提高溶菌酶的濃度,進一步增強對枯草桿菌芽孢的滅活作用。在600 MPa-75 ℃-0.30%溶菌酶處理5～25 min后,枯草桿菌芽孢的滅活量分別增加至2.44、4.41、5.68、6.09、6.36 lg CFU/mL,相較于600 MPa-65 ℃-0.30%溶菌酶處理芽孢的滅活量分別提高了0.77、1.35、1.57、1.65、1.53 lg CFU/mL?？傮w上,滅活曲線呈現由快到慢的降低速率,表明芽孢的滅活率隨保壓時間的增加而降低,芽孢滅活曲線出現拖尾現象,研究發現拖尾現象可能是由于部分芽孢具有極強的抗性[25-26]。

a-未添加溶菌酶;b-0.05%溶菌酶;c-0.10%溶菌酶;d-0.30%溶菌酶圖1 不同條件下HPTS結合溶菌酶對枯草桿菌芽孢的滅活效果Fig.1 Inactivation effect of HPTS combining with lysozyme on Bacillus subtilis spores under different conditions

2.2 動力學模型擬合度分析

一級動力學模型與Weibull模型的模型參數和模型評價參數如表1、表2所示。用決定系數R2、準確因子Af、偏差因子Bf、RMSE等相關評估指標對模型擬合度進行評價[27]。

表1 不同處理條件下一級動力學、Weibull模型的模型參數Table 1 Model parameters of the-first order kinetic and Weibull models under various treatment conditions

表2 一級動力學模型和Weibull模型評價參數Table 2 The-first order kinetic model and Weibull model evaluation parameters

在本研究中,一級動力學模型的平均決定系數R2=0.875,Af為1.16～1.28,Bf為0.48～0.91,RMSE為0.46～1.17;Weibull模型的平均決定系數R2=0.972,Af為1.05～1.11,Bf為1.02～1.04,RMSE為0.14～0.48。與一級動力學模型相比,Weibull模型的RMSE更小,Af更小,Bf和R2更接近1,Weibull模型對于HPTS結合溶菌酶處理下枯草桿菌芽孢的滅活情況的擬合更可靠。WANG等[28]研究表明Weibull模型對70、80 ℃的溫度協同400～600 MPa處理下凝結芽孢桿菌芽孢滅活曲線的擬合效果更佳。COLLADO等[29]在研究高溫對蠟樣芽孢桿菌滅活動力學時也發現Weibull模型可較好描述滅活動力學過程。VAN BOEKEL[30]對55組微生物的熱失活動力學模型進行了研究,結果發現僅有2條符合一級動力學模型,而大部分的存活曲線呈非線性的凹形,Weibull模型可用于擬合非線性滅活曲線。

2.3 模型的驗證

實測值和預測值的一致性可用來衡量模型的可靠性,常用線性擬合得到的決定系數R2來表征。擬合方程的截距越靠近0,且斜率越接近1,實測值和預測值的一致性越高。如圖2所示,Weibull模型的決定系數R2為0.964,截距為-0.215,斜率為0.945;一級動力學模型的決定系數R2為0.848,截距為0.742,斜率為1.10。Weibull模型對HPTS結合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢效果的動力學擬合效果更好。

a-一級動力學模型;b-Weibull模型圖2 一級動力學模型與Weibull模型預測值和實測值的相關性Fig.2 Correlation between predicted and measured values of the-first order kinetic model and Weibull model

2.4 HPTS結合溶菌酶處理對芽孢懸浮液OD600值的影響

通過測定樣品在600 nm處的吸光度來確定芽孢的內容物釋放量。芽孢懸浮液的OD600值與其折光性相關,芽孢量釋放量越大,其折射性越低,吸光度值越小[31-32]。圖3為HPTS結合溶菌酶處理后枯草桿菌芽孢樣品OD600值的變化情況。

a-600 MPa-65 ℃;b-600 MPa-75 ℃圖3 不同處理時間下HPTS結合溶菌酶處理后 OD600值的變化曲線Fig.3 Change cures of OD600 treated by HPTS combining with lysozyme under different time conditions

如圖3所示,15 min前的OD600值曲線比較陡,表明吸光度值快速下降,15 min后的吸光度值下降緩慢。在HPTS結合溶菌酶處理下,隨著保壓時間從5 min到25 min,OD600值均下降,表明延長保壓時間可以促進芽孢內容物釋放。當處理時間為25 min,600 MPa-65 ℃下OD600值為0.65,600 MPa-75 ℃下的OD600值為0.50,升高溫度其OD600值變小,表明升高溫度可以促進內容物釋放。在600 MPa-75 ℃-25 min下,當溶菌酶質量分數為0.05%、0.10%、0.30%時,OD600值分別為0.44、0.40、0.38,表明隨著溶菌酶濃度的增大,內容的物釋放量也隨之升高。

2.5 HPTS結合溶菌酶處理對紫外吸收物質泄漏的影響

細菌在經過滅菌后,往往細胞中的物質會泄漏,所以常以紫外線吸收物質的泄漏來反映細胞的損害程度。通過測定樣品在260 nm/280 nm處的紫外吸收強度來確定芽孢的核酸、蛋白質泄漏量。圖4為HPTS結合溶菌酶處理后枯草桿菌芽孢樣品OD260值和OD280值的變化情況。

a-600 MPa-65 ℃ OD260值;b、d-600 MPa-75 ℃ OD260值;c-600 MPa-65 ℃ OD280值;d-600 MPa-75 ℃ OD280值圖4 不同處理時間下HPTS結合溶菌酶處理后OD260、OD280值的變化曲線Fig.4 Change cures of OD260, OD280 treated by HPTS combining with lysozyme under different time conditions

如圖4所示,在HPTS與溶菌酶協同作用下,枯草桿菌芽孢的OD260、OD280值均隨保壓時間的延長而升高,表明芽孢的紫外線吸收物質泄漏量有所增大。在600 MPa-75 ℃-25 min下,溶菌酶質量分數由0.05%升高至0.30%,OD260值分別為0.48、0.51、0.54,OD280值分別為0.44、0.46、0.47,表明在一定的保壓時間下,紫外吸收物質的泄漏量隨溶菌酶濃度的提高而增大。

2.6 相關性分析

如表3所示,芽孢滅活量與芽孢懸浮液OD600值之間呈極顯著負相關(P<0.01),相關系數為-0.972,與核酸及蛋白泄漏量之間呈極顯著正相關(P<0.01),相關系數分別為0.828、0.848,表明在芽孢滅活量增加的同時,OD600值降低,芽孢內容物釋放量增加,且紫外吸收物質泄漏量隨其滅活量的增加而增大。但芽孢懸浮液OD600值與芽孢滅活量之間的相關性更顯著,可以更好地預測芽孢的滅活量。這是因為雖然核酸和蛋白質在260、280 nm波長處有最大的吸收峰,但是其他物質也可能在此處有吸收峰,從而產生干擾。另一方面溶菌酶本身也是蛋白質,在280 nm波長處也存在吸收峰,也會對結果產生干擾。以上原因使芽孢滅活量與OD260、OD280值相關性降低。

表3 芽孢滅活量與各指標的皮爾遜相關性分析結果Table 3 Pearson correlation analysis results of Bacillus subtilis spore inactivation and each index

3 結論

HPTS結合溶菌酶能更好地滅活枯草桿菌芽孢。Weibull模型對殺菌曲線的動力學擬合效果優于一級動力學模型。Weibull模型的參數n值均小于1,失活曲線出現明顯拖尾現象,芽孢殺菌抗性存在異質性,有小部分芽孢的殺菌抗性更強。隨著殺菌處理時間的延長,芽孢懸浮液OD600、OD260、OD280值也不斷變化,統計分析結果表明芽孢懸浮液OD600、OD260、OD280值與芽孢滅活量之間都呈極顯著相關,但芽孢懸浮液OD600值與芽孢滅活量之間的相關性更顯著,芽孢懸浮液OD600值簡單易測,可快速準確地預測殺菌效果。本文可為HPTS結合溶菌酶在食品殺菌中的應用提供參考。