適合鮮食葡萄釀酒的酵母篩選及其發酵特性研究

劉帥,王志磊,周世斌,袁春龍,3*

1(西北農林科技大學 葡萄酒學院,陜西 楊凌,712100)2(留壩縣農村經濟發展與監督服務中心,陜西 漢中,724100) 3(西北農林科技大學合陽葡萄試驗示范站,陜西 渭南,714000)

根據國際葡萄與葡萄酒組織2021年的統計數據顯示,世界葡萄產量為7 474.8萬t,其中鮮食葡萄占比43.3%。鮮食葡萄產量增長1.5%,但世界鮮食葡萄消費量仍然低于產量。同在陜西省據果業局統計公報顯示,2021年陜西省鮮食葡萄產量為85.15萬t,相比去年增長了5.5%。鮮食葡萄產量不斷上漲,已出現季節性供大于求的趨勢[1],為解決生產相對過剩的問題,需要進行葡萄的深加工來提高產品附加值,葡萄酒釀造就是其中一種,但目前在鮮食葡萄釀酒方面的研究較少[2-4],很難實現產品的增值增效。而且國內大多數消費者對于干型紅葡萄酒的口感接受度不高,為此很多人選擇鮮食葡萄進行家庭釀造葡萄酒。

葡萄酒的品質受到葡萄品種[5]、氣候和栽培方式[6]、釀造工藝[7-8]、酵母[9-10]等多種因素的影響。而對于鮮食葡萄而言,原料方面存在皮薄、肉質堅硬、出汁率低、含糖量不高的缺陷[11],目前使用的鮮食葡萄的釀造工藝,容易引起葡萄酒微生物污染、甲醇超標、顏色較淺、高級醇含量高、口感寡淡等問題[12-13]。因此,需要對鮮食葡萄釀酒的關鍵工藝技術進行系統的研究,而鮮食葡萄發酵菌種的篩選就是其中重要的環節之一。鮮食葡萄釀酒缺乏專用酵母菌,這是鮮食葡萄酒品質較差的重要原因之一。要獲得品質優秀、具有鮮食葡萄特色的葡萄酒,篩選合適的酵母菌十分重要[14]。目前針對鮮食葡萄釀酒的酵母種類較少,使得鮮食葡萄酒失去了特征,無法展現鮮食葡萄酒的特點[15]。

因此,本實驗選取陜西主栽品種之一的“戶太8號”為原料,進行鮮食葡萄自然發酵過程中酵母的分離篩選,以期獲得適合鮮食葡萄釀造的菌株,增加家庭釀造葡萄酒的多樣性。從商業酵母和專用酵母兩方面對比篩選,對未來鮮食葡萄酵母篩選研究方向提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 葡萄原料

戶太8號,采自陜西省西安市鄠邑區崔家灣村(東經108.6,北緯34.1),采收時間為2020年10月,原料含糖量170 g/L,可滴定酸含量為3.60 g/L(以酒石酸計)。

1.1.2 商業酵母

釀酒酵母SY,安琪酵母股份有限公司;釀酒酵母ST,法國Laffort公司;釀酒酵母LA-PE,法國OENOFRANCE公司;釀酒酵母EC1118,法國Lallemand公司。

1.1.3 培養基

YPD培養基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,瓊脂20(固體培養基加入);WL培養基,北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Cary-60紫外-可見分光光度計,安捷倫科技(中國)有限公司;FTIR Lyza 5000 Wine葡萄酒分析儀,奧地利Anton Paar公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌種分離鑒定

取自然發酵過程中5個時期(除梗破碎后Z1、酒精發酵前期Z2、中期Z3、后期Z4和末期Z5)的葡萄酒樣1 mL進行梯度稀釋(10-3、10-4、10-5),均勻涂布在WL培養基上28 ℃恒溫培養48 h。隨機挑取單菌落,多次劃線純化,并接種單菌落于YPD液體培養基中活化24 h,之后劃線接種于WL鑒別培養基上,于28 ℃培養48 h,進行初步歸類[16]。

將酵母菌菌種委托深圳華大基因股份有限公司鑒定。在離心管中加入200 μL預處理液與適量菌樣品,充分研磨。再加入20 μL Proteinase K溶液,混勻,37 ℃放置30～60 min。加入200 μL裂解液,混勻,70 ℃放置10 min。加200 μL無水乙醇,混勻,短離心。過吸附柱室溫放置5～10 min。向吸附膜中間位置懸空滴加50～100 μL ddH2O,室溫放置5～10 min,12 000 r/min離心2 min,收集溶液于離心管中。16S/18S擴增后進行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測,觀察條帶性狀并按照磁珠純化標準,上機檢測。并將測序結果進行NCBI-BLAST比對。

1.3.2 酵母一級篩選

將分離純化得到的酵母菌株活化2 d,至其活性高度旺盛期,接入放有倒置杜氏管的YPD液體培養基中,28 ℃恒溫培養2 d,每隔12 h觀察其產氣情況,記錄杜氏管內氣體體積[17]。篩選出起酵速度快,產氣較多的菌株,并用于二級篩選。

1.3.3 酵母二級篩選

1.3.3.1 高酒精耐受性試驗

在裝有YPD液體培養基的試管中,放入倒置的杜氏管(不含空氣)。液體培養基先于121 ℃滅菌20 min,試管中培養基冷卻至室溫,作為基礎YPD培養基。在無菌條件下加入無水乙醇,使試管中酒精含量為8%、10%、12%、14%。將一級篩選出酵母菌株活化后按2%的接種量接入培養基中,28 ℃培養2 d,每隔12 h觀測其生長狀況,判斷其酒精耐受性。以商業釀酒酵母及空白試驗作為對照。

1.3.3.2 低pH值耐受性試驗

無菌條件下用1 mol/L的鹽酸溶液分別調整YPD液體培養基的pH值為2.0、2.5、3.0、3.5。酵母菌接種與觀察方法同1.3.3.1節。

1.3.3.3 高糖耐受性試驗

無菌條件下使用葡萄糖調整YPD液體培養基的葡萄糖含量分別為20%、30%、40%、50%(質量分數)。酵母菌接種與觀察方法同1.3.3.1節。

1.3.3.4 高SO2耐受性試驗

在無菌條件下分別向YPD培養基中加入不同量的亞硫酸溶液,使培養基中SO2含量為200、250、350、450 mg/L。酵母菌接種與觀察方法同1.3.3.1節。

1.3.4 發酵性能測定

1.3.4.1 葡萄酒發酵工藝

按小容器釀造法釀造葡萄酒[18],將800 g經挑選與除梗后的戶太8號葡萄破碎為葡萄醪,裝入1 L發酵罐中,調整總糖至216 g/L。在20 ℃下,采用二級篩選獲得的酵母及4種商業酵母(SY、ST、LA-PE、EC1118),使用YPD培養基活化擴培至108CFU/mL后以5×106CFU/L的接種量接種到葡萄醪中進行發酵。

1.3.4.2 葡萄酒發酵曲線

每12 h測定發酵過程葡萄醪中還原糖的變化,并繪制發酵曲線。在發酵結束后進行皮渣分離并澄清過濾。

1.3.4.3 基本理化指標測定

葡萄酒中酒精度、可滴定酸、揮發酸、pH、甘油及總酚含量使用葡萄酒分析儀測定;葡萄酒中還原糖的含量采用菲林試劑熱滴定法測定;葡萄酒CIELab值采用葡萄酒顏色分析儀測定。所有指標均重復測定3次。

1.3.4.4 葡萄酒的感官評價

成立10人的感官品評小組,均經過專業的感官培訓。小組成員從葡萄酒外觀、香氣、口感、平衡性4個方面進行打分,得出葡萄酒的感官質量整體評價。

1.3.4.5 數據分析

采用Mircosoft EXCEL 2019軟件進行數據分析和作圖;Origin 2021軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 酵母的分離

從鮮食葡萄自然發酵過程中5個時期共分離出110株酵母菌,將其按不同時期編號劃分,除梗破碎時期、發酵前期、發酵中期及發酵后期及發酵末期編號分別為Z101～Z130、Z201～Z220、Z301～Z320、Z401～Z420、Z501～Z520,以商業酵母SY做對照。對分離出的110株酵母菌進行形態學觀察,按照其形態類型分類匯總,分為六類,如表1所示。

表1 自然發酵汁中分離的菌落形態描述Table 1 Description of colony morphology isolated from natural fermented juice

2.2 酵母種群的動態變化

從每一類菌株中挑選1～2個長勢較好的菌落進行檢測鑒定。結果顯示(圖1)從自然發酵汁中分離得到的110株酵母菌株分屬5大類,分別為畢赤酵母屬、擬威克酵母屬、釀酒酵母屬、有孢漢遜酵母屬和Starmerella屬。除梗破碎時期在鮮食葡萄醪液中的酵母種群數量最豐富,其中畢赤酵母是優勢種群,隨著酒精發酵的啟動,擬威克酵母屬和畢赤酵母屬菌株逐漸消失;在發酵過程的前、中、后期,有孢漢遜酵母和釀酒酵母是優勢種群,尤其在發酵中期只分離到了有孢漢遜酵母和釀酒酵母;隨著發酵時間的延長,釀酒酵母逐漸顯示出比有孢漢遜酵母更強的生長優勢;發酵后期,Starmerella屬酵母再次活躍;發酵末期,發酵液中分離到釀酒酵母占比最高。

圖1 五個時期的酵母種群變化Fig.1 Variations in yeast species over five periods

2.3 耐受性分析

通過產氣篩選得到了20株發酵性能好、產氣能力強的菌株。再根據耐受性實驗分析,得到4種酵母菌,耐受性強度表現如表2所示。

表2 酵母菌耐受能力對比分析表Table 2 Comparative analysis of yeast tolerance ability

隨著發酵的不斷進行,酒精度會不斷升高,不耐酒精的酵母活動會受到抑制,導致發酵提前終止[19],因此耐酒精能力反應了其酒精發酵的可持續性[20]。結果顯示6株酵母菌高酒精耐受性性能優,6株良,6株中等,菌株Z503和Z509高酒精耐受性低;釀酒前一般會添加抑菌劑,如SO2,這對酵母的SO2耐受能力提出了要求[21]。菌株的SO2耐受性,18株表現為優,菌株Z507和Z509的耐受性差。葡萄醪液是酸性環境,這需要酵母具有一定耐酸能力,pH值為3.5、3和2.5時,20株酵母菌產生氣泡的量均可充滿杜氏管,均能耐受葡萄酒的酸性環境,Z507和Z515表現更為突出。葡萄酒釀造時,糖含量一般為20%左右,因此需要篩選耐高糖的酵母。菌株高糖耐受性能,8株高糖性能優,3株良,7株中等,其中菌株Z509和Z515耐糖性極低。對于商業酵母來說,4種性能表現均為優。

最后綜合4種發酵耐受性能,篩選出了5株綜合能力較強的菌株,編號分別為Z308、Z502、Z504、Z511和Z516。

2.4 酵母菌發酵性能研究

不同酵母菌發酵葡萄酒還原糖變化見圖2。Z502起酵最慢,Z504發酵速度最慢,Z511發酵速度最快。Z502、Z511、Z516、ST、LA-PE、EC1118在108 h時還原糖含量已降至4 g/L以下,完成了酒精發酵。而Z308、Z504、SY在發酵進行120 h時完成了酒精發酵。由此可見,各酵母菌均能正常完成酒精發酵,Z502、Z511、Z516、ST、LA-PE、EC1118 6種酵母菌的完成酒精發酵的速度更快。

圖2 發酵期間不同酵母葡萄酒發酵還原糖變化曲線Fig.2 Curve of reducing sugar in wine during fermentation

2.5 不同酵母對葡萄酒理化指標的影響

如表3所示,各組成品酒的總糖均在4 g/L以下,均為干型酒,且發酵完全。每個處理組初始糖含量為216 g/L,潛在酒度為12%(體積分數),各組在實際發酵過程中,酒精度變化范圍為11.84%～12.58%。所有處理組可滴定酸含量均高于初始可滴定酸的量,SY組最高,Z511組最低。各組間揮發酸含量與pH值相差不大,且揮發酸含量均低于國家限量標準(1.2 g/L),符合國家標準。

表3 不同酵母發酵葡萄酒的主要理化指標Table 3 Main physical-chemical indexes of wines fermented by different yeasts

2.6 不同酵母對顏色的影響

CIELab顏色模型是用來描述人眼可見的所有顏色的最完備的色彩模型[22]。明亮度(L*)、紅/綠色彩通道(a*)、黃/藍色彩通道(b*)是其3個基本坐標。a*值越高代表酒樣更偏向紅色色調;b*值越高代表酒樣更偏向黃色色調;色度Cab值越大,表明酒樣色彩飽和度越高;色調角Hab通常為0°～90°,其值越大表明葡萄酒顏色越傾向紫紅色,反之則越傾向磚紅色。

測定不同酵母發酵葡萄酒酒樣的CIELab顏色參數L*、a*、b*、Cab和Hab,結果如圖3所示。9組酒樣整體明亮度均較高,均在95°以上,這與鮮食葡萄本身的特點一致;LA-PE組酒樣a*值最高,b*值最低,Hab最小,表現出更強的紅色色調。ST組b*值最高,Hab值最大,與其他組相比表現出更強的黃色色調。SY組L*值最高,a*值最低,b*值較低,Cab值最低,表明該組酒樣顏色較淺。

a-彩度;b-明度圖3 不同酵母發酵的葡萄酒彩度與明度分布圖Fig.3 Colorfulness and lightness distributions of wines fermented by different yeasts

2.7 不同酵母對感官品質的影響

根據感官品評結果對不同酵母所釀葡萄酒感官品質做定量描述分析如圖4所示。在外觀方面,LA-PE組酒樣(0.91)得分最高,SY組酒樣(0.82)得分最低,與上文中酒樣顏色分析相符合;Z308、Z516、SY3組整體表現相對較差,整體評分低于0.8;Z511在各方面表現居中,在香氣、整體平衡方面均比不上Z504;口感方面表現最好的是Z502組酒樣;Z504組在香氣、口感與整體上均評分較高。

圖4 不同酵母發酵的葡萄酒感官定量描述分析Fig.4 Sensory quantitative descriptive analysis of wines fermented by different yeasts

3 討論

葡萄酒的酒精發酵是多酵母屬、種及菌株共同參與的過程,發酵過程中的酵母菌的種類組成變化及其釀酒特性對葡萄酒的感官質量有重要貢獻[23]。本研究對戶太8號自然發酵過程的微生物進行了研究,得出了發酵過程菌種的動態變化過程。戶太8號自然發酵前期非釀酒酵母占據主導地位,而隨發酵進行到中后期釀酒酵母成為了優勢菌,這與前人研究一致[16-17]。

酵母菌選擇是葡萄酒釀造的關鍵技術之一,通過對不同酵母釀造的葡萄酒進行CIELab顏色分析得到,LA-PE組酒樣表現出最強的紅色色調,ST組最強的黃色色調,SY組酒樣的顏色較淺;從感官評價上可以發現Z502在口感上表現最好,Z504在香氣上表現最佳。由此可見采用相同葡萄原料但不同酵母發酵生產的葡萄酒,在顏色、感官質量等方面存在較大差異。

一味的使用商業活性干酵母會導致葡萄酒品質同質化,不利于葡萄酒產業的持續發展,因此需要對葡萄酒微生物進行研究推進葡萄酒差異化,突出其典型性。近年來,不少研究篩選了具有本土特色的酵母菌株,并取得了可觀的成果。溫雅驕[24]從5個地區不同釀酒葡萄種植基地采集樣品,分離純化得到97株酵母菌株,對其生長速率、耐受性和生長特性進行評價,以及通過小容器釀酒對比試驗,篩選出5株優良釀酒酵母菌株。楊詩妮等[17]從甘肅祁連產區篩選出3株本土戴爾有孢圓酵母,研究發現其對高乙醇、高糖濃度等逆境具有良好的耐受性,生長能力較好,具有釀造優良葡萄酒的潛力。張文靜等[25]優選本土畢赤克魯維酵母(PichiakluyveriHS-2-1)在混菌發酵過程中具有良好的定殖能力。這些有關葡萄酒釀造的微生物研究多集中于釀酒葡萄,從鮮食葡萄篩選酵母的研究較少,分離所得的酵母數量少。為此本研究從鮮食葡萄中分離110株酵母菌株,對其進行耐受性篩選,并與商業酵母對比研究獲得了2株適合鮮食葡萄釀酒的酵母菌株,其各項性能指標接近商品化釀酒酵母,可以用于陜西地區鮮食葡萄酒釀造的商品化菌株。

4 結論

本研究從戶太8號鮮食葡萄自然發酵過程中篩選出了110株酵母,通過杜氏管發酵和耐受性實驗篩選出了5株耐受性能較好的菌株,經過鑒定均為釀酒酵母。經過CIELab顏色分析發現所有鮮食葡萄酒的明亮度高,LA-PE組酒樣表現出最強的紅色色調,ST組最強的黃色色調,SY組酒樣的顏色較淺。將這些葡萄酒經過感官評價后得到了口感較好和綜合性評價高的兩株酵母,編號為Z502和Z504,Z502在口感上表現最好,Z504在香氣上表現最佳。上述的商業酵母和從葡萄自身篩選的酵母均能用于鮮食葡萄釀酒,且各有自身的特點。從葡萄自身篩選的酵母可以突出品種和產地特色,可以避免葡萄酒品質低、同質化嚴重問題,從葡萄自身篩選的酵母無疑是鮮食葡萄酒微生物研究的一個重要趨勢。