產細菌素乳酸菌的篩選及其益生性能評價

張樂,丁一珍,潘媛娜,李科,耿燕,周娟,許泓瑜,李恒*,許正宏,史勁松

1(江南大學 生命科學與健康工程學院,江蘇 無錫,214112) 2(糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214112)

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是一類公認的重要腸道益生菌,具有維持胃腸道菌群平衡、促進消化吸收、增強免疫功能、降低膽固醇等多方面生理功能[1]。乳酸菌腸道益生作用的發揮,與其代謝產生的多種有益代謝物密不可分[2]。部分乳酸菌在代謝過程中所產生的細菌素,又稱抗菌肽,是一種生物活性多肽,能在靶細菌細胞膜上形成通道或直接抑制某些細胞功能而發揮高效抑菌或殺菌作用,在腸道健康中受到廣泛關注[3]。

研究表明,產細菌素的乳酸菌可通過抑制病原微生物生長、競爭排斥或競爭黏附等方式促進自身及其他益生菌在腸道內的定植[4-5],從而調節紊亂的腸道菌群結構,穩定腸內微生態系統。NAIMI等[6]在模擬豬近端結腸的體外發酵模型上證明了細菌素MccJ25對紐波特沙門氏菌的抑制活性,并在腸道炎癥小鼠模型[7]中發現給予MccJ25可減少腸道病原體定植,保護宿主免受腸毒性大腸桿菌的感染。一些乳酸菌產生的細菌素結合了抗菌特性和宿主導向活性[8],通過免疫調節或者誘導宿主腸道抗菌肽的表達[9],進一步促進病原體的排除,如加氏乳桿菌產生的環狀細菌素加氏菌素A調節腸上皮細胞的液體吸收和分泌能力,促進了導致早期斷奶仔豬腹瀉的微生物的消除[10]。此外,產細菌素乳酸菌還具有緩解慢性感染、炎癥性腸病和肥胖等疾病的能力,如從母乳中分離的產細菌素干酪乳酸菌可與腸道病原體競爭,減少結直腸腺癌細胞系和膽固醇水平,并改善小鼠模型中的炎癥性腸病[11];植物乳桿菌NCMIB8826產生的植物乳桿菌素EF能有效改善在飲食誘導的肥胖小鼠模型中顯示出有益的作用[12]。因此,進一步挖掘具有高效抑菌作用的產細菌素乳酸菌,并分析評價其腸道益生活性,對推進乳酸菌通過調節腸道微生態干預或治療疾病等應用具有重要的作用。

本研究以大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922為指示菌,通過有機酸和過氧化氫排除試驗、蛋白酶敏感試驗,篩選得到一株抑菌能力較強、產細菌素的哈爾濱乳桿菌(Lactobacillusharbinensis)P1-1,并對其益生性能進行評價,同時通過共培養的方式評價其與特定微生物之間的相互作用,為進一步豐富對產細菌素乳酸菌的了解和拓展應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料

指示菌株E.coliNissle1917、L.plantarumCGMCC No.18389、E.coliATCC 25922、StaphylococcussepidermidisATCC 12228均保藏于本實驗室。

蛋白胨、酵母粉,OXOID公司;牛肉膏、葡萄糖、CH3COONa、檸檬酸氫二銨、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、胰蛋白胨、NaCl、蔗糖、膽鹽、吐溫80、酵母膏、魚粉蛋白胨、大豆蛋白胨、瓊脂粉、瓊脂糖、無水乙醇、卡那霉素、胃蛋白酶、胰蛋白酶、過氧化氫酶,國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 培養基

MRS培養基(g/L):牛肉膏10.0,酵母粉5.0,蛋白胨10.0,葡萄糖20.0,CH3COONa 5.0,檸檬酸氫二銨2.0,K2HPO4·3H2O 2.0,MnSO4·4H2O 0.05,MgSO4·7H2O 0.2,吐溫80 1.0。115 ℃,滅菌20 min后備用。

LB培養基(g/L):蛋白胨10.0, 酵母粉5.0, NaCl 10.0,121 ℃,滅菌150 min后備用。

1.1.3 溶液配制

人工胃液:取0.1 mol/L HCl用蒸餾水調節pH值至2.0,加入胃蛋白酶0.01 g/mL,溶解均勻后微孔濾膜除菌備用。

人工腸液:取KH2PO42.04 g,加蒸餾水150 mL溶解,用4 g/L NaOH調節pH值至6.8,加入胰蛋白酶0.01 g/mL,溶解均勻后微孔濾膜除菌備用。

1.1.4 儀器與設備

小型低溫離心機,德國Eppendorf公司;酶標儀,Molecular Devices公司;PCR儀、實時熒光定量PCR儀,BIO-RAD公司;超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;電熱鼓風干燥箱,上海實驗儀器廠有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋,美國AUTOCLAVE Engineers公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抑菌活性評價

采用牛津杯法進行抑菌活性評價實驗。抑菌乳酸菌的篩選以E.coliATCC 25922為指示菌。取100 μL 稀釋至107CFU/mL的指示菌培養液于提前準備好的LB平板上,涂布均勻后晾干,用無菌鑷子夾取滅菌后的牛津杯于平板上。供試乳酸菌在37 ℃靜置培養24 h后,測定發酵液OD600值,并將發酵液分別于4 500 r/min離心10 min,取200 μL上清液加入牛津杯中,之后在指示菌最適生長溫度37 ℃下培養24 h,測定各乳酸菌抑菌圈直徑,計算抑菌圈直徑與OD600比值,以單位菌體對應的抑菌圈大小作為抑菌效果評價依據。選定乳酸菌的抑菌活性以E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228為指示菌株再次評價,目標菌株于37 ℃培養箱中靜置培養,取4、8、12、16、20、24 h的發酵上清液進行評價。

1.2.2 產細菌素乳酸菌的篩選與確定

1.2.2.1 乳酸菌的篩選與鑒定

分別取酸乳和酵素樣本10 g加至90 mL生理鹽水中,振蕩使之充分混勻,梯度稀釋后取10-5、10-6、10-7菌液分別均勻涂布于MRS平板中,置于厭氧培養箱中37 ℃恒溫培養,24 h后通過菌落形態初步鑒定,從中挑選出符合菌種特征的菌株進行劃線分離,挑選單菌落在液體MRS培養基中進行純化培養,培養24 h取樣進行菌種鑒定。

1.2.2.2 排除有機酸的干擾

測定各供試乳酸菌發酵液上清的pH,用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至5.0,之后進行抑菌實驗。以利用1 mol/L乳酸、乙酸調節成相同pH且未接種的MRS培養基作為空白對照。

1.2.2.3 排除過氧化氫的干擾

將過氧化氫酶加入到各供試乳酸菌發酵上清液中,使過氧化氫酶的終質量濃度為1 mg/mL。以不使用過氧化氫酶處理的各供試菌發酵上清液為空白對照,評價處理后發酵上清液抑菌活性的變化。

1.2.2.4 蛋白類抑菌物質的確定

用1 mol/L HCl調節各供試乳酸菌發酵上清液至胃蛋白酶最適作用pH 2.0,加入胃蛋白酶使其終質量濃度為1 mg/mL,37 ℃水浴2 h后煮沸滅酶,之后將pH值調節到5.0并加入終質量濃度為1 mg/mL的過氧化氫酶進行抑菌活性測定。

1.2.3 16S rDNA序列同源性分析

用細菌基因組提取試劑盒提取篩選得到的乳酸菌總DNA,以菌株基因組為模板,通過PCR擴增16S rDNA基因片段。上游引物27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;下游引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增體系與條件包括:反應體系30 μL,DNA模板2 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus) 15 μL,ddH2O 11 μL。PCR擴增程序:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,循環34次,72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。凝膠電泳檢驗合格后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測序結果拼接后在NCBI中數據庫利用BLAST進行同源性比對,選取序列一致性在98%以上的部分序列進行比對并構建系統發育樹。

1.2.4 乳酸菌益生性能評價

1.2.4.1 胃腸液耐受性評價

將篩選所得菌株的24 h發酵液按體積比1∶10接種至人工胃液中,37 ℃恒溫靜置培養,分別在0、1、2、3 h取樣,對人工胃液中的活菌進行稀釋和涂布計數;將接入人工胃液中作用3 h的懸濁液進一步以體積比1∶10加至人工腸液中,分別在4、5、6、7 h取樣計數獲得活菌數,存活率的計算如公式(1)所示,公式(1)評價了菌株對模擬胃腸液的耐受能力。

(1)

式中:Ni為不同時間對應的活菌數;N0為初始活菌數。

1.2.4.2 膽鹽耐受性評價

向MRS培養基中分別添加0.3、0.6、0.9、1.2 g/L的膽鹽,滅菌備用。將篩選所得菌株分別接種到上述培養基中,以MRS培養基為對照,37 ℃靜置培養24 h,取樣進行活菌計數,并按照公式(1)求出其存活率。

1.2.5 共培養體系構建及RT-qPCR檢測

以篩選所得菌株為研究對象,分別選擇2株益生菌E.coliNissle 1917和L.plantarumCGMCC No.18389,以及2株條件致病菌E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228作為共培養菌株,并按最優接種比(10∶3)接種,于37 ℃培養箱中靜置培養。以篩選菌株、E.coliNissle 1917、L.plantarumCGMCC No.18389、E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228 5株菌的純培養體系為對照,在0、4、8、12、16、20、24 h分別進行取樣,測量OD600值、pH值及抑菌活性。

采用RT-qPCR對共培養時體系中的不同微生物拷貝數進行測定。提取共培養發酵液的總RNA作為模板,以表1所示序列作為引物。RT-qPCR反應體系擴增體系及條件為:反應體系25 μL,DNA模板1 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,SYBR Green Master Mix 12 μL,ddH2O 10 μL。RT-qPCR擴增程序:95 ℃預變性3 min,95 ℃變性10 s,54 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,循環40次,65 ℃梯度升溫至95 ℃,4 ℃保存。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.6 數據分析

所有實驗均重復3次,實驗結果以平均值±標準偏差來表示,使用Graphpad Prism軟件繪圖與分析,使用MEGA-X軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 產細菌素菌株的篩選

細菌素是益生菌發揮抑菌作用的重要代謝產物,可以通過抑制致病菌,促進有益菌的定殖來調節腸道菌群從而發揮腸道益生功能[13]。益生性乳酸菌通過代謝產生有機酸、細菌素、過氧化氫等多種物質發揮抑菌作用和調節腸道生態[14]。其中,以細菌素作為抑菌物在復雜腸道菌群調節中具有更高的穩定性[15]。本研究根據菌落形態特征進行初步鑒定,從酸乳和酵素樣本中共篩選到20株穩定生長的微生物。經16S rDNA序列同源比對,鑒定得到乳桿菌屬15株(L.paracaseiJN-1、L.paracaseiJN-2、L.paracaseiJN-3、L.brevisJN-6、L.fermentumJN-7、L.fermentumJN-8、L.fermentumJN-9、L.fermentumJN-10、L.harbinensisP1-1、L.helveticusP1-2、L.brucelliP1-3、L.plantarumP1-7、L.plantarumP1-8、L.plantarumP1-9、L.plantarumP1-10),片球菌屬2株(PediococcuspentosaceusJN-4、P.lactisJN-5),腸球菌屬2株(EnterococcusfaecalisP1-4、E.faeciumP1-5),鏈球菌屬1株(StreptococcusthermophilusP1-6)。為篩選高產細菌素的野生型乳酸菌,進一步以E.coliATCC 25922作為指示菌,對這20株乳酸菌進行進一步篩選,通過排除有機酸干擾試驗、過氧化氫酶試驗、蛋白酶敏感試驗,評估并獲得具有較強抑菌活性的產細菌素乳酸菌。首先,通過未排除酸與過氧化氫干擾的抑菌結果分析,E.faeciumP1-4、L.paracaseiJN-1、L.paracaseiJN-2和L.harbinensisP1-1單位菌體密度的抑菌活性較高,抑菌圈直徑與OD600的比值超過6,S.thermophilusP1-6和L.plantarumP1-7的比值<3,抑菌活性較低(圖1-a)。為排除有機酸對抑菌活性的干擾,統一調節發酵上清液pH值為5.0再測試乳酸菌抑菌性能。如圖1-b所示,大部分乳酸菌的抑菌活性均有所下降,但仍保留有較強的抑菌活性,其中L.brucellaP1-3、L.harbinensisP1-1和L.plantarumP1-10單位菌體密度的抑菌活性>4,表明這些乳酸菌發酵液中除有機酸外還有其他物質發揮抑菌作用。進一步排除過氧化氫干擾。如圖1-c所示,經過氧化氫酶處理后,大部分乳酸菌抑菌活性幾乎沒有下降,說明過氧化氫在其發酵上清中占比較低,對整體抑菌活性的貢獻不高。由于乳酸菌產生的細菌素易被蛋白酶分解,故最后利用蛋白酶處理驗證乳酸菌產細菌素的能力,結果如圖1-d所示。部分乳酸菌對大腸桿菌的抑菌活性顯著下降,甚至趨于喪失。其中,抑菌能力下降最為顯著的是L.harbinensisP1-1,其抑菌圈直徑/OD600值僅為1.18,遠小于其他菌株,說明其發酵上清液中的抑菌物質主要為細菌素。因而選定篩得的L.harbinensisP1-1作為研究對象詳細開展評價。

a-未排除干擾實驗;b-排除有機酸干擾實驗;c-排除過氧化氫干擾實驗;d-蛋白酶敏感實驗圖1 二十株乳酸菌的抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of 20 lactic acid bacteria

2.2 菌株L.harbinensis P1-1的同源分析及益生性能評價

通過16S rDNA基因序列測定及同源性比對分析,選取序列一致性在98%以上的部分序列構建系統發育樹。如圖2所示,L.harbinensisP1-1與L.harbinensisM1親緣關系最為接近,該菌是從天然發酵豆腐乳清中分離得到的一株益生性乳酸菌,能夠抑制單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌等的生長,具有胃腸液耐受和膽鹽耐受等益生特性[16]。

圖2 L.harbinensis P1-1的16 s rDNA系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of L.harbinensis P1-1

乳酸菌作為一種益生菌,對胃腸液及膽鹽的耐受性是菌株在宿主體內存活、生長并發揮腸道益生功能的前提[17]。采用模擬胃腸液及膽鹽環境評價L.harbinensisP1-1的消化液耐受性。如圖3和表2所示,L.harbinensisP1-1在人工胃液中3 h仍具有90%以上的存活率;在人工腸液中4 h,存活率仍接近90%。在不同濃度膽鹽的培養基中,L.harbinensisP1-1均能良好生長,在0.3 g/L的膽鹽中存活率為72.4%,在1.2 g/L的膽鹽中存活率仍達到56.2%,表明L.harbinensisP1-1具有優良的消化道環境耐受性和適應性,與文獻報道的L.harbinensisXC-3耐受結果相近[18]。

圖3 人工胃腸液的耐受性Fig.3 Tolerance of artificial gastrointestinal fluid

表2 膽鹽耐受性Table 2 Bile salt tolerance

進一步評價所獲菌株L.harbinensisP1-1的抑菌活性。分別以革蘭氏陽性菌E.coliATCC 25922和革蘭氏陰性菌S.epidermidisATCC 12228為指示菌,評價結果如圖4所示。以E.coliATCC 25922為指示菌時,L.harbinensisP1-1抑菌活性隨培養時間延長而逐漸增強,24 h時抑菌圈直徑達到約23 mm,遠大于文獻報道中的L.harbinensisB22[19]和L.harbinensisM1[16],與文獻報道的其他乳桿菌的抑菌能力相當,如L.salivarius1[20]、L.rhamnosusyoba 2012[21]和E.mundtiiCECT972T[22]。以S.epidermidisATCC 12228為指示菌時,L.harbinensisP1-1抑菌活性隨時間變化趨勢與E.coliATCC 25922相似,但抑菌活性略低,24 h 抑菌圈直徑為21 mm。目前,對于L.harbinensis產細菌素能力及抑菌活性的研究并不多,且已報道的L.harbinensis的抑菌能力均不顯著,如從母羊奶酪中分離的一株L.harbinensis對E.coli、Klebsiellapneumoniae、Pseudomonasaeruginosa等不同指示菌的抑菌圈直徑僅約4 mm[23];從四川泡菜樣品中分離得到的L.harbinensisB22對E.coli、Listeriainnocua、Listeriainnocua等不同指示菌的抑菌圈直徑約13 mm[19]。比較分析可知,L.harbinensisP1-1具有顯著且穩定的抑菌能力。

a-目標菌株在不同時間段對S.epidermidis ATCC 12228和 E.coli ATCC 25922的抑菌直徑;b-以E.coli ATCC 25922 為指示菌平板圖;c-以S.epidermidis ATCC 12228為指示菌平板圖圖4 L.harbinensis P1-1的抑菌活性評價Fig.4 Evaluation of antibacterial activity of L.harbinensis P1-1

2.3 L.harbinensis P1-1對共培養微生物的影響

益生菌在維護腸道健康時,往往表現為同時促進其他益生菌的增殖并抑制病原菌的生長[24-25]。為進一步了解L.harbinensisP1-1的益生特性,將L.harbinensisP1-1分別與2株益生菌及2株條件致病菌共培養,考查體系pH、菌體密度以及各微生物的生長變化情況。其中,L.plantarumCGMCC No.18389是實驗前期從酸菜中篩選得到的一株益生菌[26],E.coliNissle 1917是公認的益生菌,E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228是標準菌株。

共培養對總酸產量的影響如圖5-a所示,L.harbinensisP1-1與益生菌L.plantarumCGMCC No.18389協同產酸,使得共培養體系在不同時間點的pH均低于L.harbinensisP1-1純培養體系,且pH下降速率更快;而E.coliNissle 1917、E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228均削弱了L.harbinensisP1-1的產酸能力,表現為共培養體系在發酵過程中的pH均高于L.harbinensisP1-1純培養。

a-pH值;b-OD600值;c-與L.plantarum CGMCC No.18389共培養體系;d-與E.coli Nissle 1917共培養體系; e-與E.coli ATCC 25922共培養體系;f-與S.epidermidis ATCC 12228共培養體系圖5 L.harbinensis P1-1共培養體系pH值、OD600值和生物量的變化Fig.5 Changes of pH, OD600, and biomass in L.harbinensis P1-1 co-culture system

共培養對菌體密度的影響如圖5-b所示,各體系菌體生長速率大致相同,均在4 h左右進入對數生長期,15 h到達穩定期,OD600值達到1.6左右。0～8 h,共培養體系的OD600值均高于L.harbinensisP1-1純培養,其中以L.harbinensisP1-1與L.plantarumCGMCC No.18389共培養體系菌體生長速率最快,OD600值在8 h 時就達到了1.6;8 h后,L.harbinensisP1-1與L.plantarumCGMCC No.18389共培養體系持續穩定增殖,其他體系種間競爭抑制趨于明顯,菌體密度增長緩慢,且體系間無顯著差異。

進一步分析共培養體系中各微生物的生物量變化。整體比較L.harbinensisP1-1與這4株菌共培養過程中菌體生長的變化趨勢發現(圖5-c～圖5-f),發酵初期,共培養體系中微生物生物量變化較為復雜,但在發酵中后期,尤其是共培養16 h后,菌體生長趨勢相對明朗,L.harbinensisP1-1的益生特性更為明顯,且自身生長增殖情況比純培養時更穩定。具體分析來看,L.harbinensisP1-1完全不抑制L.plantarumCGMCC No.18389的生長,L.plantarumCGMCC No.18389在24 h的生物量約為7.2 copies/mL,與L.plantarumCGMCC No.18389純培養體系生物量相當;對E.coliNissle 1917的生物量無顯著影響,其生物量與純培養相當,在12 h后才略呈下降趨勢,E.coliNissle 1917的存活率高于95%;顯著抑制了致病菌E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228的生長,共培養8 h后兩株菌的存活率均低于90%,E.coliATCC 25922的生物量顯著低于純培養,存活率下降了15.9%。共培養對抑菌活性的影響如表3所示,與L.harbinensisP1-1純培養時比較,當L.harbinensisP1-1與2株益生菌共培養時,抑菌圈直徑均大于26 mm,抑菌活性增強了約20%;與2株條件致病菌共培養在一定程度上促進了L.harbinensisP1-1的抑菌活性,推測原因可能是共培養條件進一步誘導了L.harbinensisP1-1細菌素的產生,已報道文獻中,WU等[27]的研究也發現L.plantarumRUB1與ListeriamonocytogenesATCC 19111和StaphylococcusaureusATCC 6538共培養時可增強抑菌活性和細菌素相關基因的表達。

表3 L.harbinensis P1-1對共培養菌株的抑制情況及 不同體系的抑菌活性Table 3 Inhibition of L.harbinensis P1-1 on co-cultured strains and antibacterial activity of different systems

3 結論

本研究從發酵食品中分離篩選得到20株乳酸菌,通過排除有機酸、過氧化氫等的干擾以及蛋白酶敏感試驗,獲得了一株抑菌能力較強的產細菌素哈爾濱乳桿菌L.harbinensisP1-1。益生活性評價表明,L.harbinensisP1-1具有良好的胃腸液及膽鹽耐受性能,在人工胃液中的存活率高達91.1%,在人工腸液中的存活率超過70%,在1.2 g/L的膽鹽中存活率高達56.2%。分別以E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228為指示菌,L.harbinensisP1-1抑菌活性均隨培養時間延長而逐漸增強,培養24 h后對E.coliATCC 25922的抑菌圈直徑達到23 mm,對S.epidermidisATCC 12228的抑菌活性略低。共培養結果表明,L.harbinensisP1-1與益生菌L.plantarumCGMCC No.18389互利共生,二者生長及增殖更為穩定,共培養發酵液pH下降加快,且抑菌效果增強,抑菌圈直徑提高了約20%;與E.coliNissle 1917共培養時,其生物量約為7 copies/mL,與純培養相比相差不大,共培養發酵液抑菌圈直徑增加到25 mm左右;L.harbinensisP1-1可顯著抑制E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228的生長,2株條件致病菌的存活率均低于90%,L.harbinensisP1-1的抑菌活性同時增強,推測條件致病菌促進了L.harbinensisP1-1細菌素的產生。綜上所述,L.harbinensisP1-1是一株抑菌能力較強的產細菌素乳酸菌,且具有良好的腸道益生能力,在食品、醫藥等行業中具有較高的應用價值。