紫陀螺菌的分離鑒定及其液體發酵條件的研究

譚愛華,陳新,劉發志,李方橋*

1(湖北三峽職業技術學院,湖北 宜昌,443000)2(華中農業大學應用真菌研究所,湖北 武漢,430070) 3(湖北洪山實驗室,湖北 武漢,430070)

紫陀螺菌[Gomphuspurpuraceu(Iwade) Yokoyamas]是一種夏秋季生長在闊葉混交林地的菌根食用菌,隸屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina)、非褶菌目(Aphyllophorales)、陀螺菌科(Gomphaceae)、陀螺菌屬(Gomphus),零星分布于湖北、甘肅、云南、貴州、四川等省的部分地區[1-3]。由于紫陀螺菌屬于外生菌根食用菌,它們需要與松科或殼斗科等木本植物共生,需共生宿主植物長大到一定年限后才能穩定地出菇,一般需用時3～5年,具有較高的經濟價值和生態保護價值,目前尚未實現人工栽培[2-4],只能采集野生資源,且產量極易受降雨量等環境因素的影響。紫陀螺菌味道鮮美,營養價值高,肉質厚實,易保鮮,易加工,且富含蛋白質、氨基酸、維生素、糖類以及微量元素等多種營養成分,而脂肪含量較低,也是一種價格較高的珍稀食用菌[1,5-11]。紫陀螺菌中含有倍半萜烯、多糖等活性物質,這類活性物質可能具有護肝臟、抗氧化、降血壓、降血脂等藥用功能[6,12-14]。此外,倍半萜烯類物質已被證實能抑制癌癥中的DNA合成,可能是制備抗氧化劑和抗癌劑的理想來源,在食品和醫藥領域具有較大的開發價值[6,13-15]。

目前國內外對紫陀螺菌的研究和報道甚少,自筆者團隊1999年首次在我國湖北宜昌發現,并報道該菌的存在[3],后續研究工作也多集中于其生境描述[2,5]、營養成分[1,5-11]、菌種的分離純化[16-18]、培養基的篩選[19-20]和藥理活性[5-6,13-14]等方面的探究。本文以紫陀螺菌的菌絲體生物量為主要測定指標,系統性地探究了其液體培養的條件,希望通過液體發酵進一步開發利用紫陀螺菌的菌絲體,為其菌絲體發酵產品的加工、液體接種劑的規范化制種、以及紫陀螺菌的野生種質資源的保育促繁和馴化栽培奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

紫陀螺菌供試菌株GP01,從宜昌西陵峽針闊葉混交林下的野生子實體GPA中分離所得,由湖北三峽職業技術學院食用菌研究所保存,子實體GPA及其分離純化后的GP01菌株的形態特征見圖1。經華中農業大學應用真菌研究所分子鑒定無誤后,該菌株備份于中國典型培養物保藏中心(武漢),保藏編號為CCTCCM 2021376。

A-紫陀螺菌子實體(GPA)的形態特征(生長15～20 d); B-紫陀螺菌株GP01的菌落形態特征(生長60 d)圖1 紫陀螺菌子實體和供試紫陀螺菌菌落的形態特征Fig.1 Morphological characteristics of fruiting bodies and tested G.purpuraceus strains

1.2 供試培養基

A固體培養基(斜面試管、平板,g/L)[20]:去皮馬鈴薯200,葡萄糖20,磷酸二氫鉀3,硫酸鎂1.5,蛋白胨2,瓊脂18,pH值自然。

A液體培養基:在固體培養基的基礎上,去掉瓊脂即可。

1.3 顯著性分析

采用IBM SPSS Statistics 26.0和GraphPad Prism v8.3.0兩個軟件進行數據處理,大多采用One-way ANOVA(and nonparametric or Mixed)進行單因素和多重比較方差分析,顯著性水平設置為0.05。本文所有的科研繪圖,主要借助GraphPad Prism v8.3.0完成。

1.4 菌株分離,純化與鑒定

在湖北省宜昌市三峽西陵峽地區針闊葉林下采集紫陀螺菌子實體,從中選擇新鮮飽滿的紫陀螺菌子實體,進行組織分離,取內部菌肉均勻地接種于A培養基上,大約7～10 d后組織塊開始萌發。轉接萌發后無污染的尖端菌絲于另一A培養基的平皿中進行純化,于24 ℃恒溫培養箱中暗培養 50 d 后,純化后的菌落,待分子鑒定無誤后,可進行后續的發酵試驗。

紫陀螺菌子實體GPA和其分離純化GP01菌株的基因組DNA提取采用CTAB法[21],ITS-PCR擴增體系和反應程序等參照文獻[22-23]的方法,具體引物序列如表1所示。PCR產物經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,條帶單一的產物直接送測序公司(武漢華煜基因),用ITS1/4雙向測序。測序結果經手動去除低質量堿基和拼接并后,先通過NCBI Blast序列比對,初步鑒定供試菌株是否為紫陀螺菌,并下載與供試菌株親緣關系較近的ITS序列作參考,采用ClustalW和MEGA 7.0構建系統發育樹,選擇極大釋然法(ML),泊松值設定為1 000(bootstrap=1 000),以準確鑒定供試菌株的分類地位。

表1 用于擴增ITS引物Table 1 Primers used for ITS

1.5 液體菌種制備

制備供試的液體培養基A,分裝于250 mL三角錐形瓶中,除了裝液量試驗需要不同體積的液體培養基外,其余的裝量均為100 mL/瓶,每種處理3瓶,即重復3次,滅菌冷卻后,待用。選取其中3瓶,接入10塊經活化的直徑4 mm的菌種圓片,于24 ℃、150 r/min的恒溫搖床中連續振蕩培養25 d,使菌絲球型號和活力相對均一,制成一級種子液,備用。

1.6 液體菌絲生物量的測定

將菌絲體用80目的食品級濾網篩出,再用ddH2O沖洗2～3次,用濾紙將菌絲壓干后,放入45 ℃的烘箱內烘干至恒重,再用萬分之一天平精確稱量其干重,紫陀螺菌菌絲生物量的計算如公式(1)所示:

S=m/V

(1)

式中:S為菌絲生物量,g/L;m為菌絲體干質量,g;V為發酵液體積,L。

1.7 液體靜置培養條件試驗

1.7.1 培養溫度的篩選試驗

在裝有100 mL液體培養基A的250 mL三角錐形瓶中,各接入1塊經活化的直徑4 mm的菌種圓片,分別置于16、18、20、22、24、26、28、30、32 ℃恒溫避光培養,每個培養溫度處理重復3次。60 d后,將菌絲收集起來,用ddH2O洗凈后烘干,稱其干重,按1.6節方法測定菌絲體生物量,比較每一培養溫度下的菌絲生物量,并進行方差分析。

1.7.2 培養基初始pH值的篩選試驗

制備供試液體培養基A,用KH2PO4或K2HPO4,將其自然初始pH值分別調整到5.0、5.3、5.6、5.9、6.2、6.5、6.8、7.1,再將其分裝于250 mL三角錐形瓶中,裝量仍為100 mL/瓶,每種pH值重復3次。滅菌冷卻后,各接入1塊經活化的直徑4 mm的菌種圓片,經24 ℃恒溫避光靜置培養60 d后收取菌絲,洗干凈后烘干,稱取其干重,按1.6節方法測定菌絲體生物量,比較每一培養pH值下的菌絲體生物量,并進行方差分析。

1.8 振蕩培養條件試驗

1.8.1 裝液量的篩選試驗

制備液體培養基A,分別按體積比(裝液量∶容器總容量)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%的裝液量分裝于250 mL的三角錐形瓶中,每種裝液量重復處理3次。滅菌冷卻后分別接入6 mL事先準備好的液體菌種,于24 ℃、150 r/min的恒溫搖床中連續振蕩培養15 d,按1.6節方法測定菌絲體生物量,比較不同裝液量下的菌絲體生物量,并進行方差分析。

1.8.2 接種量的篩選試驗

制備液體培養基A,按100 mL/瓶的裝液量分裝于250 mL的三角錐形瓶中。滅菌冷卻后分別按體積分數6%、8%、10%、12%、14%、16%的接種量,接入事先準備好的液體菌種,每種接種量重復3次。于24 ℃、150 r/min的恒溫搖床中連續振蕩培養15 d,按1.6節方法測定菌絲體生物量,比較不同接種量下的菌絲體生物量,并進行方差分析。

1.8.3 搖床轉速的篩選試驗

制備液體培養基A,按100 mL/瓶的裝液量分裝于250 mL的三角錐形瓶中。滅菌冷卻后分別接入6 mL事先準備好的液體菌種。分別置于轉速為90、120、150、180、210 r/min的恒溫(24 ℃)搖床中連續振蕩培養15 d,每種轉速處理重復3次。按1.6節方法測定菌絲體生物量,比較不同轉速下的菌絲體生物量,并進行方差分析。

1.8.4 培養時間對紫陀螺菌菌絲生長的影響

制備足量的液體培養基A,按100 mL/瓶的裝液量分裝于250 mL的三角錐形瓶中。滅菌冷卻后分成a、b、c 3組,每組處理重復60瓶。a組接種量為6%(體積分數),培養溫度為24 ℃,搖床轉速為150 r/min。b組接種量為10%(體積分數),培養溫度為24 ℃,搖床轉速為180 r/min。c組接種量為10%(體積分數),培養溫度為24 ℃,搖床轉速為150 r/min。在搖床中連續振蕩培養20 d,培養期間每間隔1 d(24 h)從a、b、c 3組各取出3瓶測定菌絲體的生物量,菌絲體生物量的測定方法同1.6節所述,比較不同培養時間下a、b、c 3組的菌絲體生物量。

2 結果與分析

2.1 紫陀螺菌株GP01的分離和純化

湖北宜昌西陵峽紫陀螺菌子實體GPA特征的描述:子實體高10～20 cm,夏秋季于混交林地上單生或成群叢生,幼嫩時呈柱狀或陀螺狀,成熟后呈喇叭狀,菌蓋呈扇形,邊緣呈波浪狀,外表皮紫色,內部菌肉皮實,近白色。菌蓋與菌柄無明顯界線,菌褶呈分叉的條棱狀,相互連接或相互交織(圖1-A)。紫陀螺菌組織分離的菌絲體呈白色,短粗絨毛狀,由于其外生菌根真菌特性,紫陀螺菌株GP01菌落生長速度較慢,約0.4～0.6 mm/d(圖1-B)。

2.2 供試紫陀螺菌材料的分子鑒定和系統發育分析

通過通用引物ITS1和ITS4,PCR擴增供試紫陀螺菌子實體和菌絲體的ITS基因片段(圖2),可以看出GP01菌株和GPA子實體的ITS-PCR的目的條帶大小約700 bp。經過測序,在NCBI的Blast比對框中輸入2個樣本的序列,匹配結果皆為紫陀螺菌屬中紫陀螺菌(G.purpuraceus)及其近緣種(Gomphusspp.),這可能是由于研究紫陀螺菌,并上傳其ITS序列的分類學者較少,且早期由于測序技術的不足,部分上傳的ITS序列僅400 bp,致使NCBI早期收錄的部分序列可能存在著一定的偏差。因此,為了更準確地鑒定供試菌株,選取NCBI數據庫中公開上傳列長序度近700 bp的紫陀螺菌ITS序列作為參考,聯合本文測序的2個供試樣品的ITS序列,采取極大似然法構建系統發育樹。紫陀螺菌參考菌株可以很好地聚類在不同的分支下(圖3),其中,以子囊菌梯棱羊肚菌Morchellaimportuna作為外群;G.crassipes、G.ludovicianus、G.clavatusisolate和G.purpuraceus分別聚類在各自的分支上;其中供試材料(GPA,GP01)和7個紫陀螺菌(ON000129.1Gomphuspurpuraceusisolate AL PM1、ON000128.1G.purpuraceusisolate LL PM1、ON000126.1G.purpuraceusisolate GZAAS22-0001、ON000127.1G.purpuraceusisolate GZAAS22-0002、ON000130.1G.purpuraceusisolate GZAAS22-0004、OL673001.1Gomphussp.JL-2021a voucher HKAS122605)參考序列能聚類在一個分支內,置信度高達99%,且分支內的遺傳距離為0。根據參考文獻[24]的研究結論,當序列的置信度在99%以上時,可認為是相同的種,因此本研究供試的2個紫陀螺菌的來源是一致的(圖3)。

M-BM 2 000+DNA marker;1～2泳道-紫陀螺菌GPA子實體、 GP01菌株的ITS片段圖2 供試紫陀螺菌樣品的ITS基因凝膠電泳圖譜Fig.2 The gel electrophoresis patterns of ITS amplification of two G.purpuraceus materials

圖3 供試紫陀螺菌材料的ITS系統發育分析Fig.3 The ITS phylogenetic cluster analysis of tested G.purpuraceus strain GP01 and its fruitbody GPA by maximum likelihood method

2.3 供試紫陀螺菌株GP01液體培養的特征

紫陀螺菌菌絲體的培養較腐生菌困難,但要比多數珍稀外生菌根食用菌容易。紫陀螺菌株GP01在液體培養基A中靜置培養,能在液體培養基與空氣接觸面上形成一層厚實的白色菌絲團(圖4-A);紫陀螺菌株GP01在液體振蕩培養下,能形成大量黃白色的菌絲球,絕大多數菌絲球外表相對光滑,極少數外表面可見短粗濃毛(圖4-B)。因此,為了更加方便和快捷地篩選出液體發酵培養的最佳條件,選擇在液體靜置培養條件下,篩選溫度和pH值兩大因素;而裝液量、接種量、搖床轉速和培養時間等因素與液體振蕩培養密切相關,本研究選擇在液體振蕩培養條件下進行。

A-紫陀螺菌株GP01在液體靜置培養下的形態(生長60 d); B-紫陀螺菌株GP01在液體振蕩培養下的形態(生長15 d)圖4 供試紫陀螺菌株GP01在液體靜置培養和 振蕩培養條件下菌絲體形態特征Fig.4 Morphological characteristics of mycelia of the tested G.purpuraceus strain GP01 under the conditions of static liquid culture and shaking culture

2.4 溫度對紫陀螺菌株GP01菌絲體靜置培養的影響

不同培養溫度下紫陀螺菌株GP01菌絲的生物量見圖5。由圖5可知,紫陀螺菌菌絲在16～28 ℃內均能生長,在以2 ℃為溫度梯度的條件下培養,24 ℃時紫陀螺菌株GP01菌絲生物量最大(約1.23 g/L),與其他處理組有顯著差異(P<0.05),當溫度低于24 ℃時,菌絲生長速度隨溫度升高而加快,當溫度高于24 ℃時,菌絲生物量隨溫度升高而明顯減緩,故紫陀螺菌株GP01菌絲最適生長溫度為24 ℃。當溫度高于30 ℃時,菌絲均未明顯生長,30、32 ℃培養的菌絲體最終生物量與初始接種量相近,說明30 ℃是紫陀螺菌株GP01菌絲生長的極限致死高溫。

圖5 溫度對紫陀螺菌株GP01株GP01菌絲生長速度的影響Fig.5 The effect of temperature on the mycelium growth rate of G.purpuraceus strain GP01注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.5 培養基初始pH值對紫陀螺菌株GP01菌絲體靜置培養的影響

不同培養基初始pH值對紫陀螺菌株GP01液體靜置培養菌絲體生物量的影響見圖6,紫陀螺菌菌絲在培養基初始pH值5.0～7.1均能生長,最適初始pH值為6.5,此時菌絲體生物量最大(約1.34 g/L),在pH值為5～6.5,菌絲體生物量隨初始pH值升高而逐漸增多,在pH值為6.5～7.1,菌絲體生物量隨初始pH值升高而明顯減少。

圖6 初始pH值對紫陀螺菌株GP01液體靜置培養 菌絲體生物量的影響Fig.6 The effect of initial pH on the mycelia biomass of G.purpuraceus strain GP01 in static liquid culture

2.6 裝液量對紫陀螺菌GP01菌絲體振蕩培養的影響

不同裝液量對紫陀螺菌株GP01振蕩培養菌絲體生物量的影響見圖7,液體振蕩培養15 d后,當裝液量≥20%時,紫陀螺菌株GP01的菌絲體生物量會隨著裝液量的增加而降低,當裝液量為20%時,菌絲體生物量最大(約1.57 g/L),證明紫陀螺菌是一種好氧真菌。綜合考慮紫陀螺菌液體菌種培養的通氣量和菌種生產成本等因素,認為紫陀螺菌液體菌種培養的適宜裝液量為20%。

圖7 裝液量對紫陀螺菌株GP01菌絲體振蕩培養的影響Fig.7 The effect of liquid volume on the mycelia biomass of G.purpuraceus strain GP01 in shaken liquid culture

2.7 接種量對紫陀螺菌GP01菌絲體振蕩培養的影響

不同接種量對紫陀螺菌株GP01液體振蕩培養菌絲體生物量的影響,如圖8所示。液體振蕩培養15 d后,在接種量為6%～16%(體積分數)時,紫陀螺菌株GP01的菌絲體生物量會隨著接種量的增多而增多,當接種量為14%～16%(體積分數)時,菌絲體的生物量最大,為1.44～1.72 g/L。綜合考慮紫陀螺菌液體菌種生產成本等因素,認為紫陀螺菌液體菌種培養的適宜接種量為14%。

圖8 接種量對紫陀螺菌株GP01菌絲體振蕩培養的影響Fig.8 The effect of inoculation volume on the mycelia biomass of G.purpuraceus strain GP01 in shaken liquid culture

2.8 搖床轉速對紫陀螺菌株GP01菌絲生長的影響

在搖床不同的振蕩速度下,紫陀螺菌株GP01菌絲在液體培養基A中的生物量見圖9?？梢钥闯?紫陀螺菌菌絲體的生物量隨著轉速的增加而增加。收取菌絲體時,當搖床轉速≤120 r/min時,菌球體積相對較大,菌球中心因菌絲缺氧生長緩慢,導致菌絲體生物量較低。當搖床轉速為150～180 r/min時,菌絲體生物量較高,在1.35～1.45 g/L,可能因培養基中溶氧度高,有利于菌絲快速生長。當轉速增至210 r/min時,菌絲體生物量干重比180 r/min時的低,可能因轉速過高對菌絲造成機械損傷影響菌絲正常生長。由此認為,紫陀螺菌株GP01液體振蕩培養時搖床轉速設置為180 r/min較為適宜。

圖9 轉速對紫陀螺菌株GP01菌絲體振蕩培養的影響Fig.9 The effect of shaking speed on the mycelia biomass of G.purpuraceus strain GP01 in shaken liquid culture

2.9 培養時間對紫陀螺菌株GP01菌絲生長的影響

不同培養時間對a、b、c 3組培養組合的紫陀螺菌株GP01菌絲體振蕩培養的影響見圖10。由圖10可知,在100 mL固定體積的液體培養基A中紫陀螺菌菌絲體的生物量,3種不同的組合處理組的生長曲線都均呈現典型“S”形。在培養的第1天～第3天(適應期),菌絲體生長緩慢,生物量也增長平緩。培養3 d以后進入對數增長期,菌絲體生長迅速,生物量顯著上升。a、b、c 3組分別培養至第16、13、14天時,菌絲體生物量達到最高(分別為1.473、1.481、1.480 g/L)。從第15天開始,3組的菌絲體生物量開始出現交差與重迭,此時應該是結束發酵的最佳時期,此后繼續培養,由于菌絲自溶,生物量逐漸下降。由此認為,紫陀螺菌液體發酵菌絲體的生物量和發酵終點因接種量、培養溫度、搖床轉速(通氣量)而異,適當增加接種量和搖床轉速有助于提高菌絲體生物量和縮短發酵時間。

圖10 培養時間對紫陀螺菌株GP01菌絲體振蕩培養的影響Fig.10 The effect of culture duration on the mycelia biomass of G.purpuraceus in shaken liquid culture

3 討論與結論

國內有關紫陀螺菌的研究很少,本研究從野外采集紫陀螺子實體進行菌種的分離、純化和分子鑒定,基于ITS1和ITS4的測序結果,以子囊菌梯棱羊肚菌KH025為外群,采用極大似然法構建了一個系統發育樹,發現野生菌株GP01與宜昌原始采集地的紫陀螺菌子實體的ITS序列完全重合,均為紫陀螺菌G.purpuraceus。同時,液態發酵產物的制備不僅能用于食品加工業,也是培養菌根苗的先決條件[4],而建立合適的液體發酵體系是獲得大量菌絲體的基礎。

基于課題組前期的研究成果,本試驗選取了培養基A作為基礎培養基。由于紫陀螺菌株GP01菌絲體只在平板培養基的上表面匍匐生長(未深入基質),長速十分緩慢,生物量也很低,而且培養基因培養時間過長(2.5～3個月長滿9 cm平板),最終也很容易變干萎縮,因此,本試驗采用液態培養法,對紫陀螺菌菌絲的生長進行了單因子控制條件的研究。液體培養試驗結果顯示,在液體培養基A上,紫陀螺菌菌絲體能在溫度16～30 ℃,初始pH值為5.0～7.1的環境中生長,最適宜的溫度是24 ℃,最適宜的pH值6.5。同時,紫陀螺菌也是一種好氧真菌,綜合考慮通氣量和生產成本等因素,認為紫陀螺菌液體培養裝液量20%(體積分數)為宜,接種量14%～16%(體積分數)為宜,搖床轉速180 r/min為宜。在固定體積(100 mL)的液體培養基中,紫陀螺菌菌絲體的生物量因培養時間而異,但變化趨勢和最終的菌絲體生物量基本相同,呈現S型曲線,這與杏鮑菇等真菌在有限的物質和空間條件下的液體發酵特性類似[25]。值得注意的是,在適宜的條件下,適當加大接種量和搖床轉速,可以促進菌絲生物量的增加,減少液體發酵時間。這表明,通過液體培養技術,可以在短時間內得到一定量的紫陀螺菌的菌絲,并且不會受到季節、環境的制約,從而在一定程度上減少了紫陀螺菌資源的開發成本。雖然野生紫陀螺菌子實體和液體發酵菌絲體的培養條件不同,二者的營養成分可能也有差異,但是液體發酵也不失為一種快速獲取紫陀螺菌多糖等營養物質的途徑或方法,且大量菌絲體也能用于菌根苗的批量合成,具有一定的應用前景。隨著測序技術和生物信息學技術的高速發展以及紫陀螺菌基因組信息的陸續公布,建議未來可根據其基因組信息中的CAZymes(carbohydrate-active enzymes)等的分布特征,進一步地優化紫陀螺菌液體深層培養的工藝條件和培養基配方,尤其是紫陀螺菌可能對蔗糖和麥芽糖等二糖的利用效率較高[26],深入探究紫陀螺菌的生態作用、食品應用開發途徑及其潛在的人工馴化。