氣相色譜-質譜聯用結合氣味活度值分析紅花椒油的關鍵香氣物質特征

高露,趙鐳,史波林,汪厚銀,鐘葵*,閆師杰

1(天津農學院 食品科學與生物工程學院,天津,300392) 2(中國標準化研究院農業食品標準化研究所,北京,102200)

花椒(Zanthoxylumbungeanum)是一種蕓香科(Rutaceae)植物[1],主要分為青花椒和紅花椒兩大品種。因其具有食藥兩用的功效,被廣泛用于烹飪調料和中藥配料[2]。中國是世界花椒第一生產大國,具有豐富的資源[3-4],種植歷史非常悠久。

花椒通常被加工成花椒油進行市場銷售,一定程度上減少了花椒加工及貯藏過程中香氣成分逸散,能夠較好地避免花椒香氣逸散導致品質下降的問題?，F代儀器分析技術為花椒油關鍵香氣成分解析和研究提供了基礎數據參考和技術支持。陳麗蘭等[5]采用GC-MS等技術,鑒定出14種不同花椒油中芳樟醇、乙酸芳樟酯、苯乙酸甲酯、γ-松油烯、水芹烯等為關鍵風味物質。倪瑞潔等[6]通過氣相離子遷移譜聯用儀(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)技術測定發現芳樟醇、β-蒎烯、α-蒎烯、檸檬烯等為韓城大紅袍花椒的標志性差異物。SUN等[7]采用GC-MS技術鑒定芳樟醇、檸檬烯和乙酸芳樟酯等為花椒油中存在的主要香氣活性物質,研究認為p-傘花烴、β-水芹烯、辛酸、香茅醇、乙酸辛酯和檜烯為關鍵風味物質。

近年來我國花椒產業發展迅速,花椒調味油類產品產量及銷售大幅提升,市場產品品牌繁多,產品的質量差異較大。為了豐富市售花椒油香氣特征的研究,目前,關于花椒油的相關文獻報道主要集中在實驗室研究方面,而對市售花椒油的香氣特征研究較少?；ń酚唾|量的高低很大程度上取決于花椒香氣物質種類以及含量,也是不同種類花椒油產品的關鍵品質差異因素[8],開展市售紅花椒油產品的香氣特征研究,對于市面上花椒油類產品的質量評價和品質提升具有理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒油樣品均為市場銷售,根據紅花椒油品牌市場占有率的調研結果,共篩選出12個紅花椒油產品,產品品牌及原料信息如表1所示。大部分市售花椒油產品使用了四川花椒原料,原料油種類以菜籽油和植物油為主。1,2-二氯苯,上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司。

表1 紅花椒油樣品信息Table 1 Red Chinese pepper oil sample information

1.2 儀器與設備

ME204/02電子天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司;7890A-5975氣相色譜-質譜聯用儀,美國Agilent科技公司;HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),四川漢源;固相微萃取進樣針萃取頭[DVB/CAR/PDMS)50/30 μm],美國SUPELCO公司;PC-420D磁力加熱攪拌器,美國Corning公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

用電子天平準確稱取紅花椒油樣品5.00 g,加入1 μL質量濃度為0.326 5 μg/μL的1,2-二氯苯溶液,置于20 mL頂空瓶中,并立即加蓋密封,在65 ℃的溫度下,恒溫水浴20 min,接著在萃取30 min后,再將萃取頭插入GC進樣口進行時長為15 min的解吸附,每個樣品重復測定3次[9]。

1.3.2 GC-MS檢測參數及程序

固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)條件:萃取溫度設置為恒定的65 ℃,水浴平衡時間設置為20 min,萃取時間保持30 min。

GC條件:進樣口的溫度設置為250 ℃,色譜柱為HP-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 mm);柱溫設置為65 ℃,采用分流比20∶1進樣;吹掃流量為1.5 mL/min。具體程序的升溫條件:以25 ℃/min的速度升至90 ℃,保持1 min,以1 ℃/min升至105 ℃,保持2 min,以3 ℃/min至200 ℃,保持2 min,以30 ℃/min至250 ℃,保持2 min;

MS條件:檢測器溫度設置為230 ℃;傳輸線溫度為280 ℃;質量范圍為35～500 amu。

1.4 數據處理

1.4.1 GC-MS定性定量分析

通過對NIST14.0數據庫檢索及保留指數(retention index,RI)[10]的對比鑒定,化合物含量通過峰面積歸一法進行分析,保留指數的計算如公式(1)所示:

(1)

1.4.2 氣味活度值(odor activity value, OAV)的計算

OAV可判斷不同化合物在食品香氣中的貢獻度,通過風味物質的含量與其嗅覺閾值的比值計算得到[11],具體計算如公式(2)所示:

(2)

式中:Ci為化合物的含量,mg/kg;OTi為嗅覺閾值,mg/kg。

1.4.3 統計分析

采用Microsoft Excel軟件對原始數據進行處理,SIMCA-P 11.5、Origin 8.0以及SPSS 19.0軟件完成數據分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 紅花椒油揮發性風味物質分析

采用GC-MS技術對紅花椒油揮發性物質成分進行分析,12種市售紅花椒油揮發性化合物的種類及含量均存在顯著差異(P<0.05)。紅花椒油揮發性風味成分總含量為757.2～3 132.79 mg/kg,共檢出85種揮發性風味成分,烯烴類物質最多,有25種;醛類物質19種;醇類物質14種;酯類物質12種;酮類物質6種;其他類7種;酸類物質最少,僅有2種。熱圖將GC-MS分析得到的揮發性物質成分數據可視化處理,顏色由藍色到紅色代表化合物含量依次增加。圖1表明揮發性物質成分中,烯烴類含量最高,主要揮發性物質有乙酸芳樟酯、檜烯、芳樟醇、月桂烯、檸檬烯、羅勒烯等。與高夏潔等[12]報道的高溫制取紅花椒油中特征香氣物質為月桂烯、芳樟醇、桉葉油醇、檸檬烯、乙酸芳樟酯及ISELI等[13]報道的花椒中關鍵差異性物質為檸檬烯、乙酸芳樟酯、β-月桂烯、檜烯、芳樟醇等研究結果基本一致。

圖1 紅花椒油GC-MS測定結果熱圖Fig.1 Volatile compositions heatmap of red Chinese pepper oil products measured by GC-MS

2.2 花椒油活性香氣值分析

OAV對于食品香氣研究具有重要的作用,通常以濃度和閾值2個維度來評價食品中揮發性物質在食品中的影響[14-15]。通常,OAV>1的香氣化合物被認為對產品整體香氣影響較大,其數值越大表明對香氣影響越大[16]。查閱文獻獲取紅花椒油中OAV>1的香氣物質共計31種,香氣物質的閾值、香氣描述及OAV如表2所示。

表2 不同市售紅花椒油特征香氣物質閾值、香氣描述及OAVTable 2 Aroma substance threshold, aroma description, and OAV of different commercially available red Chinese pepper oil

由表2可知,12個花椒油中有10種共有的活性香氣物質,9個花椒油中共有的活性香氣物質共計16種。其中,2-庚烯醛、月桂烯、芳樟醇、羅勒烯、檸檬烯5種香氣物質在大部分花椒油樣品中OAV≥1 000,特別是芳樟醇、月桂烯等物質,在部分花椒油中的活性值達到近3萬。乙酸芳樟酯、正辛醛、反式-2,4-癸二烯醛、α-水芹烯、R-(-)-香芹酮這5種香氣物質在大部分花椒油樣品中OAV范圍為100

聚類分析可以根據樣本數據特征進行分類,將相似度較高樣品聚為一類[18],對12種紅花椒油OAV通過系統聚類的方法進行分析,結果見圖2。當設定距離為10時,12種紅花椒油分為了三大類。其中,麻得倒、萬弗、友加、建華、山之嬌、五豐黎紅(H1～H6)聚為一類;樹上鮮、帥青(H7～H8)聚為一類;愛蜀味、蜀味坊、新黎紅、長康(H9～H12)為一類。

圖2 紅花椒油OAV系統聚類分析Fig.2 Cluster analysis of red Chinese pepper oil OAV system

2.3 紅花椒油OAV的偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)分析

聚類分析屬于無監督學習算法,主要用來說明樣品的分類趨勢,不易準確獲取不同類別樣品間的差異來源[19]。PLS-DA是有監督學習算法,可以實現樣品間的類別預測,消除組內噪音,突出組間差異[20],但過擬合現象的出現會導致分析結果的差異,因此,需要置換檢驗來驗證模型參數[21],如圖3所示。

a-PLS-DA的模型參數;b-模型檢驗結果圖3 PLS-DA模型參數Fig.3 Replacement test of PLS-DA model parameters

變量重要性投影值(variable importance in project,VIP)通常用于PLS-DA模型中變量重要程度的評價。VIP值越高,表明該香氣物質在花椒油樣品類型判別和差異分析中越重要[20]。一般認為VIP>1.0的變量對樣品的區分具有較高的貢獻率。

由圖4可知,有12種香氣化合物的VIP>1,可以作為判別三類紅花椒油特性香氣化合物。分別為:正辛醛(G13)、芳樟醇(G1)、檸檬烯(G25)、檜烯(G21)、β-蒎烯(G22)、月桂烯(G23)、2-壬烯醛(G17)、己醛(G11)、羅勒烯(G26)、(Z)-芳樟醇氧化物(G31)、戊醛(G10)和乙酸異丁酯(G5)。

圖4 紅花椒油樣品PLS-DA的VIPFig.4 VIP of PLS-DA of red Chinese pepper oil samples

Biplot圖將得分圖和載荷圖結合在一起,可以說明每個變量在判別組間差異中的影響。以第一主成分為橫坐標,第二主成分為縱坐標建立紅花椒油和香氣化合物相關性的Biplot圖(圖5)。

圖5 不同紅花椒油中揮發性香氣成分的PLD-DA結果Fig.5 PLD-DA results of volatile aroma components in different red Chinese pepper oil注:G1-G31:香氣化合物;H1-H12:12種紅花椒油樣品; 紫色為VIP>1的關鍵香氣化合物。

由圖5分析可知,樹上鮮、帥青(H7～H8)紅花椒油以月桂烯(G23)、羅勒烯(G26)、檸檬烯(G25)為主要關鍵差異性化合物,結合表2可知,月桂烯香氣為花香,羅勒烯具有甜香,檸檬烯香氣為柑橘香,乙酸異丁酯具有月季花香和水果香,正辛醛香氣描述為香草味、橘子味,但此類樣品與乙酸異丁酯(G5),正辛醛(G13)距離較遠,因此,這類紅花椒油主要表現為花香,柑橘香和甜香香氣特征,具有較弱的水果香和香草味;芳樟醇(G1)、檜烯(G21)、β-蒎烯(G22)、(Z)-芳樟醇氧化物(G31)是愛蜀味、蜀味坊、新黎紅、長康(H9～H12)這一類紅花椒油的關鍵差異性化合物,結合表2可知,芳樟醇香氣描述為花香、青香、木香、甜香,β-蒎烯香氣描述為松木香、樹脂香,檜烯香氣描述為松節油,(Z)-芳樟醇氧化物香氣描述為花香,因此,此類樣品香氣特點可描述為花香、青草香、松木香及樹脂香;麻得倒、萬弗、友加、建華、山之嬌、五豐黎紅(H1～H6)這一類紅花椒油相對樹上鮮、帥青(H7～H8),愛蜀味、蜀味坊、新黎紅、長康(H9～H12)這兩類紅花椒油中的關鍵差異性化合物距離較遠,表現出較弱的花香,水果香,青草香和松木香等香氣特征。這12種市售不同紅花椒油所用原料花椒產區基本為四川漢源,主體揮發性物質也大體一致,但是由于關鍵差異性化合物的不同會對樣品分類產生影響,呈現不同香氣特征。郝旭東等[23]對4個不同產區大紅袍花椒的揮發性組分分析中,關鍵風味物質為芳樟醇、3-蒈烯、乙酸香葉酯和月桂烯,對大紅袍花椒整體香氣有較大貢獻度,與本研究結果基本一致。蒲鳳琳等[24]研究中發現月桂烯、檸檬烯、β-羅勒烯是四川漢源花椒的特征風味成分,與本研究結果一致。雖然市售不同花椒油原料產地相同,但是由于關鍵差異性物質的不同表現不同香氣特征,對于不同紅花椒油的關鍵香氣物質差異及香氣描述還有待進一步研究。

3 結論

本文以12個市售紅花椒油為研究對象,采用HS-SPME-GC-MS技術進行揮發性風味物質測定,分析共有85種揮發性物質,結合OAV值確定特征香氣成分有31種化合物。在對不同市售紅花椒油分類后,經PLS-DA的VIP值對導致分類的關鍵差異性香氣成分進行分析。以VIP>1進行篩選,芳樟醇、正辛醛、月桂烯、(Z)-芳樟醇氧化物、檜烯、β-蒎烯、檸檬烯、2-壬烯醛、羅勒烯、己醛、戊醛和乙酸異丁酯為關鍵香氣物質。本文探討了市售不同紅花椒油由于關鍵差異性物質的不同,分成三大類,分別呈現不同的香氣特征,在一定程度上為建立紅花椒油香氣成分圖譜數據庫特征香氣提供理論數據支持,對市售花椒油綜合加工開發產生深遠影響。關于市售不同花椒油原料花椒產區,原料油種類等對花椒油香氣類型差異的影響還有待進一步研究。