代謝組學在食源性致病弧菌研究中的應用進展

趙燕妮,武若冰,余瑞,張森虎,李華,劉歡*

1(陜西科技大學 食品科學與工程學院,陜西 西安,710021) 2(南方科技大學,公共分析測試中心,廣東 深圳,518055)

弧菌是海洋環境中豐富的致病菌之一,在世界各地的海水水域中均可見其身影。其生長迅速且擁有很強的適應能力,可在短時間內引起病害的大面積爆發,嚴重制約著我國水產養殖業和捕撈業的持續發展,甚至威脅人類生命健康。到目前為止,已超過100種弧菌被鑒定,其中創傷弧菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌等是世界范圍內引起人類食源性弧菌病的主要病原菌。由致病性弧菌引起的食源性疾病通常與食用生的或未煮熟的海鮮有關,食源性弧菌感染的常見癥狀包括急性腸胃炎、敗血癥等。同時,食源性弧菌病具有明顯的季節性分布,一般在每年5～7月為發病高峰期。此外,隨著全球氣候變暖,發病率持續上升[1-3]。

抗生素是弧菌病害防治的主要手段,起初抗生素具有見效快、價格低廉等優勢,然而濫用抗生素可能會導致細菌的耐藥性,甚至會出現超級細菌。開發新型安全、高效的病害防治手段已成為當前亟待解決的問題。為了使弧菌病害防治手段的開發做到有的放矢,開展弧菌致病機制的基礎研究工作就顯得尤為重要。

多組學技術,即整合基因組學、轉錄組學、蛋白質組學及代謝組學等,可為細菌致病機制及新型防治手段的設計與開發提供更加系統的理論支持。目前有關弧菌致病機制等方面的研究主要依托于基因組學和蛋白質組學技術,然而這些研究方法主要集中在基因和蛋白等生物體生命活動的上游調控元件[4]。小分子代謝物作為基因和蛋白表達的末端產物,可以更直接、準確地反映生物體當前的狀態。通過考察生物體內小分子代謝物水平及代謝網絡的變化,可為細菌毒力調控機制的研究提供新的視角。代謝組學作為系統生物學的重要組成部分,可對生物體內在生命過程中存在的代謝物進行全面表征、鑒定與定量分析,其在理解弧菌與宿主之間相互關系、揭示弧菌耐藥機制及致病機制中扮演著重要角色。然而,目前基于代謝組學技術在食源性弧菌研究中的應用尚未見綜述。針對于此,本文介紹了食源性弧菌的分類、代謝組學技術的分析流程及其在揭示宿主免疫應答反應、弧菌致病機制及抗生素耐藥性相關研究方面的進展,有望為食源性致病弧菌的新型防控手段的開發提供新視角和新思路。

1 食源性致病弧菌

食源性致病弧菌是一種人畜共患病原菌,可導致人類或水產動物創傷性感染、敗血癥等,主要包括霍亂弧菌、副溶血弧菌、創傷弧菌等。食源性弧菌的致病性主要取決于其毒力因子(如鞭毛、腸毒素、外膜蛋白、鐵磷化合物、生物被膜、黏附因子、Ⅲ型分泌系統等),而毒力因子的表達會受到群體感應系統、雙組分系統、非編碼sRNA分子等精密調控[5-9]。

1.1 對人類致病的食源性弧菌

食源性致病弧菌引起的人類疾病可分為兩大類:霍亂和非霍亂感染?；魜y弧菌是引起人類重大流行病-霍亂的病原體,是弧菌屬中對人類公共衛生影響最為嚴重的病原菌,具有發病急、傳染性強、發病率高等特點?；魜y弧菌致病島1(Vibrio Cholerae pathogenicity island 1, VPI-1)是霍亂弧菌基因組島(genomic islands, GI)中最具特征的基因之一,可編碼許多促進霍亂發展的毒力因子,對于霍亂弧菌的定植和霍亂毒素(cholera toxin, CT)的產生至關重要,當霍亂弧菌缺乏VPI-1時,則不會對人類產生威脅[10]。非霍亂弧菌(如副溶血性弧菌、創傷弧菌)也已成為日本、美國、泰國等國引起食源性感染的主要病原菌之一。若人食用被其污染的水產品,常會出現2～10 d的水樣腹瀉、腹痛,甚至出現急性腸胃炎、敗血癥等。由tdh和trh基因編碼的熱穩定直接溶血素(thermostable direct hemolysin, TDH)或TDH相關溶血素(TDH-related hemolysin, TRH)被認為是副溶血弧菌的主要毒力因子。其中,TDH是一種具有中心孔的四聚體,可在脂質體上形成跨膜孔,使細胞內外的離子滲透不平衡,最終導致細胞腫脹、溶解[11]。與TDH類似,TRH能在紅細胞膜中形成氯離子(Cl-)通道,導致離子通量改變[12]。與副溶血弧菌不同,創傷弧菌是一種高度致命的人類病原體,其死亡率是所有食源性病原體中最高的,確診病例的死亡率接近50%。這歸因于創傷弧菌可表達多種致命外毒素,這些毒素具有嚴重侵襲性和損傷力[13]。研究發現MARTX(multifunctional-autoprocessingrepeats-in-toxin)是創傷弧菌重要的外毒素之一,其可形成一種孔洞導致紅細胞內Ca+內流,進而誘導了紅細胞的促凝活性增加,最終引起人類紅細胞形態的改變和血栓的形成[14]。這些病原體在成功定殖于生物體內后,均會通過產生一系列的毒力因子來干擾機體正常的新陳代謝,其引起的主要癥狀也大致相似,主要包括腸粘膜細胞受損、腸道感染等。

1.2 對水產動物體致病的食源性弧菌

魚類、雙殼類和單殼類等一系列海洋生物疾病的流行也與食源性弧菌感染密切相關。其中,溶藻弧菌是引起海洋魚蝦類患病的一種常見病菌,其可感染多種海洋生物如黑鯛、鮭點石斑魚、黃鰭鯛、凡納濱對蝦、文蛤等,主要表現為生物體皮膚潰爛、不同部位的充血腫脹甚至死亡[15]。此外,溶藻弧菌可通過分泌大量的胞外產物(extracellular products, ECPs)逃避宿主的自然防御并干擾宿主正常的新陳代謝,已知的胞外產物包括外膜蛋白、溶血素、腸毒素、鐵磷化合物、蛋白酶等,其中外膜蛋白與細菌黏附、毒力以及環境適應性等息息相關。BUNPA等人[16]從發病魚體中分離得到的溶藻弧菌中,共鑒定出7種獨特的蛋白質,其中外膜蛋白A(outer membrane protein A, OmpA)的表達最強,是溶藻弧菌致病所必需的關鍵因子。擬態弧菌也被認為是引起水產動物患病的病原菌,其感染具有病程短和死亡率高的流行特征。有研究發現擬態弧菌已嚴重影響我國淡水鲇養殖的生態平衡,這可能與擬態弧菌中Ⅱ型分泌系統(type II secretion system, T2SS)有關,其負責多種胞外蛋白酶和毒素的分泌,當T2SS基因簇缺失時鲇魚的存活率上升[17]。

為了預防和控制與弧菌有關的疾病,以抗生素為代表的治療手段在弧菌防治方面取得了一定的進展,但仍存在抗生素耐藥性等安全隱患,實施新的抗生素替代品(如植物源抑菌劑、疫苗等)以控制食源性致病弧菌,是向可持續水產養殖業過渡的一個重要步驟。為了使弧菌病害防治手段的開發做到有的放矢,開展弧菌致病機制的基礎研究工作就顯得尤為重要。目前弧菌致病機制的研究主要集中在基因和蛋白等生物體生命活動的上游調控元件中,而代謝物是生物系統內化學反應的產物和底物,是各種生理活動綜合的結果,因而更能直接、準確地反映生理和病理的結果。代謝組學被認為是用于表征小分子代謝物的高級分析方法,現在已經被廣泛應用到微生物領域。

2 代謝組學技術

2.1 代謝組學的概況

代謝組學是系統生物學的重要組成部分,是一門研究生命體中所有代謝物受外部環境刺激后的變化規律的學科,能夠系統的反映生物體整體或組織細胞生理功能及其與內在或外在因素的相互作用[18-19]。代謝組學技術借助生物信息學和化學計量學以及先進的分析平臺,使其在整體上挖掘生物體功能信息、研究生物體內小分子代謝物變化規律等具有獨特且顯著的優勢,已被廣泛應用于食源性弧菌致病機制的研究中。

2.2 食源性致病弧菌的代謝組學分析流程

完整的代謝組學分析流程包括樣品采集和提取、數據采集、數據的預處理、統計學分析、代謝物鑒定及數據解釋(圖1)。在生物樣本的采集、預處理和制備過程中,由于細胞內的酶系活躍,代謝產物不斷經歷化學反應。有學者提出淬滅取樣能最大程度保留細菌的代謝特征,避免生物樣品在采集過程中發生額外的新陳代謝[20]。此外,細胞內代謝物化學性質(如極性、非極性)存在很大的差異性且濃度跨越范圍廣,為擴大化合物提取的覆蓋度,常用的提取溶劑有甲醇水、甲醇/氯仿/水、甲基叔丁基醚/甲醇/水等[21]。另外對于含有羥基、巰基、氨基等極性代謝物還需進一步衍生化處理以提高質譜檢測的靈敏度[22]。值得注意的是,不同弧菌之間存在特異性,培養條件也不盡相同,研究者會根據實驗要求及弧菌特性優化提取溶劑的選擇及配比,所以對弧菌樣品的提取目前尚無統一的方法。

圖1 食源性致病弧菌的代謝組學分析流程[18]Fig.1 Metabolomics analysis process of foodborne pathogenic Vibrio spp.[18]

目前,代謝組學常用的數據采集技術包括核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)和MS。其中,基于NMR的代謝組學技術具有樣品制備簡單、無損傷性、重現性高等優勢[23],但也存在靈敏度較低、動態范圍有限、覆蓋度小等不足。與NMR相比,MS技術擁有更高的靈敏度、更好的結構鑒定能力以及更寬的線性范圍,可產生豐富的數據集,其常與氣相色譜(gas chromatography, GC)、液相色譜(liquid chromatography, LC)、毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)聯用以提高檢測的靈敏度及分離能力。GC-MS是代謝組學研究中較為成熟的分析平臺,一般用于分離鑒定分子質量在50～600 Da的易揮發性化合物,但對于難揮發及熱不穩定性的物質需要衍生化來提高其揮發性和熱穩定性[24]。LC-MS是目前應用最廣泛的分析平臺,它結合了液相色譜技術卓越的分離能力和質譜的高分辨率和高靈敏度的特點,可對一些熱穩定性差、難揮發的非極性化合物進行分析[25]。CE-MS是代謝組學研究中逐漸興起的分析平臺,與GC-MS、LC-MS相比,CE-MS適合分析一些強極性離子化合物,如有機酸、氨基酸、核苷酸等[26]。上述單一的分析平臺均具有一定的偏向性,不能全面的覆蓋生物體內的所有代謝物。雖然多平臺可以更好地覆蓋弧菌的代謝物,但高額的成本也令人們望而卻步,因此提高各平臺的覆蓋度和靈敏度是目前亟需解決的難題。

對于儀器分析獲得的代謝組學原始數據,首先要進行數據預處理,轉化成可用于統計學和化學計量學分析的數據形式,再進行方法驗證以確保數據的準確性和有效性。目前一些免費的第三方軟件受到人們的青睞,如XCMS、MET-IDEA、MZmine、AMDIS等。這些軟件可以識別大部分儀器生成的數據格式,且軟件程序是開源的,可以根據用戶的需求,對算法進行改進[27]。最后結合統計學分析方法(多變量分析和單變量分析)挖掘代謝組學數據中有用的信息,并借助生物信息學對代謝物進行生物解釋。

3 基于代謝組學技術在食源性致病弧菌研究中的進展

近年來,代謝組學技術在理解弧菌與宿主之間的相互作用關系、揭示弧菌耐藥機制及致病機制中扮演著重要的角色。其中,食源性弧菌侵襲宿主可激發機體產生一系列的代謝變化,通過統計學分析獲得與宿主免疫應答密切相關的生物標志物,并結合外部驗證闡明關鍵生物標志物的生物功能,可為后續抗菌物質的研發提供靶點。此外,代謝組學可為系統解析抗生素對細菌代謝調控機制提供有力工具,可用于揭示耐藥弧菌代謝特性,闡明耐藥機制并改善抗生素殺菌效果;結合代謝組學技術與分子生物學技術,可對食源性致病弧菌的毒力調控因子的具體調控功能系統地進行闡述,為弧菌新型防治手段的設計與開發提供理論依據(圖2)。

圖2 基于代謝組學在食源性致病弧菌研究中的策略[28-40]Fig.2 Research strategies of foodborne pathogenic Vibrio spp.based on metabolomics [28-40]

3.1 代謝組學技術在揭示宿主免疫應答方面的研究

當水產動物受到食源性弧菌侵襲時,免疫系統會激發一系列的生化反應過程來調節代謝資源分配,以支持其在應激條件下的防御和生存,然而目前人們對于食源性弧菌引起宿主的應激代謝反應尚不完全清楚。利用代謝組學技術探究弧菌與宿主之間的相互作用關系,有助于更好地理解生物系統內復雜的免疫應激過程,為弧菌病害的防治提供新的參考。富集的能量代謝對宿主抵抗病原菌至關重要,如果能量代謝調節失衡必將引起宿主組織功能障礙,進而影響宿主正常的生理代謝活動,因此了解宿主在免疫應激過程中的能量代謝是必要的。有研究發現在感染副溶血弧菌的泥蟹中,副溶血弧菌是通過減少與能量合成相關的代謝物(琥珀酸、蘋果酸、乳酸)導致泥蟹不同組織中ATP含量的減少,能量代謝的減弱大大提高了泥蟹死亡的風險[28]。也有研究發現被哈維氏弧菌感染的凡納濱對蝦對能量的需求增加,主要表現為隨著感染天數的增加,碳水化合物的含量始終處于整體下調的趨勢,這可能是由于蝦在免疫過程中會消耗大量能量,而碳水化合物可被調用參與能量代謝,進而引起其含量的降低[29]。此外,脂肪酸合成及分解途徑也可在宿主受到弧菌威脅或環境脅迫時參與能量調節,應對免疫應答反應。SU等[30]研究發現感染副溶血弧菌的蛤蜊體內甘油三酯的合成途徑相對于甘油三酯的脂解途徑明顯減弱、脂肪酸從頭合成途徑加強,這促進了游離脂肪酸的β氧化進而通過富集蛤蜊體內的能量代謝以應對副溶血弧菌的感染。

此外,利用代謝組學技術探尋弧菌所引起的宿主免疫應答的生物標記物,進而揭示疾病表型下宿主的深刻內在變化是目前研究的熱點。YE等[31]利用1H NMR代謝學技術分析發現,與對照組相比,感染溶藻弧菌的梭子蟹肌肉中肌苷一磷酸(inosine monophosphate, IMP)水平下降了82.4%,猜測IMP是梭子蟹免疫應答過程中的潛在生物標志物,但其在宿主免疫過程中的作用并未研究。為了更深入的了解海洋生物的免疫應答反應,有學者提出了功能代謝組學,其結合生物信息學和體內外實驗,系統的解釋了關鍵生物標志物在免疫反應中的作用。GONG等[32]采用功能代謝組學的方法研究了溶藻弧菌感染斑馬魚后,死亡斑馬魚和存活斑馬魚的代謝差異,結果表明與未感染的對照組相比,死亡組中色氨酸豐度降低,而存活組的色氨酸豐度增加,進一步采用體內注射的方式給予被感染的斑馬魚外源性色氨酸并檢測其存活率,發現色氨酸以劑量依賴的方式促進斑馬魚的存活。YANG等[33]發現感染溶藻弧菌后存活的斑馬魚體內三羧酸循環是受影響最大的途徑,該途徑中的蘋果酸發生了顯著上調,進一步分析發現外源注射蘋果酸可以重新激活感染斑馬魚的三羧酸循環,促進?；撬岬暮铣?來提高斑馬魚的生存率?？傮w而言,采用功能性內源代謝物不僅可以增強水產動物的抗感染力,亦可以降低耐藥菌的產生,即可通過非依賴性的方法來防治弧菌感染,從而起到保護海洋生物的作用,是目前弧菌病害防治技術發展的新方向。

3.2 代謝組學技術用于抗生素耐藥性相關的研究

由于抗生素在水產養殖業的廣泛使用,導致耐藥細菌的數量急劇增加。因此,迫切需要進一步了解細菌耐藥機制和改善抗生素殺菌效果,以控制耐藥性病原菌。目前,越來越多的證據表明細菌與抗菌藥物接觸后,可通過改變自身的代謝狀態使其不被抗菌藥物殺滅。通過代謝組學監測細菌在抗生素作用下的代謝反應及適應機制,可系統的了解耐藥菌的生理代謝特征及耐藥機制。YIN等[34]利用代謝組學技術對兩種不同質量濃度(0.3 μg/mL、0.5 μg/mL)的氧氟沙星處理后的溶藻弧菌進行了分析,發現脂肪酸生物合成途徑的增強能夠使細菌在0.5 μg/mL的抗生素脅迫下較好的生長,進一步的分析表明抑制脂肪酸生物合成途徑可阻止細菌在高劑量抗生素壓力下的生長。LIU等[35]發現在抗頭孢他啶的溶藻弧菌(ceftazidime-resistantV.alginolyticus, VA-RCAZ)中出現丙酮酸循環減弱、脂肪酸生物合成途徑增強的代謝特征,深入發現VA-RCAZ中丙酮酸循環中的檸檬酸、琥珀酸豐度降低,而富馬酸、蘋果酸豐度增加,表明丙酮酸循環上游代謝可能減弱,導致下游產物的積累,促進大量的乙酰輔酶A進入脂肪酸生物合成途徑,進而增強VA-RCAZ對頭孢他啶的耐藥性。綜上所述,抑制脂肪酸代謝可作為抗生素治療過程中預防抗生素耐藥菌進化的一個潛在新策略。

此外,功能代謝組學作為一種改善抗生素殺菌效果的新型技術,其可在代謝組學闡明細菌耐藥機制的基礎上,通過代謝調節劑(如關鍵的生物標志物)對具有耐藥特性的代謝通路或途徑進行重編程,以干擾耐藥細菌體內耐藥活性物質的產生,從而增強現有抗生素介導的殺菌效果。ZHANG等[36]通過代謝組學發現抗慶大霉素的溶藻弧菌細胞內葡萄糖含量顯著降低,外源添加葡萄糖能夠改善慶大霉素對耐藥菌的殺菌效果,這是由于葡萄糖可逆轉耐藥菌中氧化還原反應的減弱,促進溶藻弧菌對慶大霉素的吸收,使得抗生素殺傷作用大大提高。KUANG等[37]發現丙氨酸與慶大霉素聯合使用會引起抗慶大霉素溶藻弧菌胞內的一氧化氮合酶活性及一氧化氮水平降低,進而增強慶大霉素對耐藥菌的殺傷效果,而精氨酸的加入則會促進一氧化氮的形成,提高丙氨酸與慶大霉素協調作用下耐藥菌的存活率。

3.3 代謝組學技術在揭示弧菌致病機制方面的研究

雖然食源性致病弧菌感染的致病機制已有研究,但每個感染階段分子機制的潛在復雜性在很大程度上尚不清楚。代謝組學技術能對食源性致病弧菌的某個毒力因子或毒力相關基因的具體調控功能進行分析,可以從小分子層面系統地闡明弧菌的致病機制。副溶血性弧菌的三型分泌系統Ι(typeⅢ secretion systemΙ, T3SSΙ)可將不同的效應物和毒素輸送到細胞質中,導致細胞毒性和嚴重的疾病,其包括4個效應器分別是VopQ、VopR、VopS、Vop0450。NGUYEN等[38]利用GC-MS代謝組學技術研究了副溶血弧菌毒力因子T3SSΙ的致病機制,用4株攜帶特定效應器(VopQ、VopR、VopS、Vop0450)的副溶血性弧菌突變株感染Caco-2細胞,發現T3SSΙ中的VopQ效應器在誘導Caco-2細胞感染中發揮了重要作用,該效應子顯著改變了宿主細胞的糖酵解、三羧酸循環和氨基酸代謝,并通過耗盡細胞內谷胱甘肽和增加活性氧的產生來破壞宿主細胞的氧化還原動態平衡。RNA伴侶Hfq(host factor for RNA phage Qβ)蛋白是細菌主要的調控因子之一,參與調節各種關鍵的生理活動,對細菌適應不同環境和生長條件至關重要。課題組前期研究發現Hfq對溶藻弧菌的生長、環境適應能力以及毒力因子的表達具有重要的調控作用。進一步基于代謝組學和脂質組學分析方法研究了hfq的缺失對溶藻弧菌代謝的影響,分析發現hfq基因缺失可抑制支鏈氨基酸、芳香族氨基酸的合成,促進三羧酸循環,從而影響弧菌的逆境防御和能量代謝。此外,hfq缺失觸發了游離脂肪酸和核苷的從頭合成,并促進了磷脂和鞘磷脂的分解代謝,進一步調節了細胞的分裂和生長[39]。小分子非編碼RNA(sRNA)被認為在細菌新陳代謝和毒力調控中發揮著重要作用,LIU等[40]鑒定了一種細胞密度依賴的sRNA分子——Qrr,采用代謝組學技術研究了Qrr對溶藻弧菌代謝的調控作用,分析發現qrr的缺失會導致大多數溶血磷脂顯著上調,溶血磷脂是由甘油磷脂前體通過磷脂酶介導的脂解作用而產生的代謝物,推測qrr的缺失會加快磷脂的分解代謝,這與Δqrr菌株生長緩慢、生物膜形成減少的生理表型相一致。

值得注意的是,弧菌的致病性是多種毒力因子共同作用的結果,其中會涉及許多基因、蛋白質、信號分子的調控,僅靠代謝學技術不能完全解讀弧菌復雜的致病過程。多組學整合分析克服了單個類型的“組學數據”的局限性,能夠在多層面多角度系統地解釋弧菌感染過程中復雜的分子機制,可極大地促進潛在抗菌靶點的挖掘和藥物的開發。但目前多組學整合分析的研究還較為有限,并沒有在食源性致病弧菌中廣泛應用。

4 結論

代謝組學是研究生命體中小分子代謝物受外部環境刺激后變化規律的一門學科,能夠系統全面地反映生物體生理功能及其與內在或外在因素的相互作用關系。近年來,代謝組學技術已被廣泛應用于食源性致病弧菌的研究中,可實現對弧菌與宿主中復雜相互作用的探索,深入還原細菌耐藥機制、改善抗生素殺菌效果,并從小分子層面系統地闡明弧菌的致病機制,為食源性弧菌病害的防治提供了新的理論指導。然而,代謝組技術仍處于一個不斷發展的過程,還面臨著諸多問題和挑戰,主要體現在每一個分析平臺都具有一定的偏向性,不能全面的覆蓋生物體的所有代謝物。雖然多平臺可以更好地覆蓋弧菌的代謝物,但高額的成本也令人們望而卻步,因此提高各平臺的覆蓋度和靈敏度是我們必須面對和亟需解決的難題。其次弧菌的致病性是多種毒力因素共同作用的結果,需要進一步的研究來充分闡明這種復雜的分子機制,多組學技術的整合將加深對弧菌發病機制的認識,可極大地促進潛在抗菌靶點的挖掘和新型藥物的開發。最后弧菌所引發的疾病是一個復雜且不斷變化的過程,常規的代謝組學分析獲取的代謝物是靜態結果,僅表征了生物反應的最終結果,代謝流分析技術則可以很好地彌補這一局限,以期為弧菌致病機制的研究提供新參考。