迷迭香酸的生物活性及其在食品領域的應用研究進展

陳艷,蔣星月,楊瓊,羅莎杰,謝曉芳,彭成*

1(成都中醫藥大學 公共衛生學院,四川 成都,611137)2(西南地區特色中藥資源國家重點實驗室,四川 成都,611137) 3(成都中醫藥大學 醫學技術學院,四川 成都,611137)

迷迭香酸(rosmarinic acid, RA),又稱酪薩維、肉桂醇甙、羅丹酚酸, 廣泛存在于唇形科、紫草科、傘形科等天然植物中。RA是咖啡酸和3,4-二羥基苯基乳酸縮合而成的多酚羥基化合物[1](分子結構見圖1),2個芳香環上分別有2個羥基,使得其具有清除超氧陰離子自由基和羥自由基的能力[2],RA的抗氧化能力強于維生素E被普遍認可。RA提取方式包括索氏提取、熱回流、浸漬、酶解法、超臨界流體萃取、超聲波/微波輔助提取等技術。工業化生產方式有植物愈傷組織培養、微生物發酵等。RA具有抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抗神經毒性、抗病毒、抗過敏、抗菌等多種生物活性,在食品、醫藥、化妝品等領域被廣泛應用。

圖1 迷迭香酸的分子結構式Fig.1 Molecular formula of rosmarinic acid

綜合近幾年研究,本文對RA的來源、生產進行了回顧,重點關注了愈傷組織培養技術和微生物發酵生產等新型的生產途徑。并以抗氧化、抗癌、抗代謝性疾病和神經保護為核心闡述了RA的生物活性機制,最后總結了RA的產品開發現狀,并對現有研究的不足及未來的發展方向進行了討論。

1 RA的來源和生產

1.1 來源

RA分布于唇形科:香蜂花、夏枯草[3]、神香草[4]、牛至[5]、薄荷[6]、鼠尾草[7]、迷迭香[8]、丹參[9];紫草科:宿苞厚殼樹[10]、蒜味破布木[11]、牛舌草[12]、聚合草[13];傘形科:茴香[14]、歐洲變豆菜[15]、歐當歸[16]、扁葉刺芹[17]植物中。此外,RA已從夾竹桃科(沙漠玫瑰)、角苔科(角苔)、烏毛蕨科(紅椿蕨)、菊科(藏掖花)、五加科(天胡荽)等植物中被分離[17-19]。除植物資源外,在蜂膠多酚中也發現了RA的存在[20]。迷迭香酸來源見圖2。

1.2 生產途徑

RA傳統的提取技術有水酶法、超臨界流體萃取、超聲波輔助等。近年來,以植物愈傷組織培養技術和微生物發酵生產為代表的新型生產途徑也獲得更廣泛的關注。迷迭香酸各生產途徑的優缺點對比見表1。

表1 迷迭香酸各生產途徑的優缺點對比Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of different production pathways of rosmarinic acid

水酶提取是一種高效且環保的提取方法,提取時間短,且不受有毒溶劑的污染。SU等[7]采用水酶法從鼠尾草中提取RA,發現纖維素酶的提取效率比蛋白酶更高,而2種酶混合使用可以更有效地破壞植物細胞壁和細胞膜,提取效率較單一酶更高。超臨界流體萃取也是一種較環保的提取方式,能選擇性地提取生物活性物質。LEFEBVRE等[8]用超臨界流體萃取法發現RA的開始提取時間隨著改性劑用量的提高而縮短,說明可以利用時間差來生產不同的組分。此外,TUNGMUNNITHUM等[21]采用優化后的超聲波輔助提取法提取彩葉草中的反式迷迭香酸(trans-RA),結果證明該方法在產量和提取時間方面有明顯優勢。

因產量高效優勢,植物愈傷組織培養和微生物發酵生產RA的新型途徑受到更多的關注。應用植物愈傷組織培養獲得酚酸體外生產細胞系,MODARRES等[22]發現高蔗糖水平能促進RA的積累,在50 g/L蔗糖培養基中RA的產量最高。ABBASI等[23]研究了以皺皮香茶菜誘導愈傷組織,生產富含酚酸的生物活性提取物,為該生產技術應用于抗氧化和抗衰化妝品制備提供依據。除此之外,MAHSA等[24]通過選擇最佳酶變體、增加途徑基因的基因拷貝數以及通過芳香氨基酸途徑改善前體供應,優化菌株,而后在以葡萄糖為唯一碳源的礦物培養基上,利用酵母菌產生了高達(5.93±0.06) mg/L的RA,該研究顯示了應用釀酒酵母發酵生產RA的工藝可行性。ZHOU等[25]構建了菌株YRA113-15B,該菌株在搖瓶培養中產生了208 mg/L RA,這是迄今為止報道的工程微生物細胞的最高迷迭香酸價,這項工作為RA的發酵生產提供了一個有前景的平臺。

2 生物活性

2.1 抗氧化

RA是一種強抗氧化劑[26],DPPH法、ABTS法和CUPRAC法測定RA的抗氧化活性IC50分別為(1.21±0.06)、(1.70±0.07)、(1.21±0.01) μg/mL[27]。其抗氧化機制可分為減少氧化應激[28]、降低活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平[29]、調節相關酶水平[30]3個方面。RA的抗氧化機制如圖3。

圖3 迷迭香酸的抗氧化機制Fig.3 Antioxidant mechanism of rosmarinic acid注:一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK);活性氧(reactive oxygen species, ROS);迷迭香酸 (rosmarinic acid, RA);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD);酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH);谷胱甘肽(L-glutathione, GSH); 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP);帕金森病(parkinson disease, PD);丙二醛(malonaldehyde, MDA);脂肪組織源干細胞(adipose tissue-derived stem cells, ASCs);缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl, DPPH);天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST);丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT); Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH associated protein 1, Keap1);核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid2-related factor 2, Nrf2); 特異巨噬細胞武裝因子(specific macrophage arming factor, sMaf);抗氧化反應元件(antioxidant response elements, ARE)。

RA可以有效地降低ROS水平,減少因ROS損傷。GHORBANI等[33]針對RA能否提高脂肪組織源干細胞在營養缺乏培養條件下的存活率進行研究,發現RA可降低大鼠ROS水平,有助于保護ASCs移植到缺血器官后的存活。H2O2和DPPH自由基是ROS的重要來源。ALDOGHACHI等[26]用DPPH法、H2O2清除法和氧化還原法測試RA的抗氧化能力,RA對DPPH自由基的清除能力大于95%(100 μg/mL),對H2O2的清除能力大于87.83%(100 μg/mL),顯示出RA對抑制ROS水平具有較好的作用。FENG等[34]評估RA在17 ℃液態保存過程中對豬精子抗氧化能力的影響,40 μmol/L RA處理可激活一磷酸腺苷激活的蛋白激酶的磷酸化,從而改善由ROS引起的氧化損傷,進而有效提高液態保存條件下豬精子的抗氧化能力。

2.2 抗癌

研究表明RA具有抗癌活性,包括白血病、結腸直腸癌、肝細胞癌、乳腺癌、胃癌和肺小細胞癌等癌癥[36]。RA的抗癌機制包括:抑制相關信號通路;抑制癌細胞增殖和擴散;抑制細胞侵襲和遷移以及上皮-間質轉化;促進癌細胞凋亡。RA的抗癌機制作用圖見圖4。

MMP中的MMP-2和MMP-9與腫瘤細胞生長、遷移、侵襲密切相關。RA能減少侵襲相關因子MMPs的表達,并通過抑制癌細胞的PI3K/Akt/NF-κB信號傳導途徑來抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲并誘導其凋亡。AN等[36]用Matrigel?侵襲試驗測試了RA對肝癌細胞侵襲的影響,通過Western blot檢測MMP-2和MMP-9的表達,結果顯示RA能顯著降低HepG2細胞中的MMP-2和MMP-9的水平,減少癌細胞的侵襲和遷移。PI3K/Akt/NF-κB信號通路是調節癌細胞發生的重要途徑。研究發現RA(100、200、400 μmol/L)處理HepG2細胞能顯著抑制PI3K、p-Akt和NF-κB的蛋白表達。RA顯著抑制胰腺癌細胞的細胞活力、細胞生長、上皮間質轉化,并誘導胰腺細胞凋亡。體內研究顯示RA劑量依賴性地抑制胰腺癌細胞的腫瘤生長,增加miR-506的表達,同時抑制來自異種移植裸鼠的解剖腫瘤組織中MMP2/16和Ki-67的表達[37]。

表皮生長因子受體是一種位于細胞表面可調節細胞生長和分化的糖蛋白,RA可以通過減少H2O2水平和抑制表皮生長因子受體的活性來降低癌癥相關細胞因子水平。頭頸部鱗狀細胞癌是全球六大最常見的癌癥類型之一。WAER等[38]研究得出RA/藍光通過減少表皮生長因子受體活性和H2O2的產生,從而有效抑制頭頸部鱗狀細胞癌細胞的增殖。此外,RA能促進細胞凋亡,降低細胞凋亡相關抑制蛋白的表達水平。AN等[36]研究了RA對HepG2細胞生長、增殖和凋亡的調節作用,RA有效減少細胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達,增加促凋亡蛋白Bax和裂解的caspase-3的表達,以劑量依賴的方式抑制HepG2細胞增殖。

2.3 抗代謝性疾病

RA能夠調節脂肪代謝紊亂,對糖尿病以及與肥胖相關的疾病的治療有積極的作用,在抗代謝疾病方面發揮著重要作用。

慢性炎癥和過量脂質積累是肥胖及其相關代謝性疾病發生發展的重要標志,RA可通過調節NRF2信號的變化來抑制炎癥,并通過促進AMPK和乙酰-CoA羧化酶的激活來抑制脂肪酸的合成和增強脂肪酸的氧化,進而緩解因脂質過量積累導致的脂質代謝紊亂,可用于治療非酒精性脂肪性肝炎[39]。VASILEVA等[40]研究發現RA能促進Simpson-Golabi-Behmel綜合征細胞的抗脂肪和抗炎活性,從而預防人類脂肪細胞的炎癥和過度的脂肪堆積。

高血糖和氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, oxLDL)是造成糖尿病血管病變的氧化應激和炎癥過程的關鍵誘因。在高血糖條件下,oxLDL通過p38-FOXO1-TXNIP途徑促進NLRP3炎癥體的激活,最終導致NLRP3炎癥體介導的內皮功能紊亂。NYANDWI等[41]研究發現RA通過下調p38-FOXO1-TXNIP途徑和抑制炎癥體的激活來抑制糖尿病動脈粥樣硬化的內皮功能障礙,揭示了RA對糖尿病動脈粥樣硬化的內皮功能障礙產生保護作用,并推測RA可作為糖尿病和心血管疾病的天然預防劑或治療劑。季莉莉等[42]研究表明,夏枯草水提物(RA質量分數為0.1%～20%)可以緩解血視網膜屏障損傷導致的伊文氏藍滲漏,抑制NF-κB信號通路和抑制神經小膠質細胞的激活來緩解視網膜的炎性損傷,即具有改善糖尿病視網膜病的藥效活性。

2.4 神經保護

RA可以通過抑制過量谷氨酸的釋放來防止神經因興奮性毒性受到損傷,并能通過調節炎癥和氧化應激等非淀粉樣蛋白生成途徑來發揮其神經保護作用。谷氨酸是中樞神經系統的主要興奮性神經遞質,然而,過量的谷氨酸釋放會導致興奮性毒性。WANG等[43]發現RA能夠激活大腦皮層突觸體內的γ-氨基丁酸A型受體,減少鈣內流,并通過鈣調素依賴性激酶II/突觸素I途徑抑制谷氨酸的釋放。MOHAMMADMEHDI等[44]建立了大鼠腦室注射脂多糖的神經炎癥模型,觀察了RA對炎性細胞因子、神經元結構和氧化應激標志物的影響,結果表明RA以劑量依賴的方式恢復了氧化-抗氧化平衡,并防止了海馬和前額皮層中促炎細胞因子的過度產生。

RA通過改善認知功能障礙在治療神經性疾病中發揮顯著作用。乙醇可引起認知障礙,RA能夠以劑量依賴的方式預防乙醇引起的氧化損傷、記憶缺陷和認知功能障礙[45]。RA也可改善因阿爾茨海默病引起的認知功能障礙。MIRZA等[46]建立Aβ1-42誘導的小鼠阿爾茨海默病模型,結果表明RA對Aβ1-42所致小鼠空間記憶和再認記憶障礙及焦慮改變均有保護作用。LI等[47]研究了RA是否能影響缺氧/缺血(hypoxia/ischeamic,H/I)損傷引起的白質纖維和認知障礙的變化,發現RA通過改善胼胝體的再髓鞘化,從而緩解了H/I損傷后的認知功能障礙如運動、焦慮行為、學習和空間記憶障礙等[47]。

2.5 其他

除此之外,RA還具有抗病毒、抗菌、抗衰老、抗抑郁、抗炎以及抗過敏[48]等功能活性。

3 迷迭香酸在食品領域的應用

3.1 功能性食品原料

RA具有抗氧化、抗炎等多種生物活性,在功能食品領域應用廣泛。RA是王老吉涼茶和中國傳統茶飲羅布麻[1]中的主要功能成分之一,與茶飲的抗衰老、抗氧化活性密切相關。LC-MS分析顯示, 迷迭香提取物主要含沒食子兒茶素和RA,并且RA精油和其提取物安全有益,可作為飲料行業的保健成分[49]。野生百里香提取物中主要酚類化合物為RA,主要揮發性化合物為香芹酚,該提取物安全可靠,能用于生產功能性食品[50]。高村亮宏等[51]發明了以RA衍生物或其鹽用于制造預防或改善膀胱過度活動癥的食品。一種降尿酸保健品以迷迭香提取物、蒲公英提取物、百合提取物和牡丹根提取物為功效原料,具有顯著的降尿酸效果,且不會造成肝腎損傷[52]。仲米存等[53]以迷迭香、鼠尾草等為原料制備了一種具有抗焦慮作用的食品,能供輕、中度抑郁人群日常食用。一種以核桃粉、迷迭香、廣沙仁等為成分的功能食品,能緩解疲勞、恢復體力及提高人體工作效率[54]。

3.2 食品保鮮劑

迷迭香提取物中富含RA,RA具有抗氧化、抗菌活性,在食品的貯存、加工、運輸中作保鮮劑。周詩雨等[55]發明了一種含有RA的復合抑菌增強劑,能有效抑制金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌,在冷鮮豬肉中補充此抑菌增強劑能實現預防、減輕、延緩食品腐敗所帶來的相關問題。他們還發明了一種含RA的復合抗氧化增強劑,能保持豬肉的色澤和鮮度且不產生腐敗氣味[56]。陳以新[57]發明了一種具有抗菌、抗氧化作用的復合保鮮劑,以明膠、海藻酸鈉、RA等為原料,對蘑菇的保鮮效果好。鼠尾草提取物和迷迭香提取物具有協同作用,能應用于保鮮劑制備[58]。黃毅[59]發明了一種添加了RA和美洲花椒素的保鮮劑,具有較好的穩定性并能顯著延長食品保質期。

3.3 食品添加劑和調味劑

根據GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》,迷迭香提取物被批準為食品添加劑。富含RA的香蜂花提取物具有成為食品的天然添加劑的潛力,可為烘焙產品提供有利的功能特性[60]。左汶駿等[61]發明了一種添加了RA的甜辣醬,酸辣可口并具有開胃作用。

4 小結和討論

目前,RA的研究涉及面廣泛,主要包括3個方面。a)RA的綠色高效生產方式:水酶法在傳統酶解法上進行了改進;超臨界流體萃取法提取率高并且對環境友好;超聲波輔助提取法耗時短;植物愈傷組織生產RA高效;微生物發酵為工業化生產RA提供了新思路。b)RA生物活性機制:RA能抑制氧化應激并提高抗氧化能力;RA通過抑制癌細胞增殖擴散和侵襲遷移以及EMT、抑制癌癥相關信號通路的激活、下調凋亡抑制蛋白的表達同時上調凋亡蛋白的表達來發揮對多種癌癥的治療作用;RA具有抗炎活性,能改善脂肪代謝,并能預防治療糖尿病和心血管疾病;RA還能通過改善認知障礙和炎癥及氧化-抗氧化平衡發揮對神經退行性疾病的保護作用。c)RA的產品開發現狀:RA在食品領域主要被用于功能性食品原料、食品保鮮劑、食品添加劑及調味劑。

但RA研究的局限性仍然存在,RA的未來研究可以針對培養以下三點展開:

a)開發新型提取技術。BARDOT等[62]報道了一種新技術ipowder?應用于香蜂花中RA的提取,研究發現ipowder?提取的RA含量高,抗氧化活性強,這項技術能在保留植物化合物的完整性的同時使一些活性成分更容易獲得。其次,微生物的發酵生產產量高,能實現大規模生產,選育生產RA的高效菌株也是提高RA產量的途徑之一。將誘導子(茉莉酸甲酯、水楊酸、多壁碳納米管)[63]用于處理植物對RA的生物合成途徑提供了參考。

b)動物研究模型多樣化。RA生物活性的研究模型較為單一,未來可以利用斑馬魚或兔等模型開展研究,為RA的臨床應用提供理論依據。

c)提高RA的生物利用度。RA的生物利用度較低,可通過制備RA衍生物、聯合其他活性成分使用來提高其利用率。例如,CARDULLO等[64]報道了RA衍生物酰胺1～10,衍生物具有比RA更優越的α-葡萄糖苷酶抑制活性,比抗糖尿病藥物阿卡波糖更有效,并被證明是有效的抗氧化劑。百里醌、香芹酚、百里酚、RA的組合具有協同作用[65],可以將這些活性成分聯合使用。此外,BANKOLE等[66]將迷迭香多酚封裝在一種脂質體中,使得其物理化學及生物性能最佳。此外,將RA進行磷酸化、乙?；?、羧甲基化、硫酸化等修飾處理,研究其是否會產生新的生物活性,或某一生物活性是否能得到提高,這為RA的生物活性研究提供了新思路。