基于液相色譜-質譜聯用法的食品代謝組學研究進展

周宗賢,何洪源*,趙霞,黃家棟,張桄滕

1(中國人民公安大學 偵查學院,北京,100038)2(國家毒品實驗室北京分中心,北京,100164)

食品是人體所需的主要營養來源,調節著人體的生長發育[1-3]。食品工業的全球化促進了食品在全世界的生產、分銷和貿易。同時,食品在加工、分銷過程中涉及的由環境和人為因素產生的污染也在逐漸增加。近年來,有關食品中霉菌毒素、過敏性添加劑、轉基因作物、多種農藥殘留的研究越來越多[4-7]。未來必須迎接新的食品挑戰,減少可能出現的食品安全風險。

食品分析是分析化學的一個重要領域,2009年CIFUENTES[8]提出了食品組學的概念,將其定義為一門通過應用組學技術研究食品和營養領域的學科。食品組學應用于食品安全研究、質量和可追溯性以及評估食品的功能和營養。代謝組學作為食品組學的一類工具主要研究的是小分子代謝產物,核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)和高分辨質譜(high resolution mass spectrometry,HRMS)是代謝組學主要使用的2個分析平臺。

目前,以質譜為基礎的代謝組學研究已經比較完善。這項技術可以分析營養物質(例如氨基酸、脂質、維生素和脂肪酸)、添加劑(例如著色劑、防腐劑和香料)和食品污染物(例如殺蟲劑、藥物、增塑劑和表面活性劑)[9-12]。此外,代謝組學平臺已經成功地應用于食品科學的各個領域,包括食品安全評估、質量管理、食品溯源、食品(生物)標志物確定、食品生物活性的研究以及食品風味化學和功能的發現[13-19]。本文綜述了基于液相色譜-質譜(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)的代謝組學方法和有關代謝組學應用的最新研究現狀,并展望了食品代謝組學的應用趨勢。

1 基于LC-MS的食品代謝組學技術

代謝組學在醫學、農業、環境科學以及食品科學領域有著不同的應用[20-21]。在食品科學領域,代謝組學與基因組學、轉錄組學和蛋白質組學均通過食品組學方法參與研究,其已經成為研究飲食與生物機體之間相互作用的有力工具,使研究者能夠更深入地了解食品中的營養物質與疾病代謝水平之間的關系。應用代謝組學技術進行食品研究的一般工作流程包括樣品收集、樣品前處理、儀器分析和數據處理。圖1 展示了代謝組學在食品分析中的工作流程。

圖1 食品代謝組學流程Fig.1 Schematic diagram of food metabolomics workflow

近年來,液相色譜(liquid chromatography,LC)技術發展迅速。在現代高效液相色譜中,色譜技術不斷地追求分析的高速度和高分辨率,在某種程度上色譜柱的小型化是LC發展的主要方向,用于高靈敏度的分離分析[22]。納米液相色譜(nano liquid chromatography,Nano-LC)是一種先進的色譜技術,使用柱直徑≤100 μm的毛細管柱進行分離[23]。Nano-LC有很多優點,如高靈敏度、高分辨率、較低的流速(≤800 nL/min)以及試劑的消耗減少等。REINHOLDS等[24]開發了用于分析谷物和豆類中 27 種真菌毒素的Nano-LC分離技術,展現了足夠的準確度和精密度。與傳統方法相比,Nano-LC對包括乙腈在內的流動相的消耗顯著降低。在處理非常復雜的食品基質時,傳統的液相色譜法的分離度有限。二維液相色譜(two-dimensional liquid chromatography,2D-LC)技術與一維液相色譜相比,選擇性好、靈敏度高、分辨率高,并且預處理簡單、峰容量大,適合分離復雜樣品基質。例如,在對食品的風味成分進行分析時,由于風味成分的含量從小分子到大分子變化非常大,傳統的一維液相色譜法的峰容量和分辨率相對有限,不能滿足對風味成分全面分析的要求。而2D-LC應運而生,成為分離復雜風味化合物的有效分析工具。

隨著MS的快速發展,HRMS已在食品分析中得到充分應用[25]。HRMS分析速度快、分析精度高、具有較高的靈敏度、較寬的動態范圍和較高的選擇性,是許多組學科學中最強大的分析工具。在HRMS分析儀中,飛行時間質譜儀(time of flight mass spectrometer,TOF-MS)和靜電場軌道阱質譜儀(orbitrap-MS)是使用最多的,而傅里葉變換離子回旋共振質譜儀(Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer,FTICR-MS)由于采集速率低,難以與快速色譜分離相結合,并且存在維護成本較高等缺點,應用較少。當MS與分離技術、串聯技術和信息方法相結合時,能夠提供非常有效且豐富的信息。在食品組學的分析中最常見的是多MS串聯使用,如四極桿飛行時間質譜(quadrupole-time of flight mass spectrometer,Q-TOF-MS)、三重四極桿質譜(triple quadrupole mass spectrometer,QqQ-MS)、四極桿離子阱質譜(quadrupole ion trap mass spectrometer,Q-Trap-MS)、四極桿軌道阱質譜(quadrupole orbitrap mass spectrometer,Q-Orbitrap-MS)[26-29]?？梢哉J為,MS為眾多組學科學奠定了基礎。

基于LC-MS的代謝組學平臺已經成功地應用于食品科學的各個領域。根據所分析的化學物質在食品基質中的覆蓋范圍,該分析方法主要分為兩類,即靶向和非靶向的代謝組學方法。非靶向方法側重于分析樣品中所有可檢測的分析物,包括未知的成分。相比之下,靶向方法是對目標分析物的檢測。CAJKA等[30]指出,在定量和研究結果的可比性方面,靶向或非靶向方法的應用取決于分析化學家研究問題的目的和范圍[30]。

2 基于LC-MS的食品代謝組學的數據處理

數據處理可能是代謝組學的瓶頸之一,以非靶向篩選為例, LC-MS非靶向代謝組學會產生大量數據,如果沒有開源的數據庫,將很難根據保留時間和串聯質譜信息來確定未知峰。數據處理步驟主要包括數據預處理、建立單變量或多變量分析模型和模型數據評估。

數據預處理會對結果產生影響,在進行各個步驟的時候應當避免信號被錯誤排除或過擬合,同時盡可能地減少由設備波動和系統測量誤差等引起的差異。表1 歸納整理了常用的預處理程序的摘要。

表1 數據預處理Table 1 Data pre-processing

數據預處理后通常使用多變量方法進行進一步分析。多變量分析分為無監督和有監督分析方法,通過結構化、簡化和圖解數據集的方式來顯示特征的相似性和差異性。無監督方法是一種無假設的方法,其目的是減少測量的變量并顯示樣本特征的最大差異。例如,不考慮特征是否取決于產地、動物研究中不考慮飼料對動物的影響、植物研究中不考慮栽培方法對植物的影響。有監督方法則需要考慮關于樣本的元數據。

主成分分析(principal component analysis,PCA)是最常用的無監督多變量分析模型。PCA將多維數據降成二維或三維數據,構建新的主成分并探索數據集的整體變化,最終將不同樣本之間的總代謝差異進行可視化[39]。PCA常被作為一種探索性的方法,例如在食品真實性研究中用于區分辣椒和豬肉的地理來源[40-41]。

在實際的分析中僅僅應用無監督方法是不夠的,大多數情況下必須使用有監督方法來提取最相關化合物。偏最小二乘判別分析是目前最常用的有監督多變量分析模型,其旨在減少殘差(實際觀測值與預測值之間的偏差)并最大化樣本與特征之間的協方差。正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)是一個相對新穎的方法,通過將類別信息納入模型并找到類別最大化分離方向,最小化每個類別之間的分散度。目前OPLS-DA使用仍然較少,但已有研究表明了OPLS-DA的應用價值。例如,QUINTERO等[42]和BRIGANTE等[43]使用OPLS-DA確定了濃縮咖啡感官相關的標志物以及尋找奇亞、亞麻和芝麻籽真實性的標志物。監督方法往往會過度擬合,因此需要通過進一步交叉驗證和結合其他模型性能標準來判別模型的可靠性。

最近,機器學習被引入食品科學領域,其最突出的特點是學習大量數據來提高模型性能,常使用的算法是隨機森林和支持向量機[44]。ZHOU等[45]回顧了深度學習在食品科學中的應用,包括食品識別、熱量估計、質量檢測、食品溯源和食品污染。將機器學習與多源數據融合相結合,可以對食品進行更加全面地分析。因此,機器學習在食品科學領域是一個很有前景的工具,機器學習中的分類和回歸模型在未來適用于食品科學領域。

3 基于LC-MS的食品代謝組學應用

現代食品分析中,食品代謝組學主要應用于食品安全(評估微生物毒素、過敏原、抗營養物質、食源性病原體、農藥、獸藥)、食品質量(感官特性和營養價值)、食品真實性(生物特性、地理來源、農業生產和新鮮度)和食品溯源(食品成分、加工過程)[46-47]。

3.1 食品安全

食品安全是食品分析的重要課題之一,消費者在日常的消費過程中需要在售商品都是安全可靠的,但有關食品安全的事件卻層出不窮。食品安全包括很多子領域,如檢測與微生物相關的食品腐敗、確定過敏原、檢測化學污染物和非法添加物、評估天然毒素等。

在生產、加工等關鍵步驟中食品可能會被污染,如食品原材料生產過程中農藥、獸藥的使用,食品原材料加工過程中病原體殘留。根據世界衛生組織于2020年4月30日有關食品安全的報道中得知,不安全食品可導致腹瀉、癌癥等200多種疾病,每年全世界約有6億人(幾乎每10人中就有1人)因食用受污染的食品而患病,并約有42萬人死亡[48]。

為了檢測和量化食品中的污染物,需要對食品基質進行適當的前處理。QuEChERS方法快速、簡便、廉價、有效、可靠和安全,作為一種兩步的樣品富集和脫鹽方法,已被普遍用于與LC相結合的小分子檢測[49],其中QuEChERS與固相萃取或固相微萃取的結合已被成功用于食品中農藥殘留分析。然而,考慮到一些天然毒素在非常低的濃度下仍具有極大的毒性(甚至是致命的),應該進一步改進制備方法,以便進行靈敏和高通量的檢測[50]。例如,在應用HPLC-MS/MS之前,使用多抗體免疫親和柱選擇性地提取7種毒素,擴大了測定的線性范圍,并將檢測限降至μg/kg[51]。同樣,ALTAFINI等[52]對意大利薩拉米香腸中的赭曲霉毒素A進行檢測時,通過免疫親和色譜柱進行樣品制備,使用LC-MS/MS進行分析,保證平均回收率為79.4%～89.0%,檢測限和定量限分別為0.10 μg/kg和0.25 μg/kg。表2 歸納整理了代謝組學在常見食品安全問題中的應用摘要。

表2 代謝組學在食品安全中的應用Table 2 Application of metabolomics in food safety

3.2 食品質量

食品質量包含多種因素,如味道、顏色、氣味和營養價值。食品中的許多風味成分含量甚微,如何從中篩選和識別關鍵成分一直是食品感官研究的難點和焦點。經過多年的發展,代謝組學已經成為食品感官分析的重要工具,它可以在分子水平上識別食品的關鍵風味活性物質,揭示食品風味的形成機制,并為評價體系提供參考[59-60]。以綠茶為例,非揮發性代謝物決定著茶葉的顏色、風味質量和功能。游離氨基酸可以為茶湯帶來新鮮、輕快的味道并參與香氣物質的形成,類黃酮苷、咖啡因和兒茶素影響苦味,有機酸影響果味和酸度,磷脂影響香味的形成,類胡蘿卜素和脂溶性葉綠素對干茶的顏色和形狀有影響[61]。

代謝組學對食品營養價值分析的主要目標是評估某些化合物對生物機體可能產生的影響、不同化合物之間的協同作用以及認定與健康相關的生物標志物。這些標志物分子可以作為評價身體營養狀況的指標,例如,缺乏某些脂肪酸、類胡蘿卜素和維生素分子會導致脂肪沉積、膽固醇水平和胰島素活性失調,這與慢性疾病(例如肥胖)的有關[62]。

表3歸納整理了代謝組學在常見食品質量問題中的應用摘要。

表3 代謝組學在食品質量中的應用Table 3 Application of metabolomics in food quality

3.3 食品真實性

與其他行業相比,食品行業的利潤率較低。為了增加利潤,一些商家試圖通過偽造或摻假來實現利益最大化,從而造成了食品欺詐。食品欺詐是一個日益嚴重的全球性問題,導致了嚴重的食品安全風險[69]。相關報道很多,例如2008年的中國三聚氰胺事件、2013年的歐洲馬肉風波、2017年的巴西黑心肉事件等。食品欺詐使得食品的真實性備受質疑,如生物特性、地理來源、農業生產和新鮮度等。近年來代謝組學已經成為了打擊食品欺詐的一個強有力的武器,一些代謝物、脂類作為分子標志物在確定食品真實性方面發揮著重要作用。與遺傳和蛋白質標志物相比,代謝標志物(代謝物、脂類)具有樣品制備簡單、應用范圍廣的優勢。

不同生物身份的食品很難進行區分,而加工食品尤其容易造成食品欺詐的風險。對于食品生物特性的鑒別,目前常采用LC-MS非靶向代謝組學的方法來探索食品生物特性的標志物。牛奶、山羊奶、水牛奶是飲食中3種消費量很大的奶類,由于生產和飼養成本等各種因素的影響,水牛奶、山羊奶的價格高于牛奶,因此產生了食品欺詐的風險。JIA等[70]利用UHPLC-Q-Orbitrap-MS進行非靶向代謝組學在3種動物的奶中尋找標志物,從11個潛在標記物中篩選出5個標記物來區分3種產品。其中β-胡蘿卜素僅在牛奶中發現,其定量檢測靈敏度能夠檢測出含有5%的牛奶摻假,維生素D2僅在水牛奶中發現;山羊奶中壬酸、癸酸和辛酸的含量高于牛奶和水牛奶中的含量。

地理原產地有助于提高食品的競爭力,特別是對于那些帶有原產地保護、受地理標志保護和傳統特產保證的食品[71-72]。因此,迫切需要保護特定地理來源的食品,防止可能的食品欺詐。原材料的地理來源信息至關重要。CAVANNA等[73]基于UHPLC-Q-Orbitrap-MS的非靶向代謝組學方法用來檢測來自意大利、歐洲和歐洲以外國家的硬質小麥樣品中的代謝物,最終確定了14個“非意大利”標志物、2個“非歐洲”標志物和9個“意大利”標志物。

農業生產是指培養動、植物或真菌的生產系統。市場上的一些食品被貼上有機、野生、散養、草飼等標簽,不同的飼養條件對產品產生不同的影響。因此,有必要關注不同飼養條件產品的鑒別。在農業生產中常關注的是有機食品和常規食品的鑒別。與常規食品相比,有機食品對人體健康更加有益,其往往以更高的價格出售從而造成了食品欺詐的風險。CUBERO-LEON等[74]使用UHPLC-TOF對有機和常規胡蘿卜進行非靶向代謝組學分析,選擇了區分2組樣品的24個生物標志物,其中有5個標記物顯示出了顯著差異。如果在預測模型(OPLS-DA)中把收獲年份排除在訓練集之外,則分類正確率為76%～100%,這說明該方法受收獲時間的影響較小,方法穩定性高。

食品的新鮮度能夠反映出食品自身的特點,不僅影響食品的風味和營養還會影響有害物質的含量。此外,新鮮度將直接影響食品原料的銷售、加工價值以及加工食品的質量和安全。魚類很容易變質,為解決把產品冷凍后再解凍然后當作新鮮產品銷售的問題,STELLA等[75]提出了一種基于UHPLC-Q-Orbitrap-MS的非靶向代謝組學方法,對冷凍后再解凍和新鮮歐洲海鱸魚片的代謝組進行分析,最終把二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸確定為具有高度區分性的新鮮度標志物。

3.4 食品溯源

食品溯源是指在整個供應鏈中對食品進行持續監測。毋庸置疑,食品溯源與食品質量、食品安全和公共健康密切相關。由于在初級生產、加工、分銷和零售階段對有關食品來源和食品成分信息的精確度要求越來越高,食品溯源對食品工業和消費者均很重要。因此,對食品的加工方法、成分和地理來源的了解是食品可溯源性研究的主要目的。

可使用代謝組學可以對食品工業的主要傳統方法(如加熱、干燥、濃縮和發酵)進行評估。例如,ROCCHETTI等[76]研究了在制造干式發酵薩拉米香腸過程中,加入3種不同的微生物發酵劑(即戊糖片球菌、木糖葡萄球菌和清酒乳桿菌)促進發酵的過程?；赨HPLC-Q-Orbitrap非靶向代謝組學分析結果,每種微生物發酵劑在香腸成熟末期都有獨特的代謝組學特征,涉及脂質氧化(包括脂肪酸的羥基和環氧衍生物)和γ-谷氨酰肽的積累,有助于產品的感官質量。表4 歸納整理了一些代謝組學在食品真實性和食品追溯中的應用摘要。

表4 代謝組學在食品真實性和食品溯源中的應用Table 4 Application of metabolomics in food authenticity and food traceability

4 總結和展望

本篇綜述展示了色譜與質譜的最新發展,并介紹了基于 LC-MS 的靶向和非靶向代謝組學在食品科學領域的應用。代謝組學已經在食品安全、食品質量、食品真實性以及食品溯源方面進行了全面的研究,為食品科學領域提供了可靠的數據。NMR是一種重現性好、無損的表征方法,通過原子核的固有磁性檢測分子特征,常用于靶向代謝組學分析,但其維護成本高、靈敏度低并在數據采集和數據處理方面受到限制。相對而言,HRMS靈敏度高、分辨率高、動態范圍寬,使得靶向和非靶向方法的融合成為了可能,是食品代謝組學分析中的常用技術,其使用局限性是代謝物數據庫少、樣品需要繁瑣的前處理。在整個非靶向代謝組學分析程序中,數據處理是一個非常巨大且重要的工程,如果沒有強大的統計軟件工具,將難以處理大量的實驗數據并進行精確和可靠的量化。

在今后的食品代謝組學分析中應注重以下工作:a)優化從復雜食品基質中提取目標分析物的方法;b)將靶向和非靶向方法進行融合以實現更有效的代謝組學分析;c)開發用于數據處理的生物信息學算法,以自動組合大量代謝組學數據;d)不斷拓展食品成分數據庫和用于代謝物鑒定的串聯質譜數據庫;e)將代謝組學與其他組學相結合,例如代謝組學與宏基因組學相結合可以更好地了解影響食品質量各因素之間的關聯和相互作用,并確認不同生物水平(基因型-表型)的特征。