苯乳酸的研究進展

程一凡,劉念麗,侯 穎

(1.天津科技大學 生物工程學院,天津 300457;2.沂水縣第二中學,山東 臨沂 276400)

近年來,食品安全成為人們關注的熱門話題。中國作為世界第一人口大國,對食品的需求量也是巨大的。食品在加工、運輸及儲存中極易受到微生物污染而腐敗變質,因此食品防腐無論是對人們的日常生活及身體健康還是對經濟的發展都影響巨大。食品防腐劑使用較為廣泛,主要分化學防腐劑和生物防腐劑?；瘜W防腐劑如山梨酸、苯甲酸、對羥基苯甲酸酯類等[1],有研究證實化學防腐劑不僅會對人體健康有一定的危害,而且會破壞食品本身的營養成分[2]。生物防腐劑如苯乳酸(Phenylactic acid,PLA)、納他霉素、果膠低聚糖等[3-4]相較于化學防腐劑而言更加天然和安全,是食品防腐的不二選擇[5]。PLA是一種具有廣譜抗菌作用的新型生物防腐劑[6-7],目前其合成主要有化學合成法和微生物轉化法?；瘜W合成法的制備存在諸多缺點,如工藝流程繁瑣、在生產過程中會出現副產物以及會污染環境等[8-10]。微生物轉化法具有生產條件較溫和、原料成本較低等優點。筆者主要從PLA的理化性質、生產途徑及應用等方面進行綜述,旨在為PLA的生產及食品防腐行業提供新思路。

1 PLA理化性質及抑菌機制

1.1 PLA結構

PLA為2-羥基-3苯基丙酸,又稱為β-苯基乳酸或3-苯基乳酸,是一種天然小分子有機酸,化學式為C9H10O3,相對分子質量是166.17,熔點為121～125 ℃[11],在水中溶解度較好,且耐酸耐熱。PLA最初提煉于發酵食品及蜂蜜,純度較高時為白色晶狀體,性質比較穩定,應用前景廣闊。PLA的第2個碳原子為手性碳原子,存在2種對映異構體,即L-PLA和D-PLA。有研究表明:雖然這兩種異構體除空間結構不同以外,其他的性質如熔點、沸點和相對密度等大多相同,但是其抑菌效果卻存在差異,D-PLA的抑菌效果優于L-PLA[12]。PLA對映異構體的化學結構為

1.2 PLA抑菌機理

目前對抑菌物質的研究主要集中在細胞、分子以及能量代謝水平上。細菌的細胞壁具有保護作用,能夠提高細胞的機械強度,保護細胞免受機械損傷和滲透壓等外力的破壞,其主要成分是肽聚糖,肽聚糖由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸2種氨基糖經β-1.4糖苷鍵間隔排列而形成的多糖支架。溶菌酶是一種能水解細菌中黏多糖的堿性酶,通過破壞肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵,使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,導致細菌細胞壁破裂、內容物逸出而溶解。陸永祥等[13]認為PLA的抑菌作用位點是細胞壁,其抑菌機理與溶菌酶相似。細胞膜主要由脂質(磷脂)、蛋白質和糖類等物質組成,其不僅能夠控制物質進出細胞從而使細胞進行基本的生命活動,還能維持細胞內環境的相對穩定。寧亞維等[14]研究了PLA對熒光假單胞菌的抑菌機制,提出PLA通過破壞熒光假單胞菌的細胞膜以及DNA發揮抑菌作用,消散熒光假單胞菌的跨膜電位,使細胞膜的通透性增加,導致胞內K+外露,細胞膜的完整性遭到破壞,細胞形態改變,胞體內容物外泄,菌體粘連。此時細胞生存必不可少的物質如蛋白質和核酸發生泄漏,細胞膜也失去了支撐及保護功能,細胞生命力逐漸減弱,走向死亡[11]。Wang等[15]分別用1.25,2.50,5.00,10.00 mg/mL的PLA處理糞腸桿菌細胞30 min,發現用10 mg/mL的PLA處理的糞腸桿菌細胞的OD260數值顯著高于用其他質量濃度的處理結果,這一結果表明:隨著PLA質量濃度的增加,細胞膜的損傷越來越嚴重。

在分子水平上,細胞的正常生命活動離不開蛋白質的參與,蛋白質的合成車間是核糖體,PLA能夠和核糖體上的與蛋白質合成相關的亞基結合,影響蛋白質的正常生成,此時細胞的正常生命活動及代謝受到抑制,進一步抑制了細菌的增長和繁殖。寧亞維等[14]通過實驗得出結論:PLA在進入胞內后可以破壞DNA結構,阻礙基因的表達,從而抑制了熒光假單胞菌的正常生長與繁殖。

2 PLA的生產途徑

2.1 化學合成法

鄧喜玲等[16]以苯甲醛和對羥基苯甲醛為起始原料合成PLA和羥基苯乳酸;Mu等[17]先通過乙醛與乙?；拾彼岷铣蛇箖弱?再通過混合鋅與鹽酸還原水解獲得PLA;李光興等[18]通過Raney-Ni合金催化還原羥基苯丙酮酸制備羥基苯乳酸;Van Draanen等[19]使用SN2對苯丙氨酸進行催化合成苯乳酸。

PLA化學合成法存在著許多缺點,例如在合成PLA的過程中生成的副產物較多,工藝路線復雜,控制條件相對苛刻,對環境的污染比較嚴重,在反應過程中需要大量的有機溶劑等。此外,PLA化學合成法最主要的問題是通過化學合成得到的消旋體L-PLA和D-PLA難以分離,純化步驟較為繁瑣且增加了成本。

2.2 生物合成法

由于化學合成法生產PLA的缺點較多,不能進行大規模的生產以及工業化的應用,因此PLA的生物合成法成為人們研究的焦點。PLA的生物合成法有2種:微生物發酵法和全細胞轉化法。

2.2.1 微生物發酵法

PLA可由多種微生物發酵生產獲得。Lavermicocca等[20]實驗發現:在受污染的烘焙食品中分離出來的植物乳桿菌21B(L.plantarum21B)的培養液中鑒定出含有PLA的抗真菌化合物,其質量濃度高并具有較高活性,產量為56 mg/L。L.plantarum21B表現出非常廣譜的抑菌活性,抑制了幾乎代表導致烘焙食品污染的最常見的所有種類真菌的活性,如EurotiumrepensIBT18000,E.rubrumFTDC3228,PenicilliumcorylophilumIBT6978,P.roquefortiIBT18687,P.expansumIDM/FS2等真菌,抑制率超過86%。Rodríguez等[21]研究了5種乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)生產PLA的能力,研究結果表明PLA產量最高的是L.plantarumCECT-221[21]。邵宇[22]在2 L的發酵罐中進行7 d的發酵生產,產量最高可達到700 mg/L。Lakshmi Prasuna等[23]對光合細菌產生L-PLA進行了研究,結果表明:當一種光養細菌(RubrivivaxbenzoatilyticusJA2)以L-Phe為唯一的氮源進行生長時,L-PLA的產量比L-Phe作為附加氮源(0.15 mmol/L)時高(0.45～0.70 mmol/L);當L-Phe的濃度小于4 mmol/L時,L-PLA的產量與L-Phe的濃度呈正相關;當L-Phe的濃度大于4 mmol/L時,PLA的產量達到最高并保持穩定。李興峰等[24]從泡菜中篩選出一株乳桿菌(Lactobacillussp.)SK007,其可產生0.55 mmol/L的苯乳酸;并且證明了PLA合成的限制因素是Phe的轉氨反應,如果用苯丙酮酸(Phenylpyruvic acid,PPA)作為底物代替Phe合成PLA,那么PLA的產量能夠提高11倍,發酵時間可以縮短48 h。

Schwenninger等[25]在利用不同細菌進行聯合發酵時發現PLA的產量明顯提高,若將乳酸菌PropionibacteriumjenseniiSM11與丙酸菌Lactobacillusparacaseisubsp.paracaseiSM20進行聯合發酵,PLA的產量能達到0.166 g/L。田雪嬌等[26]通過用亞硝基胍(Nitrosoguanidine,NTG)對L.plantarumLY-78進行誘變時發現:當NTG的質量濃度為1.0 mg/mL時,作用40 min后得到變異菌株NY-34,發酵液中PLA的最高產量為648 mg/L,比出發菌株的產量增加2.63倍,并且突變株NY-34具有較好的穩定性。隨著生物分子技術的迅速發展,可以通過在分子水平上對天然菌株的基因進行定向改造以獲得PLA高產突變菌株。鄧廷山等[27]通過使用CRISPR/Cas9基因編輯系統將一株干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)1.8727的芳香族氨基轉移酶基因arat敲除,得到重組菌株(L.casei)1.8727Δarat,將此重組菌株發酵72 h,測定其PLA的產量比其出發菌株提高約66.7%,且arat基因的缺失并不會抑制PLA的合成代謝,說明PLA的代謝合成步驟不僅受到arat基因的調控,還可能有多個基因參與,是一個復雜的代謝網絡。

2.2.2 全酶催化法合成PLA

微生物發酵法比化學合成法過程簡單,然而也存在很多缺點,如產率較低、在生產過程中很多條件不易控制、菌體生長慢導致發酵周期較長以及發酵液成分較復雜不利于PLA分離提取等。盡管近年來人們不斷地篩選PLA的高產菌株,還是不能使PLA的產量得到很大提高,難以進行PLA的大規模工業化生產,因此人們將對PLA的高產研究轉向了生物催化法。生物催化法可分為全酶轉化法和全細胞轉化法,其中全細胞轉化法應用較為廣泛。

苯乳酸的合成途徑主要分為2步:先將Phe轉化為PPA,再由PPA生成PLA。第一步反應可由氨基轉移酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脫氨酶(L-amino acid deaminase,L-AAD)進行催化,并且需要α-酮戊二酸的參與。由于氨基轉移酶需要添加α-酮戊二酸,因此會增加生產成本;此外D-氨基酸氧化酶催化PLA生成會產生過氧化氫,對反應體系中的酶和產物具有毒害作用[28]。在L-AAD在催化過程中不需要α-酮戊二酸的參與且不生成過氧化氫,因此利用L-AAD催化其成本更低且更加安全。第二步反應可由乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase,LDH)、芳香族羥基酸脫氫酶、異己酸脫氫酶等酶催化,其中LDH具有較高的酶活力,且不同菌株來源的LDH對反應的催化活性不同。Zheng等[29]研究發現:BacilluscoagulansNL01菌株中含有的L-LDH能夠催化PPA進行還原反應生成PLA。因此篩選高活力的LDH是PLA高產的關鍵[21]。PHE合成PLA的途徑為

賈江花[30]通過實驗得知L.plantarumSK002菌株中L-LDH和D-LDH均是由丙酮酸生物轉化為PLA的有效催化劑,L-乳酸脫氫酶最適pH為6.0,最適溫度為40 ℃;D-LDH的最適pH為6.0,最適溫度為30 ℃,L-乳酸脫氫酶具有較高的溫度和pH穩定性。Xu等[31]在Lactobacillussp.CGMCC 9967中鑒定出一種依賴NADH的苯丙酮酸還原酶(Pphenylpyruvate reductase,LaPPR),該酶是一種高效合成D-PLA的生物催化劑,其能夠將苯丙酮酸還原為D-PLA,產物分離率為91.3%,D-PLA產率為243 g/L。Fujii等[32]發現了能夠產生PLA的熒光威克酵母菌TK1,在其細胞提取物中純化出PPR,克隆了pprA基因并在大腸桿菌細胞中進行表達,結果表明PPR能夠有效地將PPA轉化為PLA。

2.2.3 全細胞催化法

全細胞催化是指利用完整的細胞作為催化劑生產目的產物,該法比全酶催化在實際工業生產中的應用更為廣泛。細胞內完整的多酶體系可以實現酶的級聯反應,從而省去繁瑣的酶的純化步驟。由于全酶催化過程中酶的反應條件溫和,游離的酶容易失活,因此反應需要在嚴格的環境中進行,而全細胞催化劑的酶處于細胞中,受外界環境的影響較小。因此從長遠來看,全細胞催化劑比游離的酶更加穩定,并且制備更加簡單,生產成本更低。

Hou等[33]對來自奇異變形桿菌的L-AAD進行純化,使L-Phe一步轉化生成PPA,另外對比了利用純酶催化和重組大腸桿菌全細胞生物催化兩種方法生成PPA的優勢。實驗結果表明全細胞催化生成PPA有3個優點:首先L-AAD一旦從膜上分離下來就會變得不穩定,這對許多酶來說仍然是一個很大的缺點,然而全細胞催化劑在4 ℃下保存數天后活性幾乎沒有下降,只有在長時間的操作條件下,活性才會逐漸降低;其次與純酶催化劑相比,全細胞催化劑在L-Phe轉化為PPA的過程中具有更好的熱穩定性;最后由于輔助因子循環系統存在于完整細胞中,所以在全細胞催化系統中無須外部添加輔助因子。Zheng等[29]在BacilluscoagulansNL01中提取了一種依賴NAD的L-LDH,該酶被證實具有良好的催化PPA生成L-PLA的能力,并且在研究中使L-LDH基因和甲酸脫氫酶基因在大腸桿菌中進行異源共表達。通過兩次耦合反應,82.8 mmol/L的PPA在40 min內可合成79.6 mmol/L的L-PLA。

3 PLA的應用

3.1 PLA在食品中的應用

隨著經濟能力的提升,消費者逐漸把目光從食品價格轉移到食品安全上來,對食品安全的需求日益增加。一方面,化學防腐劑在抑制食品中微生物方面的效果沒有生物防腐劑好;另一方面,化學防腐劑有危害健康的潛在風險,根據食品監管限制,要求使用來源更加安全的新型有效抗菌素。PLA作為一種新型、安全的天然生物廣譜抑菌物質,具有較高的安全系數、穩定性以及較強的抑菌能力和防止食物腐敗能力,具有廣闊的發展前景。

郭宇逍等[34]研究發現:苯乳酸作為天然殺菌劑在控制柑橘采后發生綠霉病變方面具有良好的應用潛力和開發前景;孔祥麗等[35]發現L-PLA具有對具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum,FN)的抑制效果及抗癌效果,為通過食用天然生物酸預防癌癥提供了研究方向;杜娜娜[36]發現PLA對米根霉有很好的抑制作用,百合是蘭州特色農作物,而米根霉是引起百合鱗莖軟腐病的主要腐敗菌,因此PLA對農作物的儲存極具意義。

3.2 PLA在醫藥行業中的應用

丹參素(β-3,4-二羥基苯基乳酸鈉)是丹參注射液的主要有效成分,可以用于治療冠心病和血管類疾病,并且已經被廣泛地用于臨床治療,然而丹參來源有限,提取分離步驟繁雜。有實驗表明:PLA與丹參素的藥理作用相似,且有體外抗血小板聚集活性、降低血液的黏稠度等作用[37]。PLA是生產恩格列酮的原料,恩格列酮可誘導產生適量胰島素,以降低血糖濃度,可有效治療心血管并發癥及糖尿病[38]。此外,PLA還能夠用于合成非蛋白氨基酸,以及制成降血糖劑和抗HIV試劑等[39]。

3.3 PLA在其他行業中的應用

PLA還可以應用于化妝品、飼料和養殖等行業。果酸經常被用于化妝品行業,而PLA作為果酸的一種,不僅有除皺、保濕、美白及淡斑功效,還能夠作為防腐劑防止微生物污染以此延長護膚產品的保質期[40]。在養殖行業,飼料防腐劑添加不當時會導致抗菌藥物殘留超標,適當添加PLA可延長飼料存放時間。有實驗表明:在家畜的飼料中添加一定量PLA一段時間后發現這些家畜體內的大腸桿菌數量下降,個體生長也得到了明顯改善[41]。

4 結論和展望

PLA在多個行業都具有很強的應用潛力,然而目前國內外對PLA的研究主要集中在菌種的篩選以及對生產條件的優化,對其如何抑菌、是否存在其他的作用靶點以及在菌體內的調控機制都研究甚少。對微生物中PLA的合成與分解代謝途徑以及對PLA的抑菌機制進行深入研究,為今后PLA合成和工業化應用提供十分重要的理論基礎而對PLA的抑菌機制以及其高產量菌株的篩選與定向改造還待進一步探究。