木耳菜總黃酮提取工藝優化及其抗氧化活性研究

曾稍俏

(漳州城市職業學院 食品工程系,福建 漳州 363000)

木耳菜(Gynuracusimbua)又稱紫角葉、藤菜、豆腐菜等,是一種原產于亞熱帶地區的落葵科草本植物[1]。隨著蔬菜產業迅速壯大和品種逐漸豐富,我國各地對木耳菜的種植數量逐漸增加。木耳菜含有豐富的蛋白質和維生素等營養物質,還含有機酸、黃酮、皂苷、黏多糖和葡聚糖等天然有效成分,具有清血解毒、降壓、利尿、健腦、清熱和降低膽固醇等生理作用,因此被廣泛視為一種有益健康的蔬菜[2-3]。黃酮類化合物廣泛存在于藥草、蔬菜、谷物和水果等植物中,具有保護心腦血管、抗氧化和延緩衰老等生理活性[4-5]。目前,國內外對木耳菜的研究主要集中在栽培技術和加工工藝方面。許為義等[6]研究了基質和農藥對木耳菜富硒能力的影響,結果表明相對于土壤基質,火山巖表現出更好的促進作用;草甘膦和氯氰菊酯對木耳菜的富硒均有促進效果,但草甘膦促進作用更為顯著。鄭植等[7]通過超聲波輔助提取法對木耳菜的果膠資源進行提取,結果表明木耳菜果膠提取率達到19.22%,所提取的果膠符合國家標準,是一種具有抗氧化活性的低酯果膠。目前,尚未有關于木耳菜中黃酮的提取和開發的報道。因此,提高木耳菜的經濟附加值,合理利用木耳菜資源,是木耳菜產業深度發展的重要方向?，F代科技的發展推動了超聲波輔助提取方法在黃酮提取中的應用,超聲波輔助提取方法操作簡便、無需添加化學試劑,能更好地保留黃酮化合物的活性成分,符合現代化和環?；纳a要求[8]。牛金鴿等[9]研究了超聲波對藏羊皮膠原蛋白肽提取率及功能活性的影響,結果表明超聲波輔助處理能顯著提高膠原蛋白肽提取率,并能提高膠原蛋白肽的還原力和OH自由基清除率。因此,在單因素實驗的基礎上,進一步使用Box-Behnken設計對木耳菜總黃酮的超聲波輔助提取工藝進行響應面優化,并確定最佳工藝參數,最后評價其抗氧化活性,為木耳菜作為天然綠色抗氧化添加劑的應用提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木耳菜,購自漳州市新華都超市西洋坪店,經黃寶華教授鑒定為落葵科木耳菜[Gynuracusimbua(D.Don) S.Moore in Journ];試劑有蘆丁(福州飛凈生物科技有限公司,標準品)、乙醇(動力派(汕頭)食品有限公司,食品級)等,其他均為市售分析純試劑。

儀器有超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,KQ100DE)、紫外-可見分光光度計(上海美普達儀器有限公司,UV-200)。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制 使用體積分數為70%的乙醇配制含有0.05g/L蘆丁的標準液[10]。取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL的蘆丁標準液,分別加入到10mL容量瓶中。隨后,依次向容量瓶中加入2mL質量分數為6%的NaNO2溶液和1mL質量分數為12%的Al(NO)3溶液,搖勻靜置5min后加入質量分數為4%的NaOH溶液2mL,定容后靜置6min,得到標準曲線工作液,并測得510nm處的吸光度。以蘆丁質量濃度作為橫坐標,吸光度作為縱坐標,得到了標準曲線。通過回歸分析,計算得到了回歸方程:y=0.9637x-0.0475,相關系數R2為0.9996。

1.2.2 木耳菜總黃酮的提取 將購買的木耳菜從超市中取回后,進行充分洗凈,并自然晾干。然后將完全干燥的木耳菜進行細碎處理,通過60目篩。取質量為m(g)的木耳菜樣品粉末置于100mL燒瓶中,按照單因素工藝條件加一定體積的乙醇,并置于超聲波輔助提取器中進行提取。提取結束后,通過過濾、濃縮和定容等步驟,得到木耳菜總黃酮提取液V(mL)。

吸取1mL木耳菜總黃酮提取液,按1.2.1方法顯色,測得在510nm處的吸光度,通過回歸方程換算得到總黃酮提取液質量濃度為b(g/L)?？傸S酮提取率Y(mg/g)計算公式如下:

1.2.3 單因素實驗 總黃酮提取的單因素水平如表1所示。由表1可知,通過一系列預實驗成功確定了乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度和液料比的最佳取值范圍。在此基礎上,通過固定其他3個因素水平,分別改變乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度和液料比的水平,來考察這些變化對木耳菜總黃酮提取率的影響,以確定最佳的提取條件。

1.2.4 響應面實驗設計 因素編碼水平如表2所示。由表2可知,根據單因素實驗結果,選擇了4個自變量,以總黃酮提取率Y作為響應值,進一步使用Box-Behnken方法設計了一個包含4個因素和3個水平的響應面實驗方案。

表2 因素編碼水平Tab.2 Factor coding level

1.3 木耳菜總黃酮的抗氧化活性

1.3.1 DPPH自由基清除率 準確稱取一定質量的DPPH粉末,用體積分數為70%的乙醇配成100mg/L DPPH儲備液,并將其儲存在2～4℃的環境中。將2.0mL的木耳菜總黃酮提取液分別吸取到10mL容量瓶中,加入2mL質量濃度為100mg/L的DPPH儲備液到樣品中,搖勻后在暗處靜置30min。隨后,使用紫外-可見分光光度計測定其在510nm處的吸光度,記為Ai。接下來,取相同體積的木耳菜總黃酮提取液,將其中的DPPH儲備液用2.0mL無水乙醇代替,測得吸光度,記為Aj。將木耳菜總黃酮提取液替換成2.0mL無水乙醇,測得吸光度,記為A0。并以維生素C為陽性對照。DPPH自由基清除率R(%)計算公式如下:

1.3.2 OH自由基清除率 將2.0mL木耳菜總黃酮提取液分別吸取到10mL容量瓶中,先后加入6.0mmol/L FeSO4溶液、8.0mmol/L水楊酸溶液、8.8mmol/L H2O2溶液各2.0mL。搖勻后靜置30min,接著在510nm處測定其吸光度值,記為Am;再以蒸餾水替換上述H2O2溶液,測得吸光度值為An;以蒸餾水替換上述木耳菜總黃酮提取液,測得吸光度值為Ak。并以維生素C為陽性對照。OH自由基的清除率Q(%)計算公式如下:

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響如圖1所示。由圖1可知,乙醇體積分數為70%時,提取率最大。這是因為當乙醇體積分數較小時,乙醇中的水分含量相對較高,乙醇的溶劑力較強,但溶劑的極性也相對較大,使得一些脂溶性和醇溶性的黃酮類物質不能充分溶解在乙醇中,從而降低了提取率。而當乙醇體積分數過高時,同樣導致木耳菜中的一些非黃酮類脂溶性和醇溶性物質化合物的溶解和溶出,降低了黃酮的提取率[11]。因此,選擇乙醇體積分數為70%。

圖1 乙醇體積分數的影響圖2 超聲時間的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fractionFig.2 Effect of ultrasonic time

2.1.2 超聲時間對總黃酮提取率的影響 超聲時間對總黃酮提取率的影響如圖2所示。由圖2可知,超聲時間為30min時,提取率最大。這是因為當超聲時間較短時,植物細胞壁未能充分破壞,導致黃酮類化合物無法充分釋放,從而降低了提取率。然而,隨著超聲時間的延長,植物細胞結構受到更大程度的破壞,進一步提高了木耳菜中總黃酮溶解出來的數量,提高了提取率。然而,當超聲時間超過30min時,超聲波的高強度震蕩對總黃酮的分子結構造成一定程度的破壞,從而降低了提取率[12]。因此,選擇超聲時間為30min。

2.1.3 超聲溫度對總黃酮提取率的影響 超聲溫度對總黃酮提取率的影響如圖3所示。由圖3可知,超聲溫度為60℃時,提取率最大。這是因為當超聲溫度較低時,沒有足夠的熱能來促進總黃酮的釋放和溶解,總黃酮提取率較低。隨著超聲溫度的升高,黃酮類化合物分子的熱運動能量增加,擴散速率加快,從而增加了黃酮類化合物在溶劑中的溶解度,提高了總黃酮的提取率。然而,當超聲溫度超過60℃時,繼續增加溫度將導致部分黃酮類化合物化學鍵斷裂,分子結構也會發生改變,從而降低了黃酮類化合物的穩定性和可提取性[13]。因此,選擇超聲溫度為60℃。

圖3 超聲溫度的影響圖4 液料比的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperatureFig.4 Effect of liquid-material ratio

2.1.4 液料比對總黃酮提取率的影響 液料比對總黃酮提取率的影響如圖4所示。由圖4可知,液料比為40mL/g時,提取率最大。這是因為液料比較小時,溶劑的量相對較少,不能充分地覆蓋原料,導致超聲波無法充分地穿透和破壞原料細胞壁,影響了總黃酮的釋放和溶解。隨著液料比的增加,提取溶劑相對于樣品的比例增加,溶劑能更好地覆蓋樣品表面,使得樣品中的化合物被更容易地提取出來,有利于樣品中總黃酮的溶出。但液料比高于40mL/g時,樣品中總黃酮已經完全溶解出來,進一步增加液料比將無法提高總黃酮的提取率,反而會增加后續過濾、分離和濃縮等單元操作中總黃酮的損失[14]。因此,選擇液料比為40mL/g。

2.2 木耳菜總黃酮優化實驗及結果

2.2.1 響應面實驗設計及結果 使用Box-Behnken設計方法所得到的實驗設計方案和結果如表3所示。由表3可知,根據單因素實驗結果,選擇了乙醇體積分數(A)、超聲時間(B)、超聲溫度(C)和液料比(D)4個自變量,并以總黃酮提取率Y作為響應值。

表3 Box-Behnken實驗結果Tab.3 Experimental results of Box-Behnken

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析 使用Design-Expert 8.05b軟件對表3中的實驗數據進行了方差分析,以確定實驗因素對響應變量方差的貢獻程度,得到了回歸模型方程為Y=53.49+4.42A-1.24B+5.35C+3.05D+2.72AB-1.96AC+1.17AD+0.92BC-2.00BD-0.10CD-7.58A2-2.74B2-7.55C2-7.49D2。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

2.2.3 因素交互作用對木耳菜總黃酮提取率的影響 為了更直觀地觀察4個因素的交互作用,繪制了等高線圖和響應面圖,如圖5～10所示?？梢越柚憫婧偷雀呔€來評估各個因素之間的交互作用對結果的影響程度。如果響應面越陡峭、等高線越密集,說明各因素之間的交互作用對實驗結果產生較大的影響;反之,如果響應面較平緩、等高線較稀疏,則表示交互作用對實驗結果的影響較小[15]。

(a) 響應面圖 (b) 等高線圖圖5 乙醇體積分數與超聲時間的交互作用Fig.5 Interaction between ethanol volume fraction and ultrasonic time

由圖5可知,當乙醇體積分數固定時,木耳菜總黃酮的提取率隨著超聲時間的增加呈現先增加后降低的趨勢。同樣的,當超聲時間保持不變時,提取率隨著乙醇體積分數的增加先升高后降低。從響應面圖的陡峭程度和等高線圖的形狀可以看出,二者之間存在極顯著的交互作用。

由圖6可知,當乙醇體積分數固定時,木耳菜總黃酮的提取率隨著超聲溫度的增加呈現先增加后降低的趨勢。同樣的,當超聲溫度保持不變時,提取率隨著乙醇體積分數的增加先升高后降低。從響應面圖的陡峭程度和等高線圖的形狀可以看出,二者之間存在極顯著的交互作用。

(a) 響應面圖 (b) 等高線圖圖6 乙醇體積分數與超聲溫度的交互作用Fig.6 Interaction between ethanol volume fraction and ultrasonic temperature

由圖7可知,當乙醇體積分數固定時,木耳菜總黃酮的提取率隨著液料比的增加呈現先增加后降低的趨勢。同樣的,當液料比保持不變時,提取率隨著乙醇體積分數的增加先升高后降低。從響應面圖的陡峭程度和等高線圖的形狀可以看出,二者之間存在顯著的交互作用。

(a) 響應面圖 (b) 等高線圖圖7 乙醇體積分數與液料比的交互作用Fig.7 Interaction between ethanol volume fraction and liquid-material ratio

由圖8可知,當超聲時間固定時,木耳菜總黃酮的提取率隨著超聲溫度的升高呈現先增加后降低的趨勢。同樣的,當超聲溫度保持不變時,提取率隨著超聲時間的延長先升高后降低。從響應面圖的陡峭度和等高線圖的形狀可以看出,二者之間存在的交互作用不顯著。

(a) 響應面圖 (b) 等高線圖圖8 超聲時間與超聲溫度的交互作用Fig.8 Interaction between ultrasonic time and temperature

由圖9可知,當超聲時間固定時,木耳菜總黃酮的提取率隨著液料比的增加呈現先增加后降低的趨勢。同樣的,當液料比保持不變時,提取率隨著超聲時間的增加先升高后降低。從響應面圖的陡峭程度和等高線圖的形狀可以看出,二者之間存在極顯著的交互作用。

(a) 響應面圖 (b) 等高線圖圖9 超聲時間與液料比的交互作用Fig.9 Interaction between ultrasonic time and liquid-material ratio

由圖10可知,當超聲溫度固定時,木耳菜總黃酮的提取率隨著液料比的增加呈現先增加后降低的趨勢。同樣的,當液料比保持不變時,提取率隨著超聲溫度的升高先升高后降低。從響應面圖的陡峭程度和等高線圖的形狀可以看出,二者之間存在的交互作用不顯著。

(a) 響應面圖 (b) 等高線圖圖10 超聲溫度與液料比的交互作用Fig.10 Interaction between ultrasonic temperature and liquid-material ratio

2.2.4 回歸模型最優化驗證 經過使用響應面軟件進行優化后,得到了最優的木耳菜總黃酮提取工藝條件參數:乙醇體積分數為72.44%、超聲時間為28.61min、超聲溫度為63.13℃、液料比為42.39mL/g。模型預測顯示,木耳菜的總黃酮提取率可達到55.32mg/g。為了操作的便捷性,將最佳工藝參數微調為整數:乙醇體積分數為72%、超聲時間為29min、超聲溫度為63℃、液料比為42mL/g。在此條件下,進行3次平行實驗,實際得到木耳菜總黃酮的提取率為54.23mg/g,與理論最大值的相對誤差僅為1.97%,這說明回歸模型對于木耳菜總黃酮的提取率預測結果準確可靠。值得注意的是,經過響應面優化后,木耳菜總黃酮的提取率與響應面實驗中心點提取率最高的2組數據是一致的。通過比較均值,發現優化后的總黃酮提取率比中心點高0.74mg/g,即提高了1.38%,說明通過響應面優化可以獲得更高提取率的工藝參數,實現更高效的木耳菜總黃酮提取,為后續的研究和應用提供了有力支持。

2.3 木耳菜總黃酮的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除率 維生素C和木耳菜總黃酮對自由基的清除率如圖11所示。由圖11(a)可知,隨著木耳菜總黃酮質量濃度的增加,可以觀察到對DPPH自由基的清除率逐漸提高。實驗結果顯示,木耳菜總黃酮的半數抑制濃度值(IC50)為69.61mg/L。特別是當木耳菜總黃酮的質量濃度達到100mg/L時,其對DPPH自由基的清除率可達到68.67%,相當于維生素C的82.62%。說明木耳菜總黃酮具備一定的DPPH自由基清除能力,但相對于維生素C來說,其清除能力略低。

(a) DPPH自由基 (b) OH自由基圖11 維生素C和總黃酮對自由基的清除率Fig.11 Free radical scavenging rate of vitamin C and total flavonoids

2.3.2 OH自由基清除率 由圖11(b)可知,隨著木耳菜總黃酮質量濃度的增加,可以觀察到對OH自由基的清除率逐漸提高。實驗結果顯示,其IC50值為154.90mg/L。特別是當木耳菜總黃酮質量濃度為250mg/L時,觀察到對OH自由基的清除率可達到75.63%,相當于維生素C的86.97%。說明木耳菜總黃酮具備一定的OH自由基清除能力,但相對于維生素C來說,其清除能力略低。

綜上所述,木耳菜總黃酮具有顯著的抗氧化潛力,為其作為天然綠色抗氧化添加劑的應用提供了科學基礎和可行性。

3 結論

以木耳菜為原料,通過單因素實驗和響應面優化了木耳菜總黃酮的超聲波輔助提取工藝。實驗結果表明,最佳提取參數是乙醇體積分數為72%、超聲時間為29min、超聲溫度為63℃以及液料比為42mL/g。根據實際實驗數據,木耳菜總黃酮的提取率為54.23mg/g,相對誤差僅為1.97%,驗證了回歸模型的可靠性。此外,木耳菜總黃酮具有一定的自由基清除能力,對DPPH自由基、OH自由基的IC50值分別為69.61、154.90mg/L,相對于維生素C來說其清除能力略低。這項研究表明木耳菜總黃酮具有抗氧化潛力,為其作為天然綠色抗氧化添加劑的應用提供了科學基礎和可行性。