基于基因分型測序(GBS)技術的堇葉紫金牛遺傳結構分析

周鑫洋, 饒 盈, 夏國華, 馬丹丹, 陳濤梅, 姚熠涵

(1. 浙江農林大學林業與生物技術學院 浙江省森林芳香植物康養功能研究重點實驗室, 浙江 杭州 311300; 2. 浙江省杭州市臨安區天目山林場, 浙江 杭州 311311; 3. 浙江農林大學暨陽學院, 浙江 紹興 311800)

堇葉紫金?！睞rdisiaviolacea(T. Suzuki) W. Z. Fang et K. Yao〕隸屬于報春花科(Primulaceae)紫金牛屬(ArdisiaSw.),僅分布于浙江、臺灣和安徽[1],其種群呈島嶼狀間斷分布,是中國特有的瀕危植物[2]。因果實紅艷、掛果時間長,堇葉紫金牛具有很高的觀賞和應用價值。此外,堇葉紫金牛對研究中國大陸和臺灣植物區系演化、紫金牛屬的分組及系統發育具有重要的科研價值;該種還是紫金牛屬植物栽培育種及品種改良的野生基因庫,對維持紫金牛屬植物的遺傳多樣性具有重要意義。但由于生境片斷化以及自身的生理生態學特性,堇葉紫金牛野生居群更新受到嚴重干擾,居群數量急劇減少,因此,對其開展保護生物學研究已迫在眉睫。目前,對堇葉紫金牛瀕危機制的研究主要集中在種群結構特征[3-5]、繁殖技術[6-8]以及生理生態[9-10]方面,而關于遺傳結構方面的研究尚未見報道。

基因分型測序(genotyping by sequencing,GBS)技術是一種簡化基因組測序技術。雖然GBS技術不能深度覆蓋全基因組,但其具有測序通量高、成本低等優點[11-12]。GBS技術自2011年在玉米(ZeamaysLinn.)和大麥(HordeumvulgareLinn.)研究中首次應用以來[13],已經廣泛應用于資源分類、遺傳分析及基因定位等領域,在不實野燕麥(AvenasterilisLinn.)[14]、茶〔Camelliasinensis(Linn.) O. Ktze.〕[15]、稻(OryzasativaLinn.)[16]、硬粒小麥〔Triticumturgidumsubsp.durum(Desfontaines) Husnot〕[17]等植物中得到了應用。GBS技術結合全基因組關聯分析,有助于發現植物的新性狀及其相關變異來源,對后續優良品種的選育和改良具有指導意義[18]。

遺傳多樣性高低對瀕危植物能否長期存活具有重要影響[19],因此對瀕危植物遺傳多樣性的研究有助于了解物種遺傳背景,揭示物種瀕危機制。為此,本研究采用GBS技術對堇葉紫金牛13個野生居群77份樣本進行單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點挖掘,在此基礎上,對各居群的遺傳多樣性、系統發育樹、親緣關系等進行了分析,以期為堇葉紫金牛的物種保護和利用及種質資源保存提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

根據堇葉紫金牛野生資源的分布狀況和居群大小,以相鄰植株間隔超過20 m作為劃分居群的依據,在堇葉紫金牛全分布區內13個野生居群中共采集77份樣本,每個居群選取健康的成年植株,每株采集2～3枚健康幼嫩的葉片,液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。各居群基本信息見表1。

表1 堇葉紫金牛13個居群的基本信息Table 1 Basic information of 13 populations of Ardisia violacea (T. Suzuki) W. Z. Fang et K. Yao

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取與GBS文庫構建 采用Axyprep DNA提取試劑盒〔康寧生命科學(吳江)有限公司〕提取堇葉紫金牛DNA,采用質量體積分數2%的瓊脂糖凝膠電泳分析DNA完整性,采用Qubit 2.0熒光定量儀(美國賽默飛世爾科技公司)精確定量DNA濃度;用RsaⅠ和HaeⅢ將檢驗合格的DNA樣品酶切消化處理成小片段,小片段經過末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等過程完成GBS文庫制備。根據預設方案對文庫進行質量體積分數2%的瓊脂糖凝膠電泳后割膠純化,選擇目標區間內相應的文庫進入后續測序。文庫質檢合格后上機進行高通量測序,測序平臺為Illumina Nova 6000,測序模式為PE150。

1.2.2 基因組SNP位點挖掘 采用FastP 0.20.0軟件對測序得到的所有read進行質控,去除接頭,去除含有無法確定堿基信息的比例大于5%的read,去除低質量read(質量值Q小于等于10的堿基占比在20%以上),統計原始測序量、有效測序量、錯誤率在1%以下的堿基占比(Q20)、錯誤率在0.1%以下的堿基占比(Q30)、GC含量,并進行綜合評價,過濾后獲得clean data。之后對所有樣本的read進行聚類,將聚在一起的read作為1個標簽,并生成一致性序列。采用BWA 0.7.13軟件進行序列一致性比對,并使用GATK 3.8.1軟件和Samtools軟件共同進行SNP檢測。按照最小等位基因頻率大于0.05、數據完整度大于60%(即不超過40%個體基因型缺失)的標準對檢測到的SNP進行過濾。

1.3 數據分析

采用R語言擴展包Genepop v1.0.5計算觀測雜合度、多態信息含量、居群間的遺傳距離和遺傳分化系數;采用vcftools v0.1.14軟件計算核苷酸多樣性指數、Tajima’s D值、Shannon’s多樣性指數;采用MEGA 5.0軟件的Neighbor-joining法基于p-distance模型構建系統發育樹,自展重復抽樣次數為1 000次;采用Admixture 1.3.0軟件分析群體結構;采用EIENSOFT 6.0.1軟件進行主成分分析;采用SPAeDi 1.4軟件進行親緣關系分析;采用TreeMix v1.01軟件進行基因流分析。

2 結果和分析

2.1 SNP位點挖掘

分析結果顯示:77份堇葉紫金牛樣本共獲得421.37 G有效高質量測序數據,平均每份樣本獲得5.47 G有效數據,有效數據率98.9%。Q20值為96.0%～98.1%,均值為97.5%,Q30值為89.6%～94.0%,均值為92.7%;GC含量為40.5%～46.0%,均值為43.1%,表明測序數據質量較高,可以用于后續分析。77份樣本中獲得高質量序列最多的是浙江省杭州市臨安區順溪塢的1個居群(HLS2)的第1份樣本,有54 816 017條序列,最少的是安徽省黃山市祁門縣牯牛降(HQG)居群的第3份樣本,有21 527 449條序列。平均每份樣本獲得高質量序列36 557 933條,平均比對率為99.1%。

對測序數據進行分析,共獲得有效SNP位點246 307個,每份樣本檢測到SNP位點1 154～3 789個(均值為3 199)。浙江省杭州市臨安區順溪塢的另1個居群(HLS1)的平均SNP位點數最多,有3 652個,浙江省舟山市定海區蔡家岙(ZDC)居群的平均SNP位點數最少,僅有2 138個。77份樣本中有效SNP位點的雜合率為11.7%～37.0%,均值為26.6%;有效SNP位點的純合率為63.0%～88.3%,均值為73.5%。

2.2 遺傳多樣性分析

對篩選獲得的SNP位點進行統計分析,評價不同居群的遺傳多樣性,結果見表2。結果顯示:13個居群的觀測雜合度為0.156 9～0.428 9,均值為0.353 7,表明堇葉紫金?；蛘w穩定性較差;13個居群的多態信息含量為0.078 5～0.324 4,均值為0.263 4;核苷酸多樣性指數為0.000 2～0.000 7,均值為0.000 3,表明堇葉紫金牛的核苷酸多樣性較低;13個居群的Tajima’s D值為0.224 7～1.093 6,均大于0,表明堇葉紫金牛各居群受平衡選擇程度較高;13個居群的Shannon’s多樣性指數為0.217 5～0.664 9,均值為0.549 4,其中安徽省黃山市祁門縣牯牛降(HQG)、浙江省舟山市定海區蔡家岙(ZDC)和浙江省寧波市象山縣屠家園村(NXT)居群的Shannon’s多樣性指數較大,表明這3個居群的遺傳多樣性相對較高?？傮w來看,堇葉紫金牛遺傳多樣性水平偏低,各居群間遺傳多樣性存在一定差異。

2.3 系統發育樹分析

利用鑒定到的高質量SNP對堇葉紫金牛13個居群77份樣本進行系統發育樹分析,結果見圖1。結果顯示:77份樣本可分為6組,Ⅰ組包含浙江省杭州市臨安區順溪塢的2個居群(HLS1、HLS2)和浙江省杭州市西湖區云棲竹徑的2個居群(HXY1、HXY2)的所有樣本;Ⅱ組包含浙江省舟山市定海區蔡家岙(ZDC)居群的第1和第4份樣本及浙江省金華市永康市方山口村(JYF)居群的所有樣本;Ⅲ組包含安徽省黃山市祁門縣牯牛降(HQG)居群的所有樣本;Ⅳ組包含浙江省建德市壽昌林場(JSL)居群、浙江省杭州市淳安縣向陽村(HCX)居群和浙江省寧波市寧?？h歸云洞(NNG)居群的所有樣本;Ⅴ組包含浙江省舟山市定海區毛陳周(ZDM)居群的所有樣本;Ⅵ組包含浙江省寧波市象山縣屠家園村(NXT)居群和臺灣省臺北市北投區陽明山(TBY)居群的所有樣本及ZDC居群的第2、第3、第5份樣本。其中HCX、JSL、NNG、HQG、ZDC和TBY居群內樣本間的親緣關系較近,均能聚在一起;HLS1、HLS2居群間的個別樣本有嵌套,但作為一個整體,這2個居群的樣本也能聚在一起。ZDC居群5份樣本中的3份與NXT和TBY居群的樣本聚在一起,而ZDC居群的另2份樣本與JYF居群的樣本聚在一起,說明ZDC居群內遺傳分化比較大。

HLS: 浙江省杭州市臨安區順溪塢Shunxiwu, Lin’an District, Hangzhou City, Zhejiang Province; HXY: 浙江省杭州市西湖區云棲竹徑Bamboo-lined path at Yunqi, Xihu District, Hangzhou City, Zhejiang Province; JSL: 浙江省建德市壽昌林場綠荷塘林區Lühetang Forest District, Shouchang Forest Farm, Jiande City, Zhejiang Province; HCX: 浙江省杭州市淳安縣向陽村Xiangyang Village, Chun’an County, Hangzhou City, Zhejiang Province; HQG: 安徽省黃山市祁門縣牯牛降Guniujiang, Qimen County, Huangshan City, Anhui Province; JYF: 浙江省金華市永康市方山口村Fangshankou Village, Yongkang City, Jinhua City, Zhejiang Province; NNG: 浙江省寧波市寧?？h歸云洞Guiyun Cave, Ninghai County, Ningbo City, Zhejiang Province; NXT: 浙江省寧波市象山縣屠家園村Tujiayuan Village, Xiangshan County, Ningbo City, Zhejiang Province; ZDC: 浙江省舟山市定海區蔡家岙Caijia’ao, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; ZDM: 浙江省舟山市定海區毛陳周Maochenzhou, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; TBY: 臺灣省臺北市北投區陽明山Yangmingshan, Beitou District, Taipei City, Taiwan Province. 括號中數字為樣本編號The numbers in brackets are sample numbers.圖1 堇葉紫金牛13個居群77份樣本的系統發育樹Fig.. 1 Phylogenetic tree of 77 samples from 13 populations of Ardisia violacea (T. Suzuki) W. Z. Fang et K. Yao

2.4 主成分分析

基于SNP的主成分分析結果獲得堇葉紫金牛13個居群77份樣本的聚類情況,結果見圖2。結果顯示:根據PC1、PC2和PC3這3個主成分,可以將77份堇葉紫金牛樣本分為6組,浙江省杭州市臨安區順溪塢2個居群(HLS1、HLS2)和浙江省杭州市西湖區云棲竹徑2個居群(HXY1、HXY2)的所有樣本為一組;安徽省黃山市祁門縣牯牛降(HQG)居群的所有樣本和浙江省舟山市定海區蔡家岙(ZDC)居群的2份樣本為一組;浙江省金華市永康市方山口村(JYF)、浙江省建德市壽昌林場綠荷塘林區(JSL)、浙江省寧波市象山縣屠家園村(NXT)居群的樣本各單獨為一組;浙江省寧波市寧?？h歸云洞(NNG)、浙江省杭州市淳安縣向陽村(HCX)、浙江省舟山市定海區毛陳周(ZDM)和臺灣省臺北市北投區陽明山(TBY)居群的所有樣本及ZDC居群的3份樣本為一組。這與系統發育樹分析結果相近,但也存在一定的差異。

: HQG; : HCX; : HXY1; : HXY2; : JSL; : HLS1; : HLS2; : NNG; : TBY; : NXT; : JYF; : ZDC; : ZDM.HLS: 浙江省杭州市臨安區順溪塢Shunxiwu, Lin’an District, Hangzhou City, Zhejiang Province; HXY: 浙江省杭州市西湖區云棲竹徑Bamboo-lined path at Yunqi, Xihu District, Hangzhou City, Zhejiang Province; JSL: 浙江省建德市壽昌林場綠荷塘林區Lühetang Forest District, Shouchang Forest Farm, Jiande City, Zhejiang Province; HCX: 浙江省杭州市淳安縣向陽村Xiangyang Village, Chun’an County, Hangzhou City, Zhejiang Province; HQG: 安徽省黃山市祁門縣牯牛降Guniujiang, Qimen County, Huangshan City, Anhui Province; JYF: 浙江省金華市永康市方山口村Fangshankou Village, Yongkang City, Jinhua City, Zhejiang Province; NNG: 浙江省寧波市寧?？h歸云洞Guiyun Cave, Ninghai County, Ningbo City, Zhejiang Province; NXT: 浙江省寧波市象山縣屠家園村Tujiayuan Village, Xiangshan County, Ningbo City, Zhejiang Province; ZDC: 浙江省舟山市定海區蔡家岙Caijia’ao, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; ZDM: 浙江省舟山市定海區毛陳周Maochenzhou, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; TBY: 臺灣省臺北市北投區陽明山Yangmingshan, Beitou District, Taipei City, Taiwan Province.圖2 基于SNP主成分分析結果的堇葉紫金牛13個居群77份樣本的聚類Fig.. 2 Clustering of 77 samples from 13 populations of Ardisia violacea (T. Suzuki) W. Z. Fang et K. Yao based on SNP principal component analysis result

2.5 遺傳結構分析

遺傳結構分析結果(圖3)顯示:K=6時,交叉驗證誤差最小,且此時77份樣本的遺傳結構聚類清晰,表明堇葉紫金牛13個居群77份樣本的最優分組數為6。

HLS: 浙江省杭州市臨安區順溪塢Shunxiwu, Lin’an District, Hangzhou City, Zhejiang Province; HXY: 浙江省杭州市西湖區云棲竹徑Bamboo-lined path at Yunqi, Xihu District, Hangzhou City, Zhejiang Province; JSL: 浙江省建德市壽昌林場綠荷塘林區Lühetang Forest District, Shouchang Forest Farm, Jiande City, Zhejiang Province; HCX: 浙江省杭州市淳安縣向陽村Xiangyang Village, Chun’an County, Hangzhou City, Zhejiang Province; HQG: 安徽省黃山市祁門縣牯牛降Guniujiang, Qimen County, Huangshan City, Anhui Province; JYF: 浙江省金華市永康市方山口村Fangshankou Village, Yongkang City, Jinhua City, Zhejiang Province; NNG: 浙江省寧波市寧?？h歸云洞Guiyun Cave, Ninghai County, Ningbo City, Zhejiang Province; NXT: 浙江省寧波市象山縣屠家園村Tujiayuan Village, Xiangshan County, Ningbo City, Zhejiang Province; ZDC: 浙江省舟山市定海區蔡家岙Caijia’ao, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; ZDM: 浙江省舟山市定海區毛陳周Maochenzhou, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; TBY: 臺灣省臺北市北投區陽明山Yangmingshan, Beitou District, Taipei City, Taiwan Province. 括號中數字為樣本編號The numbers in brackets are sample numbers.圖3 堇葉紫金牛13個居群77份樣本的分組(A)及K=6時的遺傳結構分析(B)Fig.. 3 Cluster(A) and genetic structure analysis when K=6 (B) of 77 samples from 13 populations of Ardisia violacea (T. Suzuki) W. Z. Fang et K.

2.6 親緣關系分析

堇葉紫金牛77份樣本間的親緣關系分析結果見圖4。顏色越紅代表樣本間的親緣關系越近,同一居群內多個樣本間熱圖呈紅色說明這些樣本可能構成了一個親緣關系緊密的家系群體;反之,顏色越藍說明樣本間的親緣關系越遠。結果顯示:堇葉紫金牛居群內個體間的親緣關系較近。其中安徽省黃山市祁門縣牯牛降(HQG)居群內樣本間的親緣關系最近,浙江省寧波市象山縣屠家園村(NXT)、臺灣省臺北市北投區陽明山(TBY)、浙江省建德市壽昌林場綠荷塘林區(JSL)、浙江省舟山市定海區毛陳周(ZDM)居群內樣本間的親緣關系較近,而浙江省杭州市西湖區云棲竹徑2個居群(HXY1、HXY2)和浙江省杭州市臨安區順溪塢2個居群(HLS1、HLS2)居群內樣本間的親緣關系較遠。居群間的親緣關系與地理距離有一定的相關性,HLS1、HLS2、HXY1、HXY2居群間的親緣關系較近,但這4個居群與地理位置鄰近的HQG、浙江省杭州市淳安縣向陽村(HCX)、JSL居群的親緣關系均較遠。NXT、TBY和浙江省舟山市定海區蔡家岙(ZDC)居群間親緣關系較近;HCX居群與TBY、JYF和ZDC居群間親緣關系較遠。

HLS: 浙江省杭州市臨安區順溪塢Shunxiwu, Lin’an District, Hangzhou City, Zhejiang Province; HXY: 浙江省杭州市西湖區云棲竹徑Bamboo-lined path at Yunqi, Xihu District, Hangzhou City, Zhejiang Province; JSL: 浙江省建德市壽昌林場綠荷塘林區Lühetang Forest District, Shouchang Forest Farm, Jiande City, Zhejiang Province; HCX: 浙江省杭州市淳安縣向陽村Xiangyang Village, Chun’an County, Hangzhou City, Zhejiang Province; HQG: 安徽省黃山市祁門縣牯牛降Guniujiang, Qimen County, Huangshan City, Anhui Province; JYF: 浙江省金華市永康市方山口村Fangshankou Village, Yongkang City, Jinhua City, Zhejiang Province; NNG: 浙江省寧波市寧?？h歸云洞Guiyun Cave, Ninghai County, Ningbo City, Zhejiang Province; NXT: 浙江省寧波市象山縣屠家園村Tujiayuan Village, Xiangshan County, Ningbo City, Zhejiang Province; ZDC: 浙江省舟山市定海區蔡家岙Caijia’ao, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; ZDM: 浙江省舟山市定海區毛陳周Maochenzhou, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; TBY: 臺灣省臺北市北投區陽明山Yangmingshan, Beitou District, Taipei City, Taiwan Province. 括號中數字為樣本編號The numbers in brackets are sample numbers.圖4 堇葉紫金牛13個居群77份樣本間的親緣關系熱圖Fig.. 4 Heat map of genetic relationship between 77 samples from 13 populations of Ardisia violacea (T. Suzuki) W. Z. Fang et K. Yao

2.7 遺傳分化和基因流分析

結果(表3)顯示:堇葉紫金牛13個居群間的遺傳距離為0.059 0～0.393 8,遺傳分化系數為0.000 0～0.423 0,且大部分(80.8%)居群間的遺傳分化系數大于0.250 0,表明大部分居群間存在較高的遺傳分化。浙江省杭州市西湖區云棲竹徑2個居群(HXY1和HXY2)間及浙江省杭州市臨安區順溪塢2個居群(HLS1和HLS2)間的遺傳分化系數較小,遺傳距離較近,可能是由于這2個居群間的地理距離較小;而HXY1和HXY2居群與地理距離較遠的臺灣省臺北市北投區陽明山(TBY)居群和安徽省黃山市祁門縣牯牛降(HQG)居群間的遺傳分化系數均較大(均大于0.400 0),遺傳距離也較遠。說明堇葉紫金牛居群間遺傳分化系數與地理距離存在一定的相關性。

表3 堇葉紫金牛居群間的遺傳距離和遺傳分化系數1)Table 3 Genetic distance and genetic differentiation coefficient between populations of Ardisia violacea (T. Suzuki) W. Z. Fang et K. Yao1)

基因流分析結果(圖5)表明:浙江省寧波市象山縣屠家園村(NXT)、浙江省舟山市定海區毛陳周(ZDM)和浙江省舟山市定海區蔡家岙(ZDC)居群聚為一支;HXY1、HXY2和HLS2等居群聚為另一支;TBY和HQG居群間及浙江省寧波市寧?？h歸云洞(NNG)和浙江省杭州市淳安縣向陽村(HCX)居群間的遺傳關系較近。各居群間存在一定程度的基因交流。在NNG居群分化過程中向HXY2居群產生了基因遷移事件;在NNG和HCX居群分化形成的過程中,NXT居群與二者存在基因交流,此基因遷移事件的權重最大;并且在NXT、HLS2和ZDC居群形成的過程中也均受到外界基因遷移事件的影響。

HLS: 浙江省杭州市臨安區順溪塢Shunxiwu, Lin’an District, Hangzhou City, Zhejiang Province; HXY: 浙江省杭州市西湖區云棲竹徑Bamboo-lined path at Yunqi, Xihu District, Hangzhou City, Zhejiang Province; JSL: 浙江省建德市壽昌林場綠荷塘林區Lühetang Forest District, Shouchang Forest Farm, Jiande City, Zhejiang Province; HCX: 浙江省杭州市淳安縣向陽村Xiangyang Village, Chun’an County, Hangzhou City, Zhejiang Province; HQG: 安徽省黃山市祁門縣牯牛降Guniujiang, Qimen County, Huangshan City, Anhui Province; JYF: 浙江省金華市永康市方山口村Fangshankou Village, Yongkang City, Jinhua City, Zhejiang Province; NNG: 浙江省寧波市寧?？h歸云洞Guiyun Cave, Ninghai County, Ningbo City, Zhejiang Province; NXT: 浙江省寧波市象山縣屠家園村Tujiayuan Village, Xiangshan County, Ningbo City, Zhejiang Province; ZDC: 浙江省舟山市定海區蔡家岙Caijia’ao, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; ZDM: 浙江省舟山市定海區毛陳周Maochenzhou, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; TBY: 臺灣省臺北市北投區陽明山Yangmingshan, Beitou District, Taipei City, Taiwan Province.圖5 堇葉紫金牛13個居群間的基因流分析Fig.. 5 Analysis on gene flow among 13 populations of Ardisia violacea (T. Suzuki) W. Z. Fang et K. Yao

3 討論和結論

影響物種遺傳結構和遺傳多樣性的因子有很多,如生長環境[20]、分布區域[21]、種群數量以及繁殖系統特性[22]等,這些因子會影響物種對環境的適應能力[23]。本研究發現堇葉紫金牛的群體遺傳多樣性較低。蔡超男等[24]在研究瀕危植物海南風吹楠(HorsfieldiahainanensisMerr.)時發現,由于自身更新能力弱及受過度人為活動的影響,海南風吹楠群體呈現出遺傳多樣性低的現狀;桃兒七〔Sinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying〕[25]、長序榆(UlmuselongataL. K. Fu et C. S. Ding)[26]、領春木(EupteleapleiospermaJ. D. Hooker et Thomson)[27]等瀕危植物也有類似規律。而對伯樂樹(BretschneiderasinensisHemsl.)的研究發現,伯樂樹具有較豐富的遺傳多樣性[28],這可能與其分布范圍較廣、種群數量相對較多有關。相關研究表明:同屬的瀕危物種遺傳多樣性通常低于廣域分布種,如普陀鵝耳櫪(CarpinusputoensisCheng)遺傳多樣性低于疏花鵝耳櫪〔C.laxiflora(Siebold et Zucc.) Blume〕[29-30],五小葉槭(AcerpentaphyllumDiels)遺傳多樣性低于青榨槭(A.davidiiFranch.)[31-32]。本研究中,堇葉紫金牛13個居群整體遺傳多樣性偏低,同屬廣域分布種朱砂根(ArdisiacrenataSims)遺傳多樣性相對較高[33-34]。由此推斷遺傳多樣性低可能與瀕危植物分布范圍小、種群數量少有關,這可能是瀕危植物的共有特征。

遺傳分化系數是用于衡量居群間遺傳分化程度的重要指標[35]。一般而言,當遺傳分化系數大于0.25時,群體間遺傳分化程度高;遺傳分化系數小于0.05時,群體間遺傳分化程度低[36]。本研究中,堇葉紫金牛居群間遺傳分化系數多數大于0.25,說明堇葉紫金牛居群間遺傳分化程度較高。瀕危植物觀光木〔Micheliaodora(Chun) Nooteboom et B. L. Chen〕和金鐵鎖(PsammosilenetunicoidesW. C. Wu et C. Y. Wu)的遺傳分化系數(分別為0.375 2和0.452 9)[37-38]與堇葉紫金牛相近。瀕危植物遺傳分化程度通常高于廣域分布種,如紅砂〔Reaumuriasoongorica(Pall.) Maxim.〕和麻花秦艽(GentianastramineaMaxim.)的遺傳分化系數(分別為0.088和0.114)[39-40]明顯低于上述瀕危植物,相對于廣域分布種,瀕危植物的生境片段化現象較為嚴重,居群間存在地理隔離,受異質化生境的影響而產生分化。

堇葉紫金牛系統發育樹和主成分分析結果表明:整體表現為各居群內的樣本聚在一起,這主要是因為堇葉紫金牛果實較大,主要通過重力傳播,難以傳播到較遠的地方[5],因而居群間基因交流相對較少[41]。同時堇葉紫金牛也存在距離較遠的居群間的基因交流,浙江省杭州市臨安區順溪塢2個居群(HLS1、HLS2)和浙江省杭州市西湖區云棲竹徑2個居群(HXY1、HXY2)間的親緣關系較近,但相較于地理距離較遠的浙江省金華市永康市方山口村(JYF)和浙江省舟山市定海區蔡家岙(ZDC)居群,HLS1、HLS2、HXY1、HXY2居群與浙江省杭州市淳安縣向陽村(HCX)、安徽省黃山市祁門縣牯牛降(HQG)、浙江省建德市壽昌林場綠荷塘林區(JSL)居群間的地理距離更近,但親緣關系卻相對更遠;此外,浙江省寧波市象山縣屠家園村(NXT)和ZDC居群均與臺灣省臺北市北投區陽明山(TBY)居群存在較遠的地理距離,但這3個居群間親緣關系較近;HCX居群與TBY、JYF、ZDC居群有較近的親緣關系,推測這可能是由鳥類取食并傳播其種子所致。吸引鳥類傳播的果實(種子)通常具有成熟時顏色鮮艷、體積較小、數量較多、果期長等特點[42-43],如圓葉相思樹(AcaciacyclopsA. Cunn. ex G. Don)成熟時肉質假種皮橙紅色[44],紅豆杉〔Taxuschinensis(Pilger) Rehd.〕肉質假種皮紅色[45],而紅色、橙色等顏色對鳥類具有視覺吸引的效果[46],這些顏色的果實通常是鳥類取食的偏好對象。堇葉紫金牛果實顏色紅艷,掛果時間10月至12月,符合鳥類秋冬季取食的偏好特征,因此可能存在鳥類傳播擴散種子的現象。

堇葉紫金牛居群面積0.01～0.80 hm2,各居群間地理距離較遠,生境片段化現象較為嚴重,加劇了居群內個體數量的減少,導致居群內近交幾率增加,從而使遺傳多樣性降低。雖然堇葉紫金牛居群間存在較遠距離的基因遷移,對居群間遺傳多樣性的提高具有一定作用,但對于堇葉紫金牛居群衰退的現狀難以起到較大的影響。因此,針對堇葉紫金牛遺傳多樣性降低,應優先保護HQG、NXT和ZDC這3個遺傳多樣性較高的居群,建立優先保護單元;應制定相應的原地保存與遷地保存策略,減少人為干擾,保護現有野生群體;開展堇葉紫金牛相關的繁育工作,通過人工輔助的手段來維持并擴大居群數量,從而更好地保護其遺傳多樣性。