長鏈非編碼RNA-LINC00467調控代謝重編程對肺腺癌增殖及遷移的影響

張 萌,奚欣然,李泳華,汪向海

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 呼吸內科,安徽 蕪湖 241001)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要病理類型,肺腺癌(lung adenocarcinoma,LAD)占NSCLC的大部分。近年來肺癌的診斷和治療取得了重大進展[1],但LAD患者的生存堪憂,只有約15%的患者在診斷后存活5年[2]。因此,迫切需要尋找新的生物標志物和治療策略來改善LAD的治療。

研究表明,長鏈非編碼RNA00467(long intergenic non-coding RNA00467,LINC00467)與許多臨床特征有關,并已被探索為致癌性。LINC00467通過肺癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、骨肉瘤等不同癌的多種分子和信號通路促進腫瘤的發展和進展[3-7]。LINC00467也被認為是疾病診斷、預后和治療中的潛在生物標志物。

癌細胞在腫瘤生長微環境中需要獲得與正常細胞不同的代謝狀態,才能增殖、侵襲和轉移。在癌細胞生長過程中,癌細胞會遇到各種代謝應激,癌細胞會根據各種代謝應激改變自己的微環境狀態。首先,與原發部位的非腫瘤組織相比,腫瘤細胞所生長的微環境通常是缺氧和酸性的,并且具有獨特的營養成分,這樣,癌細胞才能在微環境中更好地生長入侵。其次,為了更快進入血管,在血管中得以存活和生長,癌細胞必須重新編程其代謝狀態,改變其能量代謝水平,允許錨定性生長,從而在癌細胞中誘導廣泛的氧化應激。最后,一旦癌細胞定植于其他器官,它們必須讓自己適應與原發部位不同的代謝微環境,這樣才能更快增殖遷移[8]。由于癌細胞在癌癥進展中都需要重新編程其代謝狀態,因此代謝重編程已被公認為癌癥的標志之一。本研究對LINC00467影響調控能量代謝的現象進行描述,發掘代謝重編程在臨床治療中的潛在價值。

1 材料和方法

1.1 材料 肺癌細胞系(A549和H1299)和正常人支氣管上皮細胞系(16HBE)均由東部戰區總醫院呼吸內科實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染 肺癌細胞A549和H1299在含有10%胎牛血清(Gibco,USA)的RPMI-1640(Gibco,USA)中于37℃和5%CO2的培養箱中培養。設計并合成敲降LINC00467的慢病毒shRNA(shRNA-LINC00467)。根據漢恒生物轉染試劑(HANBIO)的說明書,在大約60%的匯合處用shRNA轉染細胞。

1.2.2 實時定量PCR(qRT-PCR) 取Trizol 500 μL加入6孔板中反復吹打混勻,吸入1.5 mL離心管中,加入200 μL的三氯甲烷,離心,取上清加入500 μL異丙醇,顛倒混勻再次離心,倒掉上液保留沉淀,加入乙醇再次離心,棄去上清,加入DEPC水20 μL。在cDNA合成試劑盒進行逆轉錄轉錄成cDNA。qRT-PCR用QuantiNovaTMSYBR?Green PCR Kit(Qiagen,Hilden,Germany)進行上機檢測。LINC00467的引物,正向(5′-3′):GCGTAGGCCGGACATTTCTA;反向(5′-3′):CACCAAGGTTCAGCAGATCCGC。用△△ct法計算LINC00467表達的差異。

1.2.3 Western blot 收集6孔板中的細胞在裂解緩沖液中裂解15～30 min,使用細胞刮把細胞刮下來,收集于1.5 mL離心管中,離心后取上清,用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度,加入上樣緩沖液,混合完全后封口煮沸10 min。蛋白質樣品用SDS-PAGE電泳分離,蛋白質轉移到NC膜上。在室溫下用5%BSA將膜封閉2 h,然后在4℃下用稀釋的一抗孵育過夜。洗膜3次,每次10 min,之后在室溫下使用二抗孵育2 h。再次洗膜3次,每次10 min。用ECL溶液曝光觀察印跡。

1.2.4 平板克隆實驗 使用細胞計數儀按1 000個/孔進行細胞計數,將轉染處理后的癌細胞培養在6孔板中,然后加入新培養基,培養2周。4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min。PBS清洗3次,結晶紫染色30 min,PBS清洗3次。結果用ImageJ軟件進行分析。

1.2.5 Transwell實驗 在24孔板的孔中放置Transwell小室,在上室中接種2×104個體積為200 μL的細胞,在下室中加入600 μL RPIM 1640培養基(含10%FBS)。孵育24 h后,用PBS沖洗1遍,4%多聚甲醛固定30 min,結晶紫溶液染色30 min,用PBS緩沖液沖洗后,用棉簽輕輕拭去水分,進行拍照。

1.2.6 流式細胞術 使用細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率。轉染48 h后收集細胞,冷PBS清洗細胞2遍,400 μL 1× Annexin V結合液重懸細胞,加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻后于2～8℃避光下孵育15 min,加入5 μL PI混勻后2～8℃避光孵育2～5 min(每個細胞系都設有FITC單染、PI單染和空白對照來調試畫門)。立即用流式細胞儀檢測凋亡率。

1.2.7 乳酸含量檢測 收集細胞,向細胞中加入提取液1,冰浴超聲機破碎細胞后12 000 r/min離心10 min,取上清,加入提取液2,再次離心取上清,按照加樣表格分別按量加樣,并在570 nm處測定吸光度,LA含量根據公式計算。

1.2.8 ATP水平檢測 棄去原培養液,按照每孔200 μL的ATP裂解液加入裂解細胞,反復吹打,裂解后4℃ 12 000 r/min離心5 min取上清,用ATP檢測裂解液將ATP標準溶液稀釋至濃度:0.1、1、10 μmol/L,在黑色96孔板中加入100 μL ATP檢測工作液,室溫放置5 min,在黑色96孔板中加入20 μL樣品及標準品,混勻,用多功能化學發光酶標儀測定RUL值,根據標準曲線計算樣品中的ATP含量,樣品用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,將ATP結果換算成nmol/mg蛋白形式。

2 結果

2.1 LINC00467在LAD中的表達較高 本研究在TCGA和GTEX數據庫中分析了LAD和癌旁組織中的表達,與正常癌旁組織相比,LAD組織中LINC00467表達水平較高(t=35.516,P<0.001)(圖1A)。qRT-PCR結果表明,LAD細胞株A549和H1299中LINC00467的表達均高于人支氣管上皮肺泡細胞株16HBE(P<0.01)(圖1B)。

A.正常組織和LAD組織中LINC00467的表達水平;B.LINC00467在不同細胞系中的表達水平(F=714.100,P<0.001),與16HBE組比較,**P<0.01,***P<0.001。

2.2 敲降LINC00467可以抑制LAD細胞的增殖和遷移 shRNA慢病毒穩定轉染LAD細胞系,通過熒光顯微鏡和qRT-PCR驗證shRNA的敲降效率(t=8.362、6.919,P<0.001)(圖2A、B)。平板克隆實驗表明,敲降LINC00467表達后H1299和A549細胞增殖活力降低(t=3.606、4.625,P<0.05)(圖2C、D)。Transwell實驗顯示敲降LINC00467表達,H1299和A549細胞遷移能力降低(t=7.411、5.935,P<0.01)(圖2E、F)。流式細胞術檢測結果表明,敲降LINC00467組的H1299和A549的凋亡細胞增多(t=7.814、7.078,P<0.01)(圖2G、H)。

A.慢病毒轉染后的熒光圖;B.qRT-PCR驗證LINC00467的敲降效率;C.平板克隆圖;D.平板克隆統計分析;E.Transwell小室圖;F.小室統計分析;G.流式細胞凋亡圖;H.流式凋亡分析。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.3 敲降LINC00467可以抑制代謝相關蛋白己糖激酶2(Hexokinase2,HK2)和葡萄糖轉運體1(Glucose transporter1,GLUT1)的表達 Western blot結果顯示,與對照組相比,敲降LINC00467組可以抑制GLUT1和HK2的表達水平(t=19.510、26.940、10.160、13.950,P<0.001)(圖3)。

A.GLUT1和HK2的蛋白電泳圖;B.GLUT1和HK2的蛋白表達水平。***P<0.001。

2.4 敲降LINC00467可以明顯降低乳酸含量和ATP水平 ATP檢測試劑盒和乳酸含量檢測試劑盒檢測結果顯示,敲降LINC00467組的H1299和A549細胞的乳酸含量降低(t=11.540、6.805,P<0.001)(圖4A)和ATP含量降低(t=6.418、5.994,P<0.001)(圖4B)。

A.敲降LINC00467后的乳酸水平;B.敲降LINC00467后的ATP水平。***P<0.001。

3 討論

長鏈非編碼RNA參與RNA穩定性、剪切加工、表觀遺傳調節和基因轉錄,在細胞生物學過程中發揮重要作用。LINC00467具有4個轉錄本,全長3 508 bp,屬于基因間長鏈非編碼RNA[9]。研究發現LINC00467在LAD組織中表達明顯上調,并促進了LAD細胞的遷移和侵襲[10]。

代謝重編程是一種廣泛存在腫瘤細胞中的生物學現象。越來越多的證據表明,LINCRNA可以與癌基因相互作用,也可以與抑癌基因相互作用,從而調節腫瘤細胞的能量代謝水平[11-14]。腫瘤發生發展過程中,癌細胞生長不僅需要大量ATP,癌細胞還允許糖酵解中間產物穿梭到幾個生物合成途徑中,產生核苷酸、NADPH、脂質和非必需氨基酸等物質,為合成大分子物質提供所需要的底物或中間體。同時,糖酵解還能夠生成有助于細胞增殖的小分子前體或中間體,比如乙酰輔酶A、非必需氨基酸的中間體、核糖等物質,以此滿足DNA快速復制的需要[15]。乳酸是癌細胞發生糖酵解最常見的產物,當乳酸堆積在細胞外基質中,并降低其酸堿度時,酸性的環境更加促進癌細胞的侵襲和轉移[16-18]。因此,本研究對LINC00467影響調控能量代謝的現象進行描述,發掘代謝重編程在臨床治療中的潛在價值。

本研究首先使用qRT-PCR檢測LINC00467在16HBE和兩種LAD細胞株(A549和H1299)中的表達,結果發現癌細胞中的LINC00467水平高于正常細胞,為了進一步探究LINC00467的功能,我們使用平板克隆實驗檢測細胞增殖能力,Transwell實驗檢測了細胞的遷移能力,流式細胞術檢測了細胞的凋亡率。結果發現,敲降LINC00467后細胞的增殖和遷移能力降低、凋亡比例增加。這些結果都提示LINC00467在LAD中扮演著促癌基因的角色。為了發掘LINC00467調控癌細胞代謝的能力,使用ATP檢測試劑盒和乳酸檢測試劑盒檢測癌細胞,結果顯示,敲降后細胞的ATP水平和乳酸含量明顯降低,使用Western blot實驗驗證GLUT1和HK2的表達水平,結果表明,敲降LINC00467后癌細胞的GLUT1和HK2水平顯著降低。這些結果都表明,LINC00467通過介導能量代謝重編程進而影響LAD細胞的增殖和遷移。

綜上所述,我們發現敲降LINC00467可以降低LAD的能量代謝水平,從而降低LAD細胞的增殖及遷移能力。本研究存在不足之處,關于LINC00467如何調控代謝重編程的機制的闡述證據支持不足,希望能在后續的研究中進行補充完善?？傊?LINC00467對于LAD能量代謝的調控作用可以為未來靶向治療提供新的思路,具有一定的臨床研究價值。