TREM2促進心肌梗死后心肌細胞再生的機制研究

錢陳慧鈺,黃子鑒,傅 聰

(1.皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 心內科,安徽 蕪湖 241001;2.皖南醫學院 麻醉學實驗實訓中心,安徽 蕪湖241002)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)在全球范圍內的發病率逐年升高,也是造成居民死亡的主要因素之一。既往的觀點認為心肌細胞是終末期細胞,無法再生。但隨著近年來研究的不斷深入,心肌細胞是終末期細胞這一觀點不斷受到挑戰。越來越多的研究認為心肌細胞在特定的微環境下可以重新進入細胞周期,開始有絲分裂[1-2]。因此,闡明心肌細胞再生的機制和關鍵作用靶點對改善心肌梗死(myocardial infarction,MI)后心肌細胞凋亡,恢復心臟收縮功能,進而改善患者的心功能具有重要意義[3]。

髓系細胞觸發受體2(triggering receptor expressed on myeloid cells-2,TREM2)屬于免疫球蛋白超家族的跨膜受體。在小鼠肺缺血再灌注損傷模型中,TREM2可以作為一種保護性因子參與調控早期炎癥反應的發生發展過程[4]。之前的研究發現TREM2可預防缺血性心肌損傷,促進MI后的心肌細胞存活[5]。因此,本研究旨在探討TREM2在MI后發揮心臟保護作用的機制。

細胞周期素A2(CyclinA2)是調控細胞有絲分裂的關鍵蛋白,從S期到早期有絲分裂都高表達。通過激活細胞周期蛋白依賴性激酶Cdk1和Cdk2促進有絲分裂的啟動[6]。有研究表明將CyclinA2基因遞送到梗死的豬心臟會引起心肌細胞有絲分裂增加、心肌細胞數量增加和纖維化減少[7]。為此,本研究通過MI患者臨床血漿樣本檢測和小鼠MI模型探討MI后TREM2是否可以通過CyclinA2促進心肌細胞再生。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠,8～10周齡,質量20～25 g,購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。許可證號為SCXK(蘇)2018-000。TREM2-/-小鼠購自南京模式動物研究所。小鼠飼養于SPF級動物房(12 h∶12 h光照下飼養,可以自由獲取食物和水)。

1.2 主要試劑 HE染色試劑盒和Masson三色染色試劑盒購自北京Solarbio公司;BCA檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所;β肌動蛋白(β-actin)抗體購自biosharp生物有限公司;CyclinA2抗體購自美國R&D公司;PrimeScriptTM RT試劑盒和TB Green Premix Ex Taq試劑盒購自日本TAKARA公司;TREM2、CyclinA2和β-actin引物由上海生物工程有限公司設計合成。

1.3 TREM2血漿濃度檢測 采集弋磯山醫院心內科住院的經冠狀動脈造影(CAG)確定的10例MI患者外周靜脈血,8名年齡與性別匹配的無冠心病患者作為對照組。使用人TREM2 SimpleStep ELISA試劑盒(Abcam,英國)檢測血漿TREM2濃度。

1.4 MI模型的建立和實驗分組 將C57BL/6小鼠隨機分為對照組、假手術組、野生型小鼠MI組和TREM2-/-小鼠MI組,每組6只小鼠。采用左前降支(LAD)永久結扎法建立AMI模型[8]。通過腹腔注射戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉并插管。在第4肋間打開胸腔,暴露心臟。用7-0縫線在距左心耳2～3 mm處結扎LAD,左心室前壁蒼白,心臟跳動減弱表明AMI誘導成功。

1.5 取材及指標檢測

1.5.1 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測心肌組織中TREM2和CyclinA2 mRNA表達水平 使用Trizol試劑從心臟組織中分離總RNA,通過逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為互補DNA(cDNA)。內參為β-actin。采用2-△△Ct法對目的基因的相對表達水平進行計算。引物序列為TREM2(正向引物:CTACCAGTGTCAGAGTCTCCGA,反向引物:CCTCGAAACTCGATGACTCCTC)、CyclinA2(正向引物:TTGTAGGCACGGCTGCTATGCT,反向引物:GGTGCTCCATTCTCAGAACCTG)和β-actin(正向引物:AGAGGGAAATCGTGCGTGAC,反向引物:AGGAAG-AGGATGCGGCAGT)。

1.5.2 免疫蛋白印跡(Western blot)法檢測心肌組織中蛋白表達 用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液提取心肌組織總蛋白。BCA法測定蛋白質總濃度后,將蛋白質(30 μg)變性并通過15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉膜1 h,TBST洗膜3次(每次10 min)后。將膜與β-actin一抗以1∶1 000稀釋后在4℃下孵育過夜(12～16 h),然后將HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶40 000)與膜在常溫孵育1 h。將膜與CyclinA2一抗以1∶400稀釋后在4℃下孵育過夜,然后將HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗(1∶40 000)與膜在常溫孵育1 h。ECL化學發光底物顯影后用Tanon 5200發光成像系統捕獲圖像,用Image J軟件計算條帶灰度值。

1.5.3 HE染色和Masson染色檢測 心肌組織病理學變化腹腔注射過量戊巴比妥(130 mg/kg)后斷頸處死,生理鹽水灌流后,取結扎線下方的左心室組織。4%多聚甲醛固定48 h后,經梯度脫水后石蠟包埋和切片(厚度5 μm)。切片在60℃烘箱中烤片2 h,冷卻至室溫后進行常規HE染色和Masson染色。用光學顯微鏡觀察組織損傷,Image J計算心肌病變程度和纖維化面積。

2 結果

2.1 冠心病患者血漿中TREM2濃度升高 冠心病患者的血漿TREM2水平高于健康對照組,兩組數據符合正態分布,差異有統計學意義(t=2.592,P=0.020)(圖1)。

與對照組比較,*P<0.05。

2.2 PCR結果證明梗死后第2天心肌中CyclinA2表達最高 RT-PCR結果顯示,MI后1、2、3 d,心肌組織中的TREM2 mRNA表達逐漸增加(P<0.05)(圖2A),CyclinA2在梗死后第2天mRNA表達量達到高峰(P<0.05)(圖2B)。

A.心肌組織中的TREM2 mRNA表達隨時間變化情況;B.心肌組織中的CyclinA2表達隨時間變化情況。與對照組比較,***P<0.001;與1 d比較,###P<0.001;與2 d比較,△P<0.05。n=6,FA=81.350,PA<0.001;FB=46.650,PB<0.001。

2.3 心肌組織CyclinA2蛋白表達水平 Western blot對各組小鼠心肌組織中CyclinA2蛋白表達水平進行半定量分析。分為對照組、假手術組、C57和TREM2-/-小鼠MI后第2天梗死區和梗死邊緣區。如圖3所示,與對照組相比,C57小鼠梗死區和梗死邊緣區心肌中CyclinA2蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)。TREM2-/-梗死區心肌中CyclinA2蛋白表達水平較C57梗死區減少(P<0.05),此外TREM2-/-梗死邊緣區心肌中CyclinA2蛋白表達水平較C57梗死邊緣區減少(P<0.05)。

2.4 各組小鼠心肌組織損傷比較 HE染色結果顯示(圖4),對照組和假手術組心肌細胞形態規則,心肌纖維排列整齊,無明顯水腫和炎性細胞浸潤;與對照組相比,C57和TREM2-/-MI組小鼠心臟中可見心肌細胞排列紊亂、腫脹、數量減少,心肌纖維出現斷裂,炎性細胞浸潤明顯(C57MI:P=0.044;TREM2-/-MI:P=0.000);與C57組相比,TREM2-/-小鼠心臟心肌細胞排列紊亂、數量減少,炎性細胞浸潤增加,心肌損傷加重(t=4.781,P=0.001)。病理評分根據半定量量表分級:0=無病變;1=涉及25%心肌的病變;2=累及25%～50%心肌的病變;3=累及50%～75%心肌的病變;4=累及75%～100%心肌的病變[9]。Image J計算各組心肌病變程度得到相應的評分。

與對照組比較,*P<0.05,***P<0.001;與C57MI組比較,##P<0.01。n=6,比例尺:50 μm;H=22.181,P<0.01。

2.5 Masson染色顯示各組小鼠梗死邊緣區心肌纖維化程度 Masson染色顯示(圖5),假手術組膠原纖維網保持完好,規律地排列在心肌細胞之間;MI組在梗死邊緣區可見大量心肌細胞壞死并被膠原纖維替代,心肌纖維化明顯(P<0.001),殘留的心肌細胞數目少且排列紊亂;TREM2-/-MI組心臟梗死邊緣區膠原纖維較C57MI組明顯增多(P<0.001),纖維化程度加重。

與假手術組比較,***P<0.001;與C57MI組比較,###P<0.001。n=6,比例尺:100 μm;F=165.300,P<0.001。

3 討論

MI后大量心肌細胞凋亡引起的心力衰竭是MI后主要的并發癥。目前很多研究表明干細胞療法[10]和外泌體療法[11-12]可能是心臟修復和再生的新方法。有大量研究表明向梗死心肌輸送干細胞可以促進心臟修復,預防或逆轉心室重塑[13]。外泌體療法作為一種無細胞療法減少了干細胞療法中輸入不良細胞的可能性,但是干細胞療法和外泌體療法的確切療效還有待于進一步證實,目前尚無法運用于臨床。

既往研究提示TREM2在循環系統中可以發揮多種保護作用。動物模型研究發現TREM2可以減輕高血壓小鼠的炎癥反應和神經元凋亡[14]。此外,心臟中存在一類高表達TREM2的巨噬細胞亞群,可以識別并吞噬損傷的線粒體,在維持心臟代謝平衡中起到了重要的作用[15]。本課題組前期研究還發現心臟高表達TREM2的小鼠MI后心肌細胞存活率升高,梗死面積減小。提示TREM2可通過不依賴巨噬細胞的途徑直接增強缺血性損傷時心肌細胞的抗凋亡能力[5]。本研究發現,MI患者TREM2血漿濃度較健康對照組顯著增加。野生型小鼠MI后心臟中TREM2和CyclinA2 mRNA表達水平增加,TREM2在MI后1、2、3 d逐漸增加,而CyclinA2在MI后第2天心臟表達達到高峰?？赡艿脑蚴堑蛲鲂募〖毎麃碓吹腡REM2可以促使梗死邊緣區心肌細胞表達CyclinA2。

CyclinA2在DNA復制和轉錄中發揮著重要的作用,調節細胞周期并且促進成年心肌細胞增殖和心肌再生[16]。原代大鼠心肌細胞體外轉染CyclinA2基因后,心肌細胞有絲分裂指數明顯升高,且多數細胞形成雙核[17]。本研究發現TREM2基因敲除后梗死區和梗死邊緣區CyclinA2的蛋白表達水平明顯減少,梗死區炎癥細胞浸潤增加,梗死邊緣區膠原纖維含量顯著增加,纖維化程度增加。這進一步表明了TREM2可能通過激活心肌細胞CyclinA2的表達,在MI后通過增加心肌細胞再生發揮心臟保護作用。

本研究表明,MI后盡管梗死區出現大量心肌細胞死亡,但是心臟啟動自我修復機制,通過TREM2激活梗死邊緣區心肌細胞CyclinA2的表達,促進梗死邊緣區的心肌細胞重新進入細胞周期。本研究的發現有利于進一步闡明TREM2作為一種保護性因子參與MI后心臟修復的分子機制。但是TREM2引起激活心肌細胞CyclinA2表達增加的具體機制有待深入研究。