哈茨木霉WF2 菌株鑒定及對煙草黑脛病的防效

危 瀟，黎妍妍，姚經武，曹春霞，黃大野

（1.湖北省生物農藥工程研究中心/國家生物農藥工程技術研究中心/農業農村部微生物農藥創制重點實驗室，武漢 430064；2.湖北工業大學，武漢 430068；3.湖北省煙草科學研究院，武漢 430030）

木霉菌（Trichodermasp.）作為一類重要的生防真菌，廣泛存在于自然界中，通常定居在腐爛的木材和其他形式的有機基質中，具有分布廣、適應性強、繁殖快等特點［1，2］。木霉屬包括多個菌種，有超過400 多個種類［3］。在農業防治上，常用的有綠木霉（T.virens）、長枝木霉（T.longibrachiatum）、綠色木霉（T.viride）、康寧木霉（T.koningii）、哈茨木霉（T.harzianum）、棘孢木霉（T.asperellum）、深綠木霉（T.atroviride）、蓋姆斯木霉（T.gamsii）等［3］。它既可以作為生物防治劑，也可以作為生物促進劑。木霉可以使用多種復雜的直接和間接生物防治機制［4］來防治多種植物病害，既可以對抗生物脅迫如廣譜病原微生物（真菌、細菌、昆蟲和線蟲）等，也可以對抗非生物脅迫如惡劣的環境條件等。對病原體的直接影響包括細胞壁降解酶（CWDEs）的產生、抗生素的合成、對空間和營養物質（主要是碳、氮和鐵）的競爭以及與真菌病原體建立直接的寄生關系［4］。

煙草是中國重要的經濟作物，但煙葉生產主要依賴化學農藥防治土傳病害，長期使用化學農藥易導致病原菌抗藥性增強，同時還會造成環境污染［5］。因此，需探索出綠色、有效的煙草土傳病害防治方法。與化學農藥相比，生物農藥具有高效、選擇性強、低殘留、不易產生抗藥性等優點。在環境保護、綠色發展等理念的支持下，生物農藥已成為生物防治領域的研究熱點［5］。

本研究從湖北省五峰縣煙田土壤中分離獲得1株木霉，通過生物學特征分析和分子生物學手段鑒定其種類，并采用對峙試驗和活體盆栽試驗測定其對煙草黑脛病菌和煙草根腐病菌，即煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的生防效果，為利用綠色環保的生物農藥防治煙草病害提供應用基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料及培養基

供試木霉菌株WF2 分離自湖北省五峰縣煙田土壤樣品。供試病原真菌煙草疫霉和尖孢鐮刀菌由湖北省生物農藥工程研究中心提供。供試煙草為云煙87。培養基為馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDA）培養基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 L、pH 自然；馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDB）培養基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L、pH 自然；V8培養基：V8 汁220 mL、碳酸鈣2 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 L，pH 自然；發酵培養基：麩皮50 g、蒸餾水50 g、pH 自然。

1.2 哈茨木霉的分離純化培養

稱取10 g 土壤樣品，加入90 mL 無菌水，室溫下150 r/min 振蕩培養30 min。吸取上清液，采用10 倍梯度稀釋法分離木霉［6］，每個PDA 培養基平板上均勻涂布100 μL 土壤稀釋液。培養4～5 d，在稀釋液平板上挑取單菌落在PDA 培養基上進行純化培養，重復3～4 次后得到純化菌株，編號WF2。

1.3 哈茨木霉的系統分類學鑒定

1.3.1 木霉菌株的形態學觀察 將分離純化后的菌株WF2 接種于PDA 培養基上，28 ℃恒溫避光培養7 d，每24 h 觀察菌落形態（包括顏色、質地等）［7］。

1.3.2 木霉菌株的分子生物學鑒定 對分離到的菌株進行ITS-PCR 擴增，所用引物為通用引物ITS1（5'TCCGTAGGTGAACCTGCCG3'）和ITS4（5'TCCT CCGCTTATTGATATGC3'）。PCR 擴增體系為：DNA模板1 μL、2×PCR Master Mix 25 μL、引物ITS1 和ITS4 各1 μL、ddH2O 22 μL。擴增條件為：94 ℃預熱5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃復性10 min，擴增產物在4 ℃條件下保存。取5 μL擴增產物與1 μL Loading buffer混勻，加入1%瓊脂糖凝膠孔中，用DNA Marker 作對照，在1×TAE 電泳緩沖液中電泳，以凝膠成像系統檢測PCR 擴增產物，委托測序公司測序。運用MEGA 11 軟件，使用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ法）構建系統發育樹，同時計算遺傳距離。

1.4 哈茨木霉WF2 離體抑菌活性測定

參考田淼等［8］的研究方法，使用無菌打孔器（直徑5 mm）在WF2 菌株和病原真菌的菌落邊緣打取菌餅，用于對峙培養。處理組，將菌株WF2 的菌餅和病原真菌的菌餅分別接種至PDA 平板（直徑90 mm）上，二者之間的距離為45 mm。對照組，只接種病原真菌。28 ℃恒溫避光培養，每組3 次重復。10 d 時觀察并用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率，計算式如下。

競爭作用測定。使用覆蓋度表示木霉菌株對目標病原真菌的寄生能力，參照陳書華等［9］的方法對木霉拮抗系數進行分級，Ⅰ級：木霉菌菌絲覆蓋率100%；Ⅱ級：木霉菌菌絲覆蓋率≥2/3；Ⅲ級：1/3≤木霉菌絲覆蓋率＜2/3；Ⅳ級：木霉菌菌絲覆蓋率＜1/3；Ⅴ級：病原菌菌絲覆蓋率100%。

1.5 木霉對煙草疫霉的盆栽防效試驗

1.5.1 木霉菌劑的制備 使用無菌打孔器（直徑5 mm）在WF2 菌株的菌落邊緣打取菌餅，在每瓶PDB 培養基中放置1 塊菌餅，于28 ℃、150 r/min 搖床振蕩培養48 h，獲得WF2 種子液。以10%的接種量將WF2 種子液接種于發酵培養基中，于28 ℃培養箱中培養15 d。將發酵完成的培養基于45 ℃烘箱烘干水分后，粉碎機打碎成粉劑備用，即得WF2 菌劑。

1.5.2 病原真菌菌懸液的制備 將活化好的煙草疫霉菌餅轉接于V8 培養基平板中，光照培養14 d，用無菌水將病原菌菌絲及孢子從平板上洗脫下來，按照李小杰等［10］的方法，放入4 ℃冰箱中處理30 min，再在常溫下放置20 min，促進菌絲釋放孢子，調節成1×106CFU/mL 孢子懸浮液備用。

1.5.3 煙草黑脛病防治試驗設計 將煙草種子（云煙87）播種于裝有基質（草炭∶蛭石=3∶1，質量比）的育苗缽中［11］，待生長至6 葉期備用。挑選長勢一致的煙苗分為4 個處理組，每處理3 個重復，每個重復15 株煙苗。即CK，清水；T1，WF2 菌劑稀釋150 倍；T2，WF2 菌劑稀釋300 倍；T3，太抗木每靈水分散粒劑稀釋300 倍。采用生防菌菌液灌根處理的方式測定其對煙草黑脛病的防效，處理前先將每株煙苗接種20 mL 菌液。施藥24 h 后，接種煙草疫霉孢子懸浮液5 mL/缽。14 d 后調查病情指數與防治效果。

1.5.4 病情指數與防治效果 煙草黑脛病分級標準參照《煙草病蟲害分級及調查方法》［12］（GB/T 23222—2008），0 級，全株無??；1 級，莖部病斑不超過莖圍的1/3，或1/3 以下葉片凋萎；3 級，莖部病斑環繞莖圍1/3～1/2，或1/3～1/2 葉片輕度凋萎，或下部少數葉片出現病斑；5 級，莖部病斑超過莖圍的1/2但未全部環繞莖圍，或1/2～2/3 葉片凋萎；7 級，莖部病斑全部環繞莖圍，或2/3 以上葉片凋萎；9 級，病株基本枯死。

1.6 數據處理

使用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析，在0.05 水平上采用LSD法對數據進行差異顯著性檢驗。使用MEGA 11 軟件進行系統發育樹分析。

2 結果與分析

2.1 木霉菌株的形態學觀察

菌株在PDA 培養基上生長迅速，培養3 d 時出現白色絮狀菌絲且鋪滿整個平板，之后菌絲逐漸變為綠色，培養7 d 時菌絲變為暗綠色，無明顯氣味，菌落形態特征與哈茨木霉菌株基本一致（圖1）。

圖1 菌落的形態學觀察

2.2 木霉菌株的分子生物學鑒定

將WF2 的測序結果經過BLAST 后，ITS 片段與Trichoderma harzianumQT2209（KY225652.1）序列相似度達99.85%。應用MEGA 11 軟件與BLAST 比對相近菌株的序列，利用鄰接法構建系統發育樹。結果表明，WF2 與Trichoderma harzianumQT2209（KY225652.1）為同一個分支（圖2）。綜合形態學觀察和系統發育樹結果，確定菌株WF2 為哈茨木霉。

圖2 菌株WF2 系統發育樹

2.3 哈茨木霉WF2 離體抑菌活性測定

哈茨木霉WF2 與兩種病原真菌的對峙培養結果表明，WF2 在PDA 平板上生長迅速，培養3 d 時即對兩種病原真菌產生明顯抑制效果，培養10 d 時，WF2 的菌絲已完全覆蓋在病原真菌的菌絲上，對兩種病原真菌的覆蓋度均為Ⅲ級（圖3、表1）。

表1 木霉菌株WF2 對兩種煙草病原真菌的抑制效果

圖3 哈茨木霉WF2 與兩種病原真菌的對峙培養

通過測量培養10 d 時各處理的菌落直徑，計算出木霉菌株WF2 對兩種煙草病菌的抑制率和覆蓋度。通過表1 可以看出，WF2 對煙草疫霉和尖孢鐮刀菌具有較強的抑制效果。對煙草疫霉的平均抑制率達到86.75%，對尖孢鐮刀菌的平均抑制率達到75.00%。

2.4 木霉對煙草疫霉的盆栽防效試驗

室內盆栽結果表明，與CK 相比，WF2 菌株和商品菌劑太抗木每靈均能顯著降低煙草黑脛病的病情指數，使用WF2 菌株處理過的煙苗生長情況良好（圖4）。T1 的煙草黑脛病病情指數僅為12.28%，防效達到80.23%；T2 的煙草黑脛病病情指數為19.40%，防效達到68.77%；T3 的煙草黑脛病病情指數僅為6.25%，防效達到89.94%。商品菌劑太抗木每靈防治效果優于木霉菌株WF2，但兩者均具有明顯的防治煙草黑脛病的能力（表2）。

表2 木霉菌株WF2 對煙草疫霉的盆栽防治效果（單位：%）

圖4 木霉菌株WF2 對煙草疫霉盆栽防治效果

3 小結與討論

在農業生產中，由于化肥農藥的大量使用，導致環境污染、生態失衡、農產品品質下降及農殘超標等問題日益嚴重。木霉菌因其應用廣泛、防病效果顯著被越來越多地應用在生物防治中。木霉對多種植物病原真菌都有防治效果。據統計，木霉至少對18 個屬29 個種的植物病原真菌有拮抗作用。包括水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）［13］、鐮刀菌屬（Fusariumspp.）［14］、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）［15］、黃曲霉（Aspergillus flavus）［16］、炭疽菌屬（Colletotrichum）［17］等。它能夠通過直接作用機制（真菌寄生、產生裂解酶、抗生物質、爭奪空間或養分）或間接作用機制（誘導植物防御）來減少病原體引起的植物疾病。

本研究從湖北省五峰煙田土壤中分離獲得1 株木霉WF2，結合形態學特征和分子學（ITS 序列）比對，鑒定為哈茨木霉。通過對峙試驗分析，發現該菌株對煙草病原菌（煙草疫霉、尖孢鐮刀菌）具有顯著抑制效果。抑制率分別達到86.75%和75.00%，且對兩種病菌的覆蓋度均達到Ⅲ級，寄生效果優良，可完全抑制病原真菌的生長。后續進行了盆栽試驗，發現該菌株對煙草黑脛病防治效果顯著，其150 倍孢子稀釋液（T1）防治效果達到80.23%，接近商品菌劑太抗木每靈的防治效果。后續將利用該菌株進行田間病害的相關研究，進一步驗證該菌株對煙草病害的防治效果。