致病疫霉對烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺的敏感性動態監測及馬鈴薯晚疫病田間防治藥劑篩選

路 粉, 吳 杰, 趙建江, 畢秋艷, 李 洋,孟潤杰, 韓秀英, 王文橋*,

(1.河北省農林科學院 植物保護研究所，農業農村部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河北省農業有害生物綜合防治技術創新中心，河北省作物有害生物綜合防治國際科技聯合研究中心，河北 保定 071000；2.濱州職業學院，山東 濱州 256603；3.保定職業技術學院，河北 保定 071051)

由致病疫霉Phytophthora infestans(Mont.) de Bary 引起的晚疫病是馬鈴薯上的主要病害[1]，病害發生時可造成馬鈴薯減產20%～30%[2]，嚴重時甚至絕收。在防治馬鈴薯晚疫病的諸多措施中，化學防治因為防效高、見效快和效果穩定而成為目前生產中控制馬鈴薯晚疫病的主要手段[3]。但是，由于長期不合理用藥，我國馬鈴薯主產區致病疫霉已經對甲霜靈和精甲霜靈等苯酰胺類、氟吡菌胺等苯甲酰胺類及嘧菌酯、吡唑醚菌酯等QoI (quinone outside inhibitor) 類殺菌劑產生了不同程度的抗性[4-7]，其中對苯酰胺類殺菌劑抗性尤為嚴重?？顾幮缘漠a生嚴重制約了殺菌劑的應用，成為馬鈴薯晚疫病化學防治中面臨的突出問題[8]。

羧酸酰胺類殺菌劑 (carboxylic acid amides,CAAs) 主要作用于靶標菌的纖維素合酶，通過抑制細胞壁纖維素的合成干擾細胞壁的正常形成或沉積，其結構新穎，作用機理獨特，是目前生產中防治馬鈴薯晚疫病和黃瓜霜霉病等植物卵菌病害的高效內吸性藥劑[9-10]。根據藥劑化學結構，CAA 類殺菌劑被劃分為肉桂酰胺類、扁桃酰胺類和纈氨酰胺氨基甲酸酯類3 個化學亞組[11]。CAA類藥劑中首個研發成功的代表性品種為肉桂酰胺類殺菌劑烯酰嗎啉，于20 世紀80 年代由美國氰氨公司開發[12]，1996 年德國巴斯夫公司在我國首次登記69%烯酰嗎啉 ·代森錳鋅可濕性粉劑用于防治馬鈴薯晚疫病[13]。雙炔酰菌胺是由瑞士先正達公司于2007 年研發的CAA 類藥劑中第一個扁桃酰胺類殺菌劑[14]，同年該公司生產的250 g/L(23.5%) 雙炔酰菌胺懸浮劑在我國取得農藥臨時登記[15]。烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺雖屬于CAA 類藥劑的不同化學亞組，但具有相似的殺菌譜，均對卵菌病害防效良好，且與市場上其他作用機理殺卵菌藥劑無交互抗藥性[11]。

雖然致病疫霉對CAA 類藥劑具有低等抗性風險[11]，但是致病疫霉為中度抗性風險病原菌[16]，并且烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺在河北、內蒙古和吉林等省 (區) 馬鈴薯北方一季作區具有多年使用歷史，明確近年來這些地區致病疫霉對烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺的敏感性變化動態，對于指導當地CAA 類藥劑的合理使用十分必要。為此，本研究系統監測了河北、內蒙古和吉林3 省 (區) 致病疫霉對烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺的敏感性變化動態，明確了烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺等7 種藥劑對馬鈴薯晚疫病的田間防效，以期為當地馬鈴薯晚疫病的高效防治和合理用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 于2011—2019 年在河北省 (承德市和張家口市)、內蒙古自治區 (錫林郭勒盟、赤峰市和呼倫貝爾市) 和吉林省 (松原市和延邊朝鮮族自治州) 馬鈴薯主產區采集馬鈴薯晚疫病葉片，分離純化并鑒定后共得到922 個菌株，保存備用。其中922 株用于對烯酰嗎啉的敏感性監測，890 株用于對雙炔酰菌胺的敏感性監測。

1.1.2 供試藥劑 96%烯酰嗎啉 (dimethomorph)原藥，巴斯夫歐洲公司；93%雙炔酰菌胺 (mandipropamid) 原藥，瑞士先正達作物保護有限公司。將原藥用丙酮溶解，加入無菌水制備成1000 mg/L母液，用于致病疫霉敏感性測定。

50%烯酰嗎啉可濕性粉劑(dimethomorph 50%WP)，巴斯夫歐洲公司；23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑(mandipropamid 23.4% SC)和43%霜脲氰 ·雙炔酰菌胺水分散粒劑(cymoxanil + mandipropamid 43% WG)，瑞士先正達作物保護有限公司；50%氟醚菌酰胺水分散粒劑(fluopimomide 50%WG)和40%氟醚菌酰胺 ·烯酰嗎啉懸浮劑(fluopimomide + dimethomorph 40% SC)，山東省聯合農藥工業有限公司；20%霜脲氰懸浮劑(cymoxanil 20% SC)，青島中達農業科技有限公司；687.5 g/L氟吡菌胺 ·霜霉威鹽酸鹽懸浮劑(fluopicolide +propamocarb hydrochloride 687.5 g/L SC)，拜耳作物科學 (中國) 有限公司。將這7 種制劑按照推薦劑量用水稀釋后用于田間藥效試驗。

1.1.3 供試培養基 黑麥蔗糖瓊脂培養基 (rye sucrose agar, RSA)：黑麥70 g，蔗糖20 g，瓊脂粉12 g，蒸餾水定容至1000 mL。

1.1.4 供試馬鈴薯品種 馬鈴薯晚疫病感病品種‘費烏瑞它’，購自河北省圍場滿族蒙古族自治縣孟灤馬鈴薯產銷專業合作社，用于田間藥效試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 致病疫霉對烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺的敏感性測定 采用菌絲生長速率法[17]。將1.1.2 節中制備好的烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺母液系列稀釋后定量加入RSA 培養基中，分別制成含烯酰嗎啉為1、0.5、0.1、0.05、0.01 μg/mL 和含雙炔酰菌胺為0.5、0.1、0.05、0.01、0.005 μg/mL 的RSA 平板，每個處理3 皿，每皿中央接種1 個菌餅 (直徑為0.5 cm)，置于18 ℃黑暗培養7 d，另設空白對照和溶劑對照。采用十字交叉法測量菌落直徑，計算各藥劑處理對菌絲生長抑制率 (%)：抑制率/%=[(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/(對照菌落生長直徑-0.5)] × 100。通過DPS 7.05 數據分析軟件進行藥劑濃度對數值 (x) 與抑制率轉對應的機率值 (y) 之間的線性回歸分析，求出毒力回歸方程y=bx+ a、相關系數 (r) 及有效抑制中濃度 (EC50)。

1.2.2 致病疫霉對烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺的敏感型劃分和抗性指數計算 參照DB13/T 1420—2011《馬鈴薯致病疫霉抗藥性檢測技術規程》[18]中致病疫霉對烯酰嗎啉的敏感基線[(0.0634 ± 0.0225)μg/mL] 和對雙炔酰菌胺的敏感基線[(0.2006 ±0.0617)μg/mL]計算抗性倍數：抗性倍數 = 各菌株對供試藥劑的敏感性 (EC50)/敏感基線 (EC50)。按照該標準中的分級標準劃分致病疫霉各菌株對供試藥劑的抗性等級：敏感菌株 (S)，抗性倍數 ≤(敏感基線的95%置信限上限/敏感基線)；低抗菌株 (LR)，(敏感基線的95%置信限上限/敏感基線)＜ 抗性倍數 ≤ 10；中抗菌株 (MR)，10 ＜ 抗性倍數 ≤ 100；高抗菌株 (HR)，抗性倍數 ＞100。參考Zhao等[19]的方法計算抗性指數 (RI)：抗性指數=∑(不同抗性菌株所占百分率 × 相對級數)/(最高級數 × 100)。

1.2.3 殺菌劑對馬鈴薯晚疫病田間藥效試驗 2018年和2019 年在河北省圍場滿族蒙古族自治縣克勒溝鎮馬鈴薯種植區開展烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺等7 種藥劑防治晚疫病田間藥效試驗，設清水處理為對照，每處理4 次重復。施藥劑量參考各藥劑推薦劑量 (表1)，藥液量為900 L/hm2。小區采用隨機區組排列，每小區面積均為100 m2。馬鈴薯晚疫病零星發生時開始用藥，共施藥3 次，間隔期7 d，于末次施藥后7 d 調查病情。病級劃分、病情指數和防治效果計算均參考GB/T 17980.34—2000 《農藥田間藥效試驗準則 (一) 殺菌劑防治馬鈴薯晚疫病》[20]。病級劃分標準：0 級：無病斑；1級：病斑面積占整個葉面積 5%以下；3 級：病斑面積占整個葉面積 6%～10%；5 級：病斑面積占整個葉面積11%～20%；7 級：病斑面積占整個葉面積 21%～50%；9 級：病斑面積占整個葉面積50%以上。病情指數 = [Σ(各級病葉數 × 相對級數值)/(調查總葉數 × 9)] × 100。因施藥前病情基數為0，防治效果/% = [(清水對照區病情指數-藥劑處理區病情指數)/清水對照區病情指數] × 100。

表1 烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺等7 種藥劑田間藥效試驗施藥劑量Table 1 The dosages of dimethomorph, mandipropamid, and the other five fungicides applied in the field efficacy trials

1.2.4 數據處理 田間藥效試驗各處理防治效果的差異顯著性采用DPS 7.05 數據分析軟件鄧肯氏新復極差 (DMRT) 法進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 致病疫霉對烯酰嗎啉的敏感性變化時空動態

2.1.1 時間動態變化 2011—2019 年采自河北、內蒙古和吉林3 省 (區) 馬鈴薯主產區的922 株致病疫霉對烯酰嗎啉敏感性總體表現為敏感或低抗，僅于2015 年在河北省采集的菌株中檢測到2 個中抗菌株。不同年份采集的菌株對烯酰嗎啉平均EC50值為0.062～0.198 μg/mL，平均抗性倍數為0.98～3.12，抗性頻率為25.71%～100%，抗性指數為0.31～0.50，4 者均在2012年達到最高值(表2)。

2.1.2 地域動態變化 河北、內蒙古和吉林3 省(區) 致病疫霉菌株對烯酰嗎啉平均EC50值為0.117～0.135 μg/mL，平均抗性倍數為1.85～2.13，抗性頻率為57.19%～66.56%，抗性指數為0.39～0.42 (表3)。其中，內蒙古采集的菌株對烯酰嗎啉的上述4 個指標均略低于河北和吉林采集的菌株。

表3 河北、內蒙古和吉林致病疫霉群體對烯酰嗎啉的敏感性空間動態變化Table 3 Spatial dynamics of P.infestans population sensitivity to dimethomorph in Hebei, Inner Mongolia, and Jilin

綜上，3 省 (區) 922 株致病疫霉對烯酰嗎啉的平均EC50值、平均抗性水平、抗性頻率和抗性指數隨著監測年份和監測地點的變化而波動。除了抗性頻率外，平均EC50值、平均抗性水平和抗性指數總體上呈低位平穩趨勢 (圖1)。

圖1 致病疫霉對烯酰嗎啉的敏感性時空變化趨勢Fig.1 Temporal and spatial dynamics in sensitivity of P.infestans to dimethomorph

2.2 致病疫霉對雙炔酰菌胺的敏感性變化時空動態

2.2.1 時間動態變化 2011—2019 年采自河北、內蒙古和吉林3 省 (區) 馬鈴薯主產區的890 株致病疫霉對雙炔酰菌胺普遍表現為敏感，僅2013 年在內蒙古采集的菌株中檢測到1 個低抗菌株。不同年份采集的菌株對雙炔酰菌胺平均EC50值為0.020～0.054 μg/mL，平均抗性倍數為0.10～0.27，抗性頻率為0～1.43%，抗性指數均為0.25 (表4)。

表4 2011—2019 年致病疫霉群體對雙炔酰菌胺的敏感性時間動態變化Table 4 Temporal dynamics of P.infestans population sensitivity to mandipropamid from 2011 to 2019

2.2.2 地域動態變化 自河北、內蒙古和吉林3 省 (區) 采集的致病疫霉菌株對雙炔酰菌胺平均EC50值為0.030～0.042 μg/mL，平均抗性倍數為0.15～0.21，抗性頻率為0～0.36%，抗性指數均為0.25 (表5)。其中，內蒙古采集的菌株對雙炔酰菌胺的上述4 者均略高于河北和吉林采集的菌株。

表5 河北、內蒙古和吉林致病疫霉群體對雙炔酰菌胺的敏感性空間動態變化Table 5 Spatial dynamics of P.infestans population sensitivity to mandipropamid in Hebei, Inner Mongolia, and Jilin

2.3 不同殺菌劑對馬鈴薯晚疫病的田間防效

2018 年，50%烯酰嗎啉可濕性粉劑 (有效成分，下同) 300.0 g/hm2對馬鈴薯晚疫病的防效(85.6%) 顯著高于23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑140.4 g/hm2(78.6%)、50%氟醚菌酰胺水分散粒劑75.0 g/hm2(71.4%) 和40%氟醚菌酰胺 ·烯酰嗎啉懸浮劑240.0 g/hm2(82.3%) 的防效，與20%霜脲氰懸浮劑162.0 g/hm2、43%霜脲氰 ·雙炔酰菌胺水分散粒劑290.3 g/hm2和687.5 g/L 氟吡菌胺 ·霜霉威鹽酸鹽懸浮劑773.4 g/hm2對馬鈴薯晚疫病的防效(83.7%～86.9%) 相當 (表6)。

2019 年，50%烯酰嗎啉可濕性粉劑300.0 g/hm2對馬鈴薯晚疫病的防效 (83.3%) 顯著高于23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑140.4 g/hm2(76.9%) 和50%氟醚菌酰胺水分散粒劑75.0 g/hm2(70.0%) 的防效，與20%霜脲氰懸浮劑162.0 g/hm2、40%氟醚菌酰胺 ·烯酰嗎啉懸浮劑240.0 g/hm2、43%霜脲氰 ·雙炔酰菌胺水分散粒劑290.3 g/hm2和687.5 g/L 氟吡菌胺 ·霜霉威鹽酸鹽懸浮劑773.4 g/hm2的防效(79.8%～82.3%) 相當 (表6)。

綜上，烯酰嗎啉單劑和混劑 (50%烯酰嗎啉可濕性粉劑、40%氟醚菌酰胺 ·烯酰嗎啉懸浮劑)、雙炔酰菌胺混劑 (43%霜脲氰 ·雙炔酰菌胺水分散粒劑) 及20%霜脲氰懸浮劑、687.5 g/L 氟吡菌胺 ·霜霉威鹽酸鹽懸浮劑對馬鈴薯晚疫病的防效良好，在河北、內蒙古和吉林3 省 (區) 可以繼續用于馬鈴薯晚疫病的防治。

3 討論

Stein 等[21]發現，1994—1998 年采自美國北達科他州和密歇根州等地區的11 株致病疫霉對烯酰嗎啉均表現敏感。王英華等[22]和袁善奎等[23]分別于1997—2001 年在內蒙古和甘肅以及2003—2004 年在內蒙古和黑龍江檢測了致病疫霉對烯酰嗎啉的敏感性，均未發現抗性菌株。余星龍[24]在云南、武漢、福建、廣西和貴州5 省 (區) 采集的130 株致病疫霉中亦未檢測到對烯酰嗎啉表現出抗性的菌株。Dereviagina 等[25]雖在田間采集到了致病疫霉對烯酰嗎啉的低抗菌株，但是抗性在菌株繼代培養過程中逐漸喪失。袁善奎等[23]和王文橋等[26]在室內通過紫外誘導或菌絲馴化均未獲得致病疫霉對烯酰嗎啉的抗性菌株，Rubin 等[27]通過紫外誘導或EMS 誘變致病疫霉孢子囊獲得了對CAA 類藥劑的抗性菌株，但是抗性并不穩定。不過，Blum 等[28]通過EMS 誘變致病疫霉原生質體獲得了對雙炔酰菌胺抗性倍數大于1512 且抗性可穩定遺傳的突變體。Cohen 等[29]于2001—2005年檢測了9 個歐洲國家以及以色列240 株致病疫霉對雙炔酰菌胺的敏感性，發現所有菌株均對雙炔酰菌胺表現敏感。屈智蓮等[30]測定了2015—2016年采自黑龍江、吉林、遼寧和河北4 省98 株致病疫霉對雙炔酰菌胺的敏感性，亦未發現抗性菌株。

本研究通過監測致病疫霉對烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺敏感性變化動態發現，2011—2019 年河北、內蒙古和吉林3 省 (區) 的致病疫霉對烯酰嗎啉主要表現為敏感或低抗，雖然歷年抗性頻率變化較大，但是歷年平均EC50值、平均抗性倍數和抗性指數均處于低位。致病疫霉菌株對雙炔酰菌胺普遍表現敏感，僅于2013 年在內蒙古采集的菌株中檢測到1 個低抗菌株，歷年抗性指數均為0.25，即最低值。田間抗藥性的產生與病原菌的自身特性、殺菌劑的類型和作用機理、田間用藥措施、藥劑選擇壓及施藥歷史等多種因素密切相關[31-32]。本研究中致病疫霉對烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺的敏感性監測結果表明，致病疫霉對這兩種藥劑抗性發展較為緩慢，一方面可能與致病疫霉獨特的二倍體特征及控制致病疫霉對CAA 類藥劑的抗性基因為隱性基因有關[11]；另一方面可能是由于生產中普遍交替使用CAA 類藥劑 (烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺)、代森錳鋅、氰霜唑、氟啶胺、氟吡菌胺 ·霜霉威鹽酸鹽以及氟噻唑吡乙酮等多種作用機理的高效殺菌劑，馬鈴薯一個生長季內烯酰嗎啉或雙炔酰菌胺的使用次數普遍為1～2 次，最多不超過3 次，CAA 類藥劑較低的使用頻率導致了其對致病疫霉群體的選擇壓力較低，從而延緩了抗藥性的發展。致病疫霉對烯酰嗎啉的抗性菌株所占頻率高于對雙炔酰菌胺抗性頻率或許與烯酰嗎啉較雙炔酰菌胺投入生產中使用年限長和使用頻率高相關。

田間藥效試驗結果顯示，50%烯酰嗎啉可濕性粉劑按有效成分300.0 g/hm2及23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑按有效成分140.4 g/hm2施用對馬鈴薯晚疫病的防效分別為83.3%～85.6%和76.9%～78.6%。雙炔酰菌胺對馬鈴薯晚疫病的防效低于烯酰嗎啉，可能是因為雙炔酰菌胺與烯酰嗎啉分屬于CAA 類藥劑的2 個不同化學亞組，雙炔酰菌胺對致病疫霉的作用方式和持效期與烯酰嗎啉有所不同[33]。

本研究結果顯示，在我國河北、內蒙古和吉林3 省 (區) 田間已出現致病疫霉對烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺的低抗菌株及極少量中抗菌株，雖然抗性水平較低，但不能忽視對這兩種藥劑的抗性風險管理。應加強致病疫霉對烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺的田間抗性監測，掌握田間抗性發展趨勢；在生產中應用烯酰嗎啉單劑或者混劑及雙炔酰菌胺混劑防治馬鈴薯晚疫病時，應與不同作用機理高效藥劑交替使用，每個生長季節每種中高抗性風險藥劑的使用不超過2 次；在病害防治過程中采用綜合防治措施，即選育抗性品種、農業防治、生物防治、生態調控與化學防治相結合，減少烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺等化學藥劑的使用次數，以延緩致病疫霉對其抗性發展。