木質素基苯醚甲環唑納米顆粒構建及防控楊梅凋萎病研究

張 啟, 張家棟, 方 云, 熊秋雨, 王 嶸,程敬麗, 孫 鸝, 趙金浩*,

(1.浙江大學 農業農村部作物病蟲分子生物學重點實驗室，浙江省作物病蟲生物學重點實驗室，杭州 310058；2.浙江省蘭溪市經濟特產技術推廣中心，浙江 蘭溪 321100；3.浙江省農業科學院，杭州 310021)

楊梅凋萎病于2004 年首次在浙江發現[1]，目前已成為南方楊梅樹生長的主要病害。染病初期，楊梅樹嫩梢部分枯萎，隨著病情加重，小枝枯死會發展為大枝枯死，進而引起主干枯死[2-3]，造成巨大的經濟損失。

目前，楊梅凋萎病主要以化學農藥防治為主[4]。市場上的農藥主要是懸浮劑和可濕性粉劑等傳統制劑，存在農藥助劑用量高、農藥液滴粒徑大和容易漂移流失的弊端[5]，易導致環境污染、藥效期縮短和利用率降低等問題[6]。此外，農藥施用后易受到各種因素的影響，比如葉片彈跳滾落、地表徑流和農藥降解等[7]，部分藥液無法到達靶標部位，導致農藥利用率偏低和農藥環境富集等問題[8]。而與納米技術相結合的納米農藥為解決該問題提供了新的研究思路。納米農藥具有粒徑小、比表面積和分散性高等特點，可以提高農藥的持效期和葉面親和性[9]，并有望通過減少農藥助劑的使用來最大限度地降低環境風險。

現已有多種以木質素類材料為納米載體制備納米農藥的報道[10]。木質素是地球上最豐富的生物聚合物之一，其化學結構可能因木質素來源而異[11]。近年來，木質素磺酸鹽及其改性衍生物因具有成本低、生物降解性好、紫外吸收能力強等優點，受到納米農藥領域的關注。但由于木質素磺酸鹽的強水溶性，限制了其在納米農藥諸多制備方法中的使用，比如界面聚合法、溶劑揮發法、溶劑交換法等，對木質素磺酸鹽進行改性，提高其脂溶性，拓寬其使用范圍，成為研究的熱點[12]。苯醚甲環唑 (difenoconazole) 是一種廣譜性殺菌劑，對多種病害有良好的防效，尤其對引起楊梅凋萎病的病原真菌有良好的防控作用[13]。本研究以苯醚甲環唑為供試藥劑，用苯甲酸酐對木質素磺酸鈉進行疏水性改性后負載苯醚甲環唑，制備了木質素基苯醚甲環唑納米顆粒，對其結構進行了表征，并進一步評估了該制劑的穩定性、藥效持留期及其對楊梅凋萎病的防控效果。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

苯甲酸酐和木質素磺酸鈉 (分析純，上海笛柏生物科技有限公司)；十二烷基硫酸鈉 (純度93%，山東優索化工科技有限公司，SDS)；氯化鈉、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、二氯甲烷 (DCM)、三乙胺 (TEA)、異丙醇、無水硫酸鎂和乙腈 (分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；乙二胺-N-丙基硅烷 (分析純，月旭科技 (上海) 股份有限公司，簡稱PSA)；氯化鋰和十八烷基硅烷鍵合硅膠 (分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司)。10%苯醚甲環唑微乳劑 (河北威遠生物化工有限公司，簡稱Di ME)；十六烷基三甲基溴化銨 (分析純，上海展云化工有限公司，簡稱CTAB)；苯乙基酚聚氧乙烯醚 (分析純，江蘇省海安石油化工廠，簡稱農乳602)；93%十二烷基硫酸鈉 (簡稱SDS) 和辛基苯酚聚氧乙烯醚 (簡稱OP-10) (山東優索化工科技有限公司)；椰油酰胺丙基甜菜堿 (分析純，上海源葉生物科技有限公司，簡稱CAB)；苯醚甲環唑原藥 (difenoconazole，純度96%，武漢遠城科技發展有限公司，簡稱Di Tech)。

楊梅凋萎病的致病菌，由浙江大學農業與生物技術學院生物所從楊梅凋萎病的病枝上進行病菌分離和純化，并提取病菌的DNA 進行PCR 擴增，在GenBank 中進行同源性分析比較，確定致病菌種屬。

LGJ-10 真空冷凍干燥機 (北京松源華興科技有限公司)；LC-20A 高效液相色譜儀 (日本島津株式會社)；Zetasizer Nano ZS-90 馬爾文激光粒度儀(英國馬爾文公司)；G300 掃描電子顯微鏡 (德國卡爾蔡司公司)；Nicolet Ava-tar370傅里葉變換紅外光譜儀 (美國賽默飛世爾科技公司)；BS210S 電子天平 (德國賽多利斯公司)；TG-16 高速離心機 (四川蜀科儀器有限公司)；Turbiscan Lab 穩定性分析儀 (法國Formulation 儀器公司)；RXZ-310C 恒溫光照培養箱 (寧波江南儀器制造廠)；GC-2010 Plus 氣相色譜-質譜聯用儀 (日本島津公司)。

1.2 木質素磺酸鹽納米農藥顆粒的制備

1.2.1 苯甲酸酯化的木質素磺酸鈉 (BLS) 的制備參考文獻方法[14]進行。將1 g 木質素磺酸鈉在90 ℃下攪拌溶解于15 mL 質量濃度為10% 的LiCl/DMF 溶液中，降至室溫后，通入氮氣保護。將5 g 苯甲酸酐溶解在DMF 中，加入室溫攪拌下的木質素磺酸鈉DMF 溶液，再加入0.022 mol 三乙胺，60 ℃下攪拌過夜。將反應液以8000 r/min的速率攪拌5 min，取約15 mL 上清液加入300 mL異丙醇，于8000 r/min 下離心5 min，得到產物沉淀，用異丙醇清洗3 次。將沉淀移入40 ℃的真空干燥箱內干燥，得到苯甲酸酯化的BLS 樣品。

1.2.2 苯醚甲環唑納米顆粒 (Di@BLS) 的制備 稱取10 mg SDS 溶于5 mL 水中，得到質量濃度為0.2%的SDS 水溶液，作為水相。將10 mg Di 和50 mg BLS 溶于500 mg 的DCM 中 (即BLS 載體的質量濃度為1%，藥料比為1 : 5)，作為油相。在1000 r/min 的攪拌下，將油相滴入水相，使用高剪切乳化機以10000 r/min 對油水混合物剪切1 min，進行預乳化。將剪切后的溶液放入細胞破碎儀，在70%的功率下超聲2 min (超聲1 s，暫停2 s)，使兩相充分混合乳化。將乳液以500 r/min 的轉速攪拌2 h，使溶液內部的DCM 揮發后，得到Di@BLS。

1.3 木質素磺酸鹽納米顆粒的配方優化

1.3.1 BLS 載體濃度配方篩選 以溶液粒徑大小為參照，對制得BLS 的最佳濃度進行了篩選，將15～75 mg 的BLS 載體分別溶于500 mg DCM 中，后續不同BLS 濃度的Di@BLS 的制備步驟參照

1.2.2 節，使用馬爾文激光粒度測定儀檢測不同溶液的粒徑大小變化。

1.3.2 BLS 載體與Di 料藥比篩選 將BLS 載體與10 mg Di 分別按照質量比為1 : 1、3 : 2、2 : 1、3 : 1、5 : 1 和7 : 1 溶于500 mg DCM 中，后續Di@BLS 的配制步驟參照1.2.2 節，使用制劑穩定分析儀和馬爾文激光粒度儀檢測不同料藥比Di@BLS 的TSI 指數和粒徑變化。

1.3.3 表面活性劑種類篩選 分別對陽離子、陰離子、兩性和非離子型表面活性劑進行了篩選。將50 mg BLS 載體與10 mg Di 加入5 mL 含有質量濃度為0.2%表面活性劑的水溶液中，后續步驟參考1.2.2 節，檢測不添加表面活性劑的Di@BLS的Zeta 電位以及添加不同表面活性劑后的Di@BLS粒徑大小。

1.3.4 表面活性劑用量篩選 將50 mg BLS 載體與10 mg Di 加入5 mL 含優化篩選的表面活性劑水溶液中，表面活性劑水溶液的質量濃度設置為0.1%、0.3%、0.8%、1%、1.3% 和1.5%，后續Di@BLS 的配制步驟參考1.2.2 節，使用馬爾文激光粒度測定儀檢測不同表面活性劑含量的Di@BLS粒徑大小，確定表面活性劑使用的最佳濃度。

1.4 BLS 和Di@BLS 的表征

1.4.1 BLS 的核磁共振氫譜(1H NMR) 將10 mg干燥樣品溶于0.5 mL 氘代DMSO，對樣品進行1H NMR 分析。

1.4.2 Di@BLS 的紅外光譜分析 (FT-IR) 通過FT-IR 對Di 原藥、BLS 和Di@BLS 等樣品化學官能團的變化進行檢測。取適量干燥的樣品粉末與KBr 粉末混合后，研磨3～5 min 進行壓片，在4000～500 cm-1的波數范圍進行紅外檢測。

1.4.3 Di@BLS 的形貌表征和粒徑分析 通過掃描電子顯微鏡 (SEM) 觀察Di@BLS 的形貌特征。取適量干燥的Di@BLS 樣品粉末固定在導電膠上，設定加速電壓為3.00 kV，工作距離為5.5 mm，觀察其形態特征。并在視野內選擇200 個納米顆粒檢測平均粒徑，同時使用馬爾文激光粒度測定儀檢測Di@BLS 的粒徑分布。

1.5 楊梅凋萎病致病菌分離鑒定

由浙江大學農業與生物技術學院生物所進行。從浙江省蘭溪市馬澗鎮采集楊梅凋萎病病枝，采用科赫氏法則對其致病菌進行分離鑒定。對所分離的致病菌進行培養后再接種到楊梅樹苗上。楊梅苗為網上購買，為降低楊梅在運送時的蒸騰作用，對楊梅葉片進行了切割：將致病菌菌餅接種于楊梅葉痕處[15]，以接種空白菌餅的楊梅葉作為對照。對楊梅套袋保濕，觀察記錄發病情況，確定是否與田間病害癥狀一致。之后從發病部位再分離病原菌進行鑒定，觀察是否與原致病菌一致。

1.6 離體抑菌活性測定

采用菌絲生長速率法[16]分別測定Di@BLS、Di ME 和Di 對楊梅凋萎病致病菌的抑制活性，計算有效中濃度 (EC50)。配制PDA 培養基，加熱融化后混入供試藥劑，質量濃度分別設置為0.125、0.25、0.5、1 和2 μg/mL，以不含藥劑的PDA 培養基作為空白對照。將致病菌接種于PDA 培養基上，統計菌落生長情況，每個試驗重復3 次。

1.7 Di 在楊梅體內的吸收轉運試驗

1.7.1 標準曲線的測定 稱取10.0 mg Di，用乙腈溶解并定容至10 mL，再用乙腈稀釋至質量濃度分別為0.05、0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、12、15、30、60 和120 μg/mL 的系列標準溶液，用高效液相色譜 (HPLC) 檢測標準溶液的出峰面積。以標準溶液的峰面積為縱坐標 (y)，Di 質量濃度為橫坐標 (x)，繪制標準曲線。HPLC 條件：流動相為V(甲醇) :V(水) = 30 : 70，檢測波長為254 nm，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量 20 μL。

1.7.2 添加回收試驗 使用QuEChERS 方法[17]提取楊梅葉片中的苯醚甲環唑。稱取0.5 g 楊梅葉片，加入含Di 質量分別為1、5、10、50 μg 的Di 乙腈標準溶液。將葉片烘干后放入研缽內，加入液氮搗碎。將碎葉放入50 mL 離心管中，加入0.5 g 無水硫酸鎂、0.35 g 氯化鈉和10 mL 乙腈，超聲20 min，于8000 r/min 下離心5 min。取5 mL上清液，旋轉蒸發至近干，加入1 mL 乙腈重新溶解；加入30 mg 硅鎂型吸附劑、100 mg 無水硫酸鎂、15 mg C18和30 mg PSA。用0.22 μm 濾膜過濾，HPLC 法檢測其葉片內部Di 的質量濃度，計算其含量，并與原添加藥劑量進行比對，計算添加回收率及相對標準偏差 (RSD)。每個濃度重復5 次試驗。

1.7.3 Di 在楊梅苗上的持效期試驗 取多株長勢相近的一年生楊梅苗，在中間的葉片上分別滴加0.5 mL 0.2%的Di@BLS 與Di ME，自然晾干后，分別于1、4、7、10、14 d 后檢測楊梅苗上葉與下葉的藥劑含量變化，確定兩種藥液的持效期。葉片中藥劑的提取步驟參考1.7.2 節中QuEChERS方法，并使用HPLC 檢測藥劑濃度。

1.7.4 Di 的田間持效期試驗 將40 mL 質量濃度為200 mg/L 的Di@BLS 裝入50 mL 注干瓶中，于田間對楊梅苗進行樹干注射，檢測藥液持留情況，試驗地點選在浙江省蘭溪市馬澗鎮家庭農場。使用電鉆在楊梅樹基干距地面10 cm 處斜向下鉆孔，插入注干瓶，并在注干瓶后插洞，維持內外大氣壓平衡，30 d 后取樣檢測楊梅葉片內的藥劑存留情況。葉片中藥劑的提取步驟參考

1.7.2 中QuEChERS 方法，并略作改進：取5 g 樹葉加入液氮磨碎后，轉入50 mL 離心管內，加入20 mL 乙腈、0.5 g 氯化鈉和2 g 無水硫酸鎂，超聲20 min 后，于8000 r/min 下離心5 min。取上清液10 mL，旋轉蒸發后加入1 mL 丙酮重新溶解，加入50 mg PSA、50 mg 硅鎂型吸附劑、150 mg無水硫酸鎂和25 mg C18，超聲1 min 后，采用0.22 μm 有機濾膜過濾，使用氣相色譜-質譜聯用儀 (GC-MS) 檢測樣品。

GC-MS 條件：進樣溫度250 ℃，程序升溫：120 ℃保持1 min，以30 ℃/min 的速度升至130 ℃，5 ℃/min 升溫至250 ℃，最后以10 ℃/min 的速率升至300 ℃，保持5 min，色譜柱為HP-5MS 石英毛細管柱 (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，Agilent)，電離方式EI；質量掃描范圍m/z30～500；接口溫度280 ℃；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃。

1.8 盆栽試驗

以東魁楊梅為供試品種，測試Di@BLS 對楊梅凋萎病的防治效果。在1 年樹齡的楊梅苗上噴灑20 mL 有效成分含量 200 μg/mL 的Di@BLS，楊梅苗在室溫下自然晾干后，立即接種楊梅凋萎病病菌，以噴施清水的楊梅苗作為空白對照，噴施同等藥劑濃度的Di ME 作為陽性對照。施藥后，葉片應呈全部潤濕的狀態。接種楊梅凋萎病菌后培養30 d，按公式 (1) 計算發病率。每處理3 次重復。

其中：E為發病率，%；Dt為發病掉落葉片數，Dc為總葉片數。

2 結果與討論

2.1 BLS 和Di@BLS 結構表征

2.1.1 BLS 的1H NMR 如圖1 所示，與木質素磺酸鈉 (LS) 相比，BLS 的1H NMR 在化學位移δ7.2～8.2 處出現新的吸收峰，這是由于苯環上的H 電子云密度較小，屏蔽效應較弱，苯甲酸酐在取代LS 上的羥基后，LS 在低場出現新的吸收峰，表明苯甲酸酐成功對木質素磺酸鹽進行了酯化。

圖1 BLS 和LS 的 1H NMR 譜圖Fig.1 1H NMR spectra of BLS and LS

2.1.2 Di@BLS 的紅外譜圖 測試結果如圖2 所示。在Di@BLS 的紅外譜圖中，1682 cm-1處的吸收峰為Di 上特有的C＝N 伸縮振動峰，750 cm-1處的特征峰為Di 上C－Cl 的伸縮振動峰[18]，通過對比Di 與Di@BLS 的譜圖可以發現兩者的特征峰位置基本一致，證明本研究成功合成了負載Di 的Di@BLS 納米農藥顆粒。

圖2 LS、BLS、Di 及Di@BLS 的FT-IR 譜圖Fig.2 FT-IR spectra of LS, BLS, Di and Di@BLS

2.1.3 Di@BLS 的粒徑與形貌表征 圖3 (a) 為Di@BLS 納米顆粒的掃描電子顯微鏡照片?？梢奃i@BLS 納米顆粒的球體形狀規則，顆粒的表面光滑，大小分布比較均勻，粒徑在86.82 nm 左右；圖3 (b) 為使用馬爾文激光粒度儀檢測得到的Di@BLS 粒徑分布圖，Di@BLS 的平均粒徑大小在135.2 nm，馬爾文激光粒度儀檢測的粒徑較掃描電子顯微鏡統計大的原因與馬爾文檢測粒徑為納米顆粒的水合粒徑 (流體動力學粒徑) 有關[19]。

圖3 Di@BLS 的掃描電鏡圖 (a) 以及Di@BLS 的粒徑分布圖 (b)Fig.3 SEM (a) and particle size distribution of Di@BLS (b)

2.2 木質素磺酸鹽納米顆粒的配方優化

2.2.1 BLS 載體濃度配方優化 圖4 為BLS 濃度對Di@BLS 納米顆粒粒徑的影響。通過調節BLS的濃度可以發現，隨著BLS 濃度的提高，納米顆粒的粒徑不斷增大；在BLS 質量濃度從1.3%提升至1.5%后，所得納米顆粒的粒徑大幅上漲。造成這一現象的原因可能是高濃度的BLS 油相進入水中時，分子間距離較小，易聚集形成大粒徑的納米顆粒。后續試驗為獲得粒徑較小的Di@BLS 納米顆粒，選用質量濃度為0.2%的BLS 配制農藥納米顆粒。

圖4 BLS 濃度對Di@BLS 納米顆粒粒徑的影響Fig.4 The effect of BLS concentration on the particle size of Di@BLS nanoparticles

2.2.2 BLS 和Di 的料藥比配方優化 圖5 (a) 為Di@BLS 的料藥比對粒徑的影響。從中可以發現，隨著料藥比的增加，Di@BLS 的顆粒粒徑呈現先減小后增大的趨勢，在料藥比為5 : 1 時，粒徑最??；圖5 (b) 為料藥比對Di@BLS 的TSI 指數的影響。TSI 指數越小，說明樣品的穩定性越高，在料藥比為1 : 1 時制得的Di@BLS 樣品TSI 指數較高，表明樣品穩定性低，這可能是因為投入的載體較少，樣品中存在大量未被包覆的藥劑懸浮。而TSI 指數最小、穩定性最高的料藥比為5 : 1，之后，隨著料藥比進一步增加，TSI 指數升高，這可能與料藥比增加導致顆粒粒徑增大，顆粒之間的靜電斥力減小有關。綜上，最佳料藥比為5 : 1。

圖5 料藥比對納米農藥粒徑的影響 (a) 以及穩定性指數(TSI) 的影響 (b)Fig.5 The influence of material-to-pesticide ratio on the particle size of nanopesticides (a) and the influence of Instability Index (TSI) (b)

2.2.3 Di@BLS 的表面活性劑種類篩選 圖6 為表面活性劑種類對Di@BLS 樣品粒徑大小的影響。從中可以發現，使用表面活性劑CTAB 制備的Di@BLS 粒徑最大，接近800 nm，而使用SDS制備的Di@BLS 粒徑最小，這可能是因為SDS 是陰離子型表面活性劑，而Di@BLS 內部含有較強的負電荷，SDS 的引入帶去了更多負電荷，增大了Di@BLS 顆粒間的斥力，使顆粒形成時不容易聚集，粒徑減??；而CTAB 是陽離子型表面活性劑，會引入大量正電荷，使Di@BLS 顆粒之間的靜電斥力減弱，更容易發生聚集沉淀，因而增大納米顆粒的粒徑。故選用SDS 作為表面活性劑。

圖6 表面活性劑種類對納米農藥粒徑的影響Fig.6 The effect of surfactant types on the particle size of nanopesticides

2.2.4 Di@BLS 中表面活性劑用量的篩選 圖7 為SDS 濃度對Di@BLS 粒徑的影響?？梢?，隨著SDS 濃度提高，Di@BLS 粒徑逐漸增大，這可能是因為表面活性劑濃度增大，導致溶液的黏度增高，使納米顆粒在形成過程中不易分散，從而形成了粒徑較大的Di@BLS 納米顆粒。當SDS 質量濃度為0.1%～0.4%時，顆粒粒徑較??；而當SDS 質量濃度在0.8%以上時，顆粒粒徑在200 nm 以上，所以后續試驗使用的SDS 質量濃度維持在0.1%～0.4%。

圖7 SDS 濃度對納米農藥粒徑的影響Fig.7 The effect of SDS concentration on the particle size of nanopesticides

綜上，本研究最佳制劑配方選擇在BLS 載體濃度為1%、料藥比為5 : 1、質量濃度為0.2%的SDS 用量條件下配制Di@BLS。

2.3 致病菌的鑒定

從浙江省蘭溪市馬澗鎮采收集的楊梅樹病枝分離出4 種病菌，隨后將分離出的病菌分別回接到楊梅植株上，發現菌株Z2-2 可引起楊梅苗發生楊梅凋萎病 (表1)。圖8 為接種病菌Z2-2 的楊梅苗發生楊梅凋萎病的相關癥狀，可以看出：接種Z2-2 的楊梅苗發病時，首先于接種病菌菌餅的葉痕處變黑，之后頂芽枯萎，從頂端葉片開始向下葉片出現枯萎癥狀；之后從接種發病的楊梅病株上重新分離病菌，經鑒定為可可毛色二孢菌Lasiodiplodia，因此最終確定病菌Z2-2 為致病菌。

表1 蘭溪市馬澗鎮下杜村的楊梅病菌分離鑒定情況Table 1 Isolation and identification of diseased bayberry branches from Xiadu Village, Majian Town, Lanxi City

圖8 Lasiodiplodia 在楊梅苗上的接種效果Fig.8 Lasiodiplodia inoculation effect on bayberry seedlings

2.4 離體抑菌活性

圖9 為不同濃度下Di Tech、Di ME 與Di@BLS在培養基中對Lasiodiplodia的離體抑制效果。3 種藥劑對Lasiodiplodia的EC50值分別為0.395、0.484和0.643 μg/mL (表2)，其中Di@BLS 的抑菌效果稍弱于Di ME 與Di。這可能是由于Di 從Di@BLS中釋放需要一定時間，因此Di@BLS 處理組中游離的Di 濃度低于Di ME 與Di Tech 處理組中的濃度。

表2 Di Tech、Di ME 和Di@BLS 對Lasiodiplodia 的抑菌活性Table 2 The antimicrobial activities of Di Tech, Di ME and Di@BLS against Lasiodiplodia

圖9 不同質量濃度下Di Tech、Di@BLS 與Di ME 對Lasiodiplodia 的抑制作用Fig.9 Inhibition of Di Tech, Di@BLS and Di ME on Lasiodiplodia at different concentrations

2.5 Di 在楊梅體內的吸收轉運

2.5.1 標準曲線及添加回收試驗結果 測定結果表明，Di 在0.05～120 μg/mL 濃度范圍內相關性良好，回歸方程為y=11641.6x+ 5122.3，決定系數R2= 0.999，表明儀器方法準確性良好，可用于定量分析。添加回收試驗結果(表3)表明，當Di 的添加水平在0.5～25 μg/mL 時，Di 的平均回收率為95%～97%，相對標準偏差為5.2%～9.9%，表明本研究建立的樣品前處理方法對Di 的回收率符合國家標準，可以用于后續對葉片中Di 提取試驗。

表3 苯醚甲環唑在楊梅葉片中的添加回收率Table 3 Recovery rate of difenoconazole in bayberry leaves

2.5.2 Di 在楊梅苗上的持效性 圖10 顯示了14 d 內Di 在楊梅苗體內的吸收轉運趨勢以及各部位持留情況。對比發現，Di ME 與Di@BLS 均能被楊梅苗葉部吸收，但其在體內的各部位含量變化差異較大。

圖10 Di@BLS 與Di ME 在楊梅苗上葉與下葉中含量的變化Fig.10 Changes of Di@BLS and Di ME contents in the upper and lower leaves of bayberry seedlings

對于向上運輸，處理1 d 后Di ME 處理組在楊梅上葉的含量為34.89 mg/kg ± 1.29 mg/kg，較高于Di@BLS 含量 (7.03 mg/kg ± 0.97 mg/kg)，這與已知的苯醚甲環唑作為一種內吸性殺菌劑能通過木質部向上傳導的性質保持一致，而將Di 進行納米包封后可能對其在楊梅體內的運輸方式上有所影響從而造成了短時間內的運輸差異。但隨著試驗時間的延長，Di@BLS 處理組的楊梅葉片中Di 含量較為穩定，并且在14 d 時Di 含量仍有所增加，為10.15 mg/kg ± 1.21 mg/kg，高于Di ME處理組的含量 (5.85 mg/kg ± 1.28 mg/kg)，而Di ME在前7 d 內含量快速下降后趨于平穩，這說明Di@BLS 具有良好的緩釋性能，使其保護藥劑不被快速降解，從而在楊梅植株體內具有更長的藥劑持效時間。

對于向下運輸，Di ME 在14 d 內呈現出了先增后減再增再減的趨勢，而Di@BLS 則是先增后減然后穩定增加的趨勢。兩者在前兩種趨勢上保持一致，這可能是由于下葉一邊接收來自處理葉的藥劑，一邊向下繼續運輸藥劑，在第4 天時兩者速度達到平衡，從而出現最多積累量。處理10 d后Di ME 含量快速下降，這可能是積累的藥劑降解所致；而Di@BLS 含量則是持續增長，證明了Di@BLS 能有效向下運輸Di 并且延緩其降解速度，提高藥劑持續期。綜上可知，Di@BLS 能通過楊梅苗葉部吸收至體內，并且擁有上下雙向運輸性能。此外，Di@BLS 的緩釋性能延緩了藥劑的降解，使具有更長的持留時間。

2.6 Di 的田間持效性

圖11 為Di@BLS 樹干注射30 d 后的GC-MS譜圖?？梢钥闯?，Di@BLS 中的Di 在30.3 min 時出峰，與Di 標準樣品的出峰時間相同。同時可以觀察到，在葉片與Di 標準樣品中，出現了同樣的SIM 離子碎片265 與323[20]，這是Di 的SIM 離子數值。證明楊梅樹中仍有Di@BLS 持留，而Di ME 樣品中沒有檢測出Di 存在。

圖11 苯醚甲環唑標樣 (a) 與楊梅葉片 (b) 的質譜圖；標樣 (c) 與葉片中苯醚甲環唑出峰位置 (d) 對應的SIM 離子圖Fig.11 The mass spectra of the standard sample(a) and bayberry leaves (b); SIM ion map corresponding to the peak position of difenoconazole standard sample (c) and the leaf (d).

2.7 盆栽試驗結果

圖12 為Di@BLS 和Di ME 對楊梅凋萎病的盆栽試驗防治效果?？梢钥闯?，與清水對照相比，噴施Di@BLS 和Di ME 均降低了楊梅凋萎病的發病率，其中Di ME 處理組的發病率為27.3%，Di@BLS處理組的發病率為25.0%，與Di ME 的接近，說明Di@BLS 對楊梅凋萎病具有較好的防治效果。

圖12 Di@BLS 和Di ME 在200 μg/mL 下對楊梅凋萎病的盆栽試驗防治效果Fig.12 Potted control effect of Di@BLS and Di ME on wilting disease of bayberry at 200 μg/mL

3 結論

本研究基于苯甲酸酐疏水化改性木質素磺酸鹽制備納米農藥，從納米載體濃度、料藥比、表面活性劑種類及用量等多方面進行配方優化，制備了負載苯醚甲環唑的木質素基納米農藥 (Di@BLS)，其外觀形貌呈現為球形顆粒，平均粒徑為135.2 nm。Di@BLS 的制備采用“溶劑揮發法”，苯醚甲環唑進入改性木質素磺酸鈉納米顆粒內部，并受到載體保護，在減少助劑用量得到納米制劑的同時，提升了苯醚甲環唑的持留效果。Di@BLS 具有良好的緩釋性能，相比于商品化的苯醚甲環唑微乳劑，其可以幫助苯醚甲環唑在楊梅體內存留更長時間，對楊梅提供更長久的保護。目前本研究僅處于探索發展階段，后續可通過控制粒徑、藥劑混配和提高葉面黏附性等進一步提高Di@BLS的性能，使此類木質素納米材料作為有效的緩釋納米載體更好地應用于作物病蟲害防控，該研究成果對于后續開發及構建緩釋農藥新制劑具有重要參考價值。