長爪鼩鼱和細鼩鼱分子系統地理學初步分析

梅秀峰 蔡赫 韓美鳳 趙鑫旭 張春鳳 時艷菁陳歡 田新民 張雋晟 劉鑄*

（1 牡丹江師范學院生命科學與技術學院，牡丹江 157011）（2 黑龍江農業經濟職業學院，牡丹江 157041）

長爪鼩鼱 (Sorex unguiculatus) 和細鼩鼱 (Sorex gracillimus) 隸屬勞亞食蟲目 (Eulipotyphla) 鼩鼱科(Soricidae) 鼩鼱屬 (Sorex)。長爪鼩鼱國內分布于黑龍江、內蒙古東部。國外分布于俄羅斯符拉迪沃斯托克 (海參崴)、薩哈林島 (庫頁島)、日本 (北海道) (Hutterer, 2005；劉鑄等，2019)。長爪鼩鼱未見亞種報道 (Hutterer, 2005; Burgin and He, 2018)。細鼩鼱國內分布于黑龍江、吉林、內蒙古東北部。國外分布于從鄂霍次克海東海岸到朝鮮半島北部、俄羅斯薩哈林島 (庫頁島)、日本 (北海道) (Hutterer, 2005；劉鑄等，2016)。細鼩鼱目前分為3 個亞種：S.g.gracillimus分布于薩哈林島和庫納施爾島；S.g.granti分布于南千島群島的齒舞島和色丹島；S.g.minor分布于俄羅斯遠東 (馬加丹南部到濱海邊疆區)、中國東北和朝鮮半島北部 (Burgin and He, 2018)。分布于日本北海道和北部一些小島上的細鼩鼱亞種歸屬還未確定 (Burgin and He,2018)。

長爪鼩鼱和細鼩鼱在分布區域上存在較大重疊 (Hoffmann, 1987; Hutterer, 2005; Burgin and He,2018；劉鑄等，2019)，然而兩個物種的地理系統分化格局可能并不相同。Ohdachi 等 (1997a,1997b) 利用Cytb基因片段 (402 bp) 和化石記錄分析了東北亞地區分布的鼩鼱亞科動物的地理史，認為細鼩鼱是分布于東北亞地區的原始祖先成員之一，而長爪鼩鼱在細鼩鼱遷移到日本群島和薩哈林島之前，分布于原始東西伯利亞的局域避難所中。Ohdachi 等 (2001) 報道了長爪鼩鼱的分子系統關系和地理分布關系無相關性，而細鼩鼱的分子系統關系和地理分布關系存在一定相關性，尤其是俄羅斯馬加丹地區分布的細鼩鼱與其他各分布地域存在明顯分子系統分化?？梢?，已報道的細鼩鼱分子系統地理分化與其亞種分化不一致。我國東北分布細鼩鼱新記錄報道中暗示著我國東北分布區的細鼩鼱存在特異化 (劉鑄等，2016)。

本研究目的：(1) 明確長爪鼩鼱和細鼩鼱的種群系統地理關系；(2) 進一步明確長爪鼩鼱和細鼩鼱2個物種的亞種分化問題。

1 研究方法

1.1 樣本采集

長爪鼩鼱和細鼩鼱樣本的采集主要采用陷阱法，輔以鋏捕法。在黑龍江省橫道河子地區 (采集地海拔約740 m，北緯44°48′44″ ，東經129°02′04″) 采集長爪鼩鼱樣本6 號 (HD21、HD26、HD43、HD91、HD94、HD99) 和細鼩鼱樣本11 號(HD12、HD19、HD25、HD52、HD106、HD107、HD115、HD135、HD138、HD157、HD183)，牡丹峰地區 (采集地海拔約480 m，北緯44°47′48″，東經129°04′52″) 采集長爪鼩鼱樣本3 號 (MD60、MD91、MD125) 和細鼩鼱樣本1 號 (MD7)，雙峰地區 (采集地海拔約640 m，北緯44°30′04″，東經128°51′14″) 采集長爪鼩鼱樣本2 號 (SF1、SF2)，鳳凰山地區 (采集地海拔約520 m，北緯44°27′48″，東經128°12′40″) 采集細鼩鼱樣本5 號(FH1、FH14、FH102、FH103、FH120)?；诂F有數據情況，從GenBank 下載了東北亞其他地區長爪鼩鼱的Cytb基因全序列和細鼩鼱Cytb基因的序列片段 (基本信息見附錄A)。

1.2 實驗方法

用剪刀剪取樣本腿部肌肉組織，肌肉組織用酚-氯仿法進行基因組DNA 提取。線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA) 的Cytb基因全序列PCR 反應體系為50 μL，含200 μmol/L 的dNTP，1.5 mmol/L 的MgCl2，引物L14724/H15915 (Irwinet al., 1991) 各10 pmol，Taq DNA 聚合酶2.5 U(大連寶生物)，模板為250 ng。PCR 擴增的反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，共30 個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR 擴增產物經純化回收，進行測序 (哈爾濱博仕生物技術有限公司)。

1.3 數據處理

鑒于GenBank 現有長爪鼩鼱和細鼩鼱的Cytb基因序列，利用Cytb基因全序列 (1 140 bp) 作為長爪鼩鼱的分子標記；在GenBank 中細鼩鼱僅有Cytb序列片斷，為便于比較，本文利用Cytb基因前端序列片段 (630 bp) 作為細鼩鼱的分子標記。使用EditSeq (DNASTAR 軟件包) 對實驗獲得mtDNA Cytb基因序列和GenBank下載序列一并進行編輯，再利用Clustal W (Thompsonet al., 1997) 軟件進行序列聚類比對。利用DnaSP 5.10 (Librado and Rozas, 2009) 分析多態位點數量 (Number of polymorphic sites,s)、單倍型數量 (Number of haplotypes,k)、核苷酸多態性 (Nucleotide diversity, π)、核苷酸差異平均數 (Average number of nucleotide differences,i) 及單倍型多態性 (Haplotype diversity,h)。利用軟件RAxML 采用密碼子分區段分析方式構建最大似然法 (Maximum likelihood, ML) 系統發生樹(Stamatakis, 2014)。利用Network 10.2 (Bandeltet al., 1999) 構建中介網絡圖 (median-joining network) 分析單倍型間的進化關系。利用DnaSP 5.10軟件計算Tajima’s D 和 Fu’s Fs 參數，檢測中性選擇情況，進行顯著性檢測，并結合種群的增減模型 (A population growth-decline model) 分析錯配分布來檢測種群的數量擴張情況 (Rozaset al., 2003)。

2 結果

2.1 Cyt b基因的遺傳多樣性

長爪鼩鼱的Cytb基因全序列1 140 bp，包含77 個變異位點，其中41 個簡約信息位點 (Parsimony informative sites)，36 個單變異位點 (Singleton variable sites)，變異位點數占總位點數的6.75%，未見插入和缺失。細鼩鼱的Cytb基因序列630 bp，包含35 個變異位點，其中27 個簡約信息位點，8 個單變異位點，變異位點數占總位點數的5.56%，未見插入和缺失。

長爪鼩鼱和細鼩鼱的遺傳多樣性參數見表1。長爪鼩鼱在43 個樣本中發現36 個單倍型，核苷酸多態性0.015 5。細鼩鼱在39個樣本中發現22個單倍型，核苷酸多態性0.016 3。

表1 長爪鼩鼱和細鼩鼱的遺傳多樣性參數Table 1 The genetic diversity indices of Sorex unguiculatus and Sorex gracillimus

2.2 長爪鼩鼱和細鼩鼱的系統發育分析

系統發生樹顯示長爪鼩鼱存在2 個進化支系，說明不同樣本之間存在一定的遺傳差異 (圖1a)，但是這2個支系的后驗支持率較低 (支持率27)，因此長爪鼩鼱種內不存在穩定的遺傳分化。其次，來自同一地區的樣本，分別聚類于不同進化分支上。我國橫道河子地區的6個樣本分別聚類于分化關系較遠的2個進化分支上，HD21和HD26與地理分布關系較遠的3 個日本北海道樣本 (Hokkaido 8、Hokkaido 21 和Hokkaido 23) 和1 個俄羅斯薩哈林島樣本 (Sakhalin 2) 聚類于同一小分支上，而HD43、HD91、HD94 和HD99 與我國其他分布區樣本以及1 個日本北海道樣本 (Hokkaido 17) 聚類于同一小分支上 (圖1a)。說明長爪鼩鼱的分子系統關系與地理分布無相關性。

圖1 基于Cyt b 基因構建的長爪鼩鼱 (a) 和細鼩鼱 (b) 的ML系統進化樹Fig.1 The ML Phylogenetic tree of S. unguiculatus (a) and S. gracillimus (b) based on the Cyt b gene

系統發生樹顯示細鼩鼱分子系統關系與地理分布表現出一定的相關性。細鼩鼱樣本分為2 個分支，且表現出了較為顯著的分化，來自于俄羅斯和日本北海道的細鼩鼱樣本構成一個進化支，我國東北樣本構成另一個獨立的進化支 (圖1b)。

2.3 長爪鼩鼱和細鼩鼱的中介網絡分析

中介網絡圖顯示我國長爪鼩鼱單倍型分布在中介網絡圖的兩端，右端2 個樣本與日本北海道3 個樣本具有共同的單倍型和網絡分化地位，左端7 個單倍型聚成一簇，同樣表現出與地理距離較遠的日本北海道單倍型具有較近的網絡關系 (圖2a)。中介網絡圖明顯表現出長爪鼩鼱的分子系統關系與地理分布無相關性。

圖2 長爪鼩鼱 (a) 和細鼩鼱 (b) 的單倍型中介網絡圖. 長爪鼩鼱最短樹的突變數為141，細鼩鼱最短樹的突變數為44，不同地理分布的樣本單倍型用不同的顏色進行表示Fig. 2 Median-joining network of haplotypes of S. unguiculatus (a) and S. gracillimus (b). The number of mutations of the S. unguiculatus shortest tree = 141. The number of mutations of the S. gracillimus shortest tree = 44. Geographical origin of haplotypes of samples is indicated by color

細鼩鼱的分子系統關系與地理分布表現出一定的相關性。中介網絡圖分成兩大部分，我國東北樣本都分布在中介網絡圖的右端，其中出現由11 個樣本構成的主要單倍型，位于中介網絡圖右端中央位置 (圖2b)。俄羅斯和日本北海道樣本分布于中介網絡圖的左端，表現出與我國東北樣本存在明顯的分化，日本北海道單倍型之間表現出較近的網絡關系，左上方2個來自于俄羅斯馬加丹地區的單倍型，表現出與其他單倍型具有較遠的網絡關系 (圖2b)。

2.4 長爪鼩鼱和細鼩鼱的種群歷史動態分析

長爪鼩鼱的Tajima’s D 結果 (D = -0.1164,P＞ 0.1) 盡管不顯著，但為負值，Fu’s Fs 結果(Fs = -12.7320,P＜ 0.001) 為顯著性負值 (表1)。中性檢測結果顯示長爪鼩鼱近期可能發生過種群擴張。細鼩鼱的Tajima’s D 結果 (D = 0.7558,P＞0.1) 為非顯著性正值，Fu’s Fs結果 (Fs = -3.3370,P＞ 0.01) 為非顯著性負值 (表1)，中性檢測結果顯示細鼩鼱未經歷過數量急劇擴張。采用錯配分布方法對種群歷史進行檢驗，長爪鼩鼱的錯配曲線是多峰曲線 (圖3a)，說明長爪鼩鼱近期盡管經歷了種群擴張，但并非為單次急劇擴張。細鼩鼱的錯配曲線是雙峰曲線 (圖3b)，說明細鼩鼱經歷了較為復雜的歷史，但并未經歷過單次數量急劇擴張。

圖3 突然擴張模型下長爪鼩鼱 (a) 和細鼩鼱 (b) 的錯配分布圖Fig. 3 The observed pairwise difference and the expected mismatch distributions for S. unguiculatus (a) and S. gracillimus (b) under the sudden expansion model

3 討論

3.1 長爪鼩鼱和細鼩鼱的遺傳分化

本研究結果顯示，長爪鼩鼱的系統發生樹未表現出明顯的地理遺傳分化，來自俄羅斯薩哈林島和日本北海道的樣本并未表現出島嶼種群與大陸種群存在遺傳分化，甚至是來自于千島群島，這些小島的樣本也未表現出明顯的遺傳分化。推測長爪鼩鼱種群離開冰期避難所后，占據目前的分布地域時間較短，還未形成進一步地理上的遺傳分化。劉鑄等 (2020a) 對中鼩鼱 (S.caecutiens)的遺傳分化進行了分析，歐亞大陸分布的中鼩鼱的遺傳分化結果與本研究得出的遺傳分化結果類似，即未形成進一步的遺傳分化，但分布于濟州島和北海道的中鼩鼱顯現出一定的遺傳分化，推測長爪鼩鼱種群離開冰期避難所后，占據目前的分布地域的時間要晚于中鼩鼱。

本研究結果顯示，細鼩鼱的系統發生樹表現出明顯的地理遺傳分化，特別是我國分布的細鼩鼱單獨聚為一支。在俄羅斯和日本的進化分支上，分布于地理距離較遠的馬加丹的樣本，也顯現出了明顯的遺傳分化，可見細鼩鼱在歐亞大陸上存在的遺傳分化，不同于長爪鼩鼱和中鼩鼱 (劉鑄等，2020a)，推測細鼩鼱種群離開冰期避難所后，占據目前的分布地域時間較長，已經形成進一步的遺傳分化。本研究結果與Ohdachi等 (2001) 認為細鼩鼱分布于現在的分布區要久遠于長爪鼩鼱的結論一致。

3.2 長爪鼩鼱和細鼩鼱的分子系統地理學分析

Hutchison 和Templeton (1999) 詮釋了種群結構的踏石模型 (stepping-stone model)，認為在一個物種 (種群) 的分布區內，遺傳距離和地理距離的關系能夠說明基因流和遺傳漂變在物種 (種群) 的分布區擴張或擴散中的影響。也就是說，如果遺傳距離和地理距離表現出正相關，說明這個物種 (種群) 占據目前的分布區已經很長一段時間了，這段時間足夠使基因流和遺傳漂變達到平衡。長爪鼩鼱的遺傳分化與地理距離無相關性，推測其占據目前的分布區時間較短，基因流和遺傳漂變未達到平衡。細鼩鼱的遺傳分化與地理距離表現出相關性，推測其占據目前的分布區域時間較長，已經形成進一步的遺傳分化。

系統發生樹和中介網絡圖顯示長爪鼩鼱的分子系統地理關系基本一致，所有樣本聚集在一個大支上，進化支內部缺乏明顯的進一步的遺傳分化，與以往的報道結果類似 (Ohdachiet al., 1997a,1997b, 2001)，表現出長爪鼩鼱遺傳分化與地理分布關聯性較弱。在第四紀冰期利用同一個冰期避難所的哺乳動物，例如灰狼 (Canis lupus)、貂熊(Gulo gulo)、紫貂(Martes zibellina) 和北松鼠 (Sciurus vulgaris) 具有類似的研究結果 (Vilaet al.,1999; Walkeret al., 2001; Liet al., 2013; Liuet al.,2014)，推測長爪鼩鼱源自于相同的冰期避難所。Ohdachi 等 (1997a, 1997b) 認為長爪鼩鼱在細鼩鼱遷移到日本群島和薩哈林島之前，存在于原始東西伯利亞的局域避難所中，本研究的分析結果與其一致。系統發生樹和中介網絡圖顯示細鼩鼱的分子系統地理關系基本一致，我國東北分布區樣本與俄羅斯和日本北海道樣本存在明顯的遺傳分化，推測細鼩鼱在第四紀冰期利用了2個冰期避難所。鼩鼱屬已有研究顯示諸多物種的冰期避難所和冰期后擴散與其分布的北方針葉林 (扁顱鼩鼱S.roboratus、中鼩鼱、遠東鼩鼱S.isodon、姬鼩鼱S.minutissimus) 或溫帶針闊混交林 (普通鼩鼱S.araneus) 度過冰期的歷史事件有著密切聯系(Hopeet al., 2010; Bannikovaet al., 2010, 2018; Raspopovaet al., 2018)。目前細鼩鼱主要分布于溫帶針闊混交林 (劉鑄等，2019)，推測細鼩鼱冰期避難所的利用與其生境中的主要樹種避難所的利用有著密切關系。我國東北地區的樟子松 (Pinus sylvestris)、赤松 (P.densiflora)、長白松 (P.funebris)、興凱湖松 (P.takahasii)、臭冷杉 (Abies nephrolepis) 和杉松 (A.holophylla) 的系統地理學分析都認為長白山避難所是東北亞地區第四紀冰期的一個重要避難所 (Jianget al., 2011; Renet al.,2012)，遠東鼩鼱的分子系統地理學分析也顯示其利用了長白山避難所 (劉鑄等，2020b)。推測我國東北分布區的細鼩鼱來源于冰期的長白山避難所。對蒙古櫟 (Quercus mongolica) 的系統地理學分析發現了第四紀冰期俄羅斯遠東避難所的存在(Zenget al., 2015)，推測俄羅斯和日本北海道的細鼩鼱來源于冰期俄羅斯遠東避難所。

長爪鼩鼱目前未見亞種報道 (Hutterer, 2005;Burgin and He, 2018)，本研究系統發生樹和中介網絡圖結果支持長爪鼩鼱無亞種分化的觀點。細鼩鼱目前分為3 個亞種：S.g.gracillimus分布于薩哈林島和庫納施爾島；S.g.granti分布于南千島群島的齒舞島和色丹島；S.g.minor分布于俄羅斯遠東 (馬加丹南部到濱海邊疆區)、中國東北和朝鮮半島北部 (Burgin and He, 2018)。目前分布于日本北海道和日本北部的一些小島上的細鼩鼱還未見亞種歸屬的報道 (Burgin and He, 2018)。由于本研究未包含分布于南千島群島的齒舞島和色丹島的細鼩鼱樣本，其亞種分類地位不能確定。本研究的細鼩鼱系統發生樹和中介網絡圖結果支持將本研究包含的地理區域分成兩個地理亞種，一個亞種分布于中國東北，另一個亞種分布于俄羅斯遠東 (馬加丹南部到濱海邊疆區，包括薩哈林島)和日本北海道。