基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術分析通竅活血湯化學成分

盧廣英，韓冰冰，劉洋洋，婁 原，馬 柯，王世軍，王 媛

（山東中醫藥大學，山東省中醫經典名方協同創新中心，山東 濟南 250355）

通竅活血湯出自清代王清任的《醫林改錯》，由赤芍、川芎、桃仁、紅花、生姜、蔥、大棗、麝香等8 味藥物構成，具有活血通竅之功，可抗炎、抗氧化、改善腦微循環、抑制腦細胞凋亡，臨床廣泛用于治療缺血性腦卒中[1]、顱腦損傷[2]、血管性癡呆[3]等疾病，尤善治療腦缺血再灌注損傷，其機制可能是通過促進星形膠質細胞活化，調節星形膠質細胞谷氨酸-谷氨酰胺循環，降低谷氨酸興奮性毒性來改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經功能[4]。

通竅活血湯作為活血化瘀類經典名方，臨床療效顯著，但其化學成分尚未系統分析，且無明確質量評價指標，化學物質組成不明確，制約了其藥效物質基礎的深入研究及質量控制指標的確定。本實驗采用超高效液相色譜-飛行時間串聯質譜法（UPLC-Q-TOFMS/MS）對通竅活血湯的化學成分進行系統分析與鑒定，以期為其質量控制及藥效物質基礎研究提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1290 型超高效液相色譜儀（DAD 檢測器）、Agilent Q-TOF 6545 型LC/MS 高分辨串聯質譜（美國安捷倫科技公司）；ME104 型電子分析天平[梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司]；KQ-300 BD 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

赤 芍（ 批 號：2107290152）、 川 芎（ 批 號：2108050093）、桃仁（批號：2103280472）、紅花（批號：2108230012）均購自亳州市滬譙藥業有限公司；生姜（批號：20210909）購自山東澤瑩商貿有限公司；蔥（批號：201213）購自河北宏濟堂藥業有限公司；大棗（批號：19040701）購自山東博康中藥飲片有限公司；麝香（批號：19052701）購自山東省藥材有限公司。經山東中醫藥大學劉紅燕副教授鑒定，均符合2020 年版《中國藥典》（一部）有關規定。乙腈、甲醇、甲酸為質譜純（德國Merck 公司）；純凈水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

對 照 品 芍 藥 苷（ 批 號：M28GB143089）、 熊果酸（批號：C15O11Q126879）、綠原酸（批號：A22GB158496）、棕櫚酸（批號：M02D11K133109）均購自上海源葉生物科技有限公司；洋川芎內酯 A（批號：C14082262）、木蘭花堿（批號：C14975194）均購自上海麥克林生化科技股份有限公司；山柰酚-3-O- 蕓香糖苷（批號：ST08020120）購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；所有對照品質量分數均大于 98%。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1mm ×100 mm, 1.8 μm)，流動相：乙腈（A） - 0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0 ～ 5 min，5%A；5 ～ 20 min，5% →10%A；20 ～ 40 min，10% →15%A；40 ～ 60 min，15% →25%A；60 ～ 70 min，25% →27%A；70 ～ 90 min，27% →37%A ；90 ～ 115 min，37% →47%A；115 ～ 145 min，47% →55%A；145 ～ 155 min，55% →70%A；155 ～ 170 min，70%→95%A），柱溫：30℃，流速：0.3 mL/min；進樣量：5μL。

2.2 質譜條件

電噴霧離子源采用正負離子掃描模式，霧化氣體為氮氣，掃描范圍m/z為50 ～1 700，干燥氣溫度為320 ℃，干燥氣流速為8 L/min，鞘氣溫度為350 ℃，鞘氣流速為11 L/min，毛細管電壓為4 000 V，噴嘴電壓為1 000 V，裂解電壓為175 V，錐孔電壓為60 V，碰撞能量為40 eV。數據采集軟件為Agilent Q-TOF 6545 LC/MS，數據處理軟件為Qualitative Analysis。

2.3 供試品溶液的制備

根據《醫林改錯》中通竅活血湯的藥物組成及配伍比例并結合課題組前期實驗研究[4]，按比例稱取赤芍3 g，川芎3 g，桃仁9 g，紅花9 g，老蔥6 g，生姜9 g，大棗七枚約21 g，置于5 000 mL 圓底燒瓶中，精密加入10 倍量75%乙醇，搖勻，浸泡1 h，回流提取2 h，過濾，濾渣再加入8 倍量75%乙醇，回流提取1 h，過濾，合并兩次濾液，濃縮至無醇味，濾液減壓濃縮成適宜濃度，加入麝香0.15 g，用黃酒溶解并稀釋定容成 1 g/mL 的儲備液。精密移取儲備液1 mL，置5 mL 容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心（12 000 r/min）5 min，取上清液，即得。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取對照品山柰酚-3-O- 蕓香糖苷、芍藥苷、熊果酸、綠原酸、棕櫚酸、洋川芎內酯 A 和木蘭花堿各1 mg，分別加 50%甲醇溶解并定容于1 mL容量瓶，得對照品母液，4℃ 冷藏備用。分別精密吸取適量對照品母液，50%甲醇稀釋并定容至5 mL 容量瓶，得對照品溶液，用 0.22 μm 微孔濾膜過濾，備用。

2.5 數據處理分析

通過PubChem 在線數據庫、SciFinder、中國知網數據庫檢索，收集通竅活血湯組方中7 味中藥所含成分的分子式、中英文名稱、準分子離子及特征碎片離子等信息，建成Excel 格式質譜數據庫。采用Qualitative Analysis 分析軟件，根據分子式計算出精確質量數及可能的準分子離子質荷比，并以此對采集的質譜數據進行峰提取，與PCDL Manager B.07.00 數據庫中的對照品的準分子離子質荷比、特征碎片離子質荷比以及文獻中的裂解規律進行比對分析，對樣品中的化合物進行快速鑒定，確認推斷成分。無法獲得對照品的化合物，先依據 MS/MS 碎片信息，計算出每一個二級碎片的元素組成，推測其裂解方式，再解析化合物結構。

3 結果與分析

3.1 結果

采用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術對供試品溶液進行正、負離子全掃描，獲得正、負離子模式下的BPI圖見圖1。

圖1 正、負離子模式下通竅活血湯基峰離子流圖Fig.1 BPC of Tongqiao Huoxue decoction in ESI+ and ESl-

采用 Qualitative Analysis 分析軟件，對正、負離子模式下采集的通竅活血湯樣品提取離子流 (BPC)，根據一級質譜信息，確定化合物的分子量和分子式，并通過參考 SciFinder、PubChem 數據庫、中國知網數據庫、文獻報道以及化合物的二級質譜數據信息進行鑒定，共鑒定出55 個化合物，結果見表1。

表1 通竅活血湯 UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析Tab.1 UPLC-Q-TOF-MS/MS analysis results of Tongqiao Huoxue decoction

3.2 化學成分鑒定

3.2.1 黃酮類化合物 通竅活血湯中的黃酮類化合物主要來源于紅花、大棗、桃仁等，從通竅活血湯中共鑒別出 15 個黃酮類化合物，包括化合物7、8、11、14、16、18、19、20、24、26、28、29。對于黃酮類化合物而言，它的 A、B 環上常有甲氧基、甲基等官能團，且常與糖結合成苷類，故在質譜的高能碰撞中，糖苷鍵的斷裂、RDA 裂解、CO、CO2等中性離子的丟失是黃酮類化合物的主要裂解方式。

以化合物24 為例，在負離子模式下，由一、二級質譜數據可知m/z593.147 6 為[M-H]-峰，軟件擬合分子式為 C27H30O15，二級質譜有m/z285.040 4[M-H-Glc-Rha]-、m/z255.029 5[M-H-Glc-Rha-CO-2H]-、151.003 2[[M-H-Glc-Rha-C8H6O2]-等 碎 片 離子。對照文獻[5-6]及化合物質譜信息，確定為山柰酚-3-O- 蕓香糖苷。

3.2.2 萜類化合物 通竅活血湯中的萜類化合物主要來源于赤芍、大棗、紅花等。從通竅活血湯中共鑒別出 13 個萜類化合物，包括化合物10、13、21、33、35、40、41、44、47、48、49、51、52。主要為蒎烷型單萜苷類（化合物 10、13、21、33、35）和三萜類（化合物 40、41、44、47、48、49、51、52）。

蒎烷型單萜苷類化合物在質譜裂解中常丟失 H2O和 CH2O 分子，或失去糖基分子，在過程中常伴隨著分子重排裂解，以麥氏重排多見，且裂解方式受功能基的影響較大，常出現失去苯甲酸（BA）的離子碎片，該類化合物在負離子模式下主要以[M-H+HCOOH]形式存在，少數以[M-H]-形式存在。在二級質譜中，母離子[M-H+HCOOH]-易失去1 分子BA，形成[MH-122]-、m/z121 [BA-H]-的特征碎片離子。

以化合物13 為例，在負離子模式下，由一、二級質譜數據可知m/z525.161 4 為[M+HCOOH-H]-峰，軟件擬合分子式為C23H28O11，m/z479.161 4為[M-H]-峰， 二 級 質 譜 有m/z327.108 5[M-HHCHO-C7H6O2]-、m/z165.054 7[M-H-HCHO-C7H6O2-C6H10O5]-、m/z121.029 6[M-H-C16H22O9]+、m/z77.039 5[M-H-HCHO-C15H20O8-CO2]-等碎片離子。對照文獻[7-8]及化合物質譜信息，確定為芍藥苷。

三萜類化合物常游離存在或以與糖結合成酯或苷的形式存在，故其質譜裂解規律多為糖苷鍵的斷裂，裂解過程中可能會丟失1 個或多個H2O、CO2、或糖基分子等，來源于大棗和赤芍飲片。

以化合物49 為例，在負離子模式下，由一、二級質譜數據可知m/z455.351 7 為[M-H]-峰，軟件擬合分子式為C30H48O3，二級質譜有m/z407.329 5[M-HCOO-H4]-等碎片離子。對照文獻[9-10]及化合物質譜信息，確定為熊果酸。

3.2.3 生物堿類化合物 通竅活血湯中的生物堿類化合物主要來源于大棗、紅花等。從通竅活血湯中共鑒別出6 個生物堿類化合物，包括化合物12、15、31、32、34、36，主要為季銨型生物堿（化合物12、15）和亞精胺類生物堿（化合物31、32、34、36）。質譜裂解規律主要為丟失母核側鏈的OH、CH3、OCH3以及逐級脫去-CH2、-CH、-C2H2、-CH2O2、-C2H4O2和-C3H6O2等形成碎片離子。此外還可發生吡啶環的α 裂解。

以化合物12 為例，在正離子模式下，由一、二級質譜數據可知m/z342.170 1 為[M]+峰，軟件擬合分子式為C20H24NO4+，二級質譜有m/z297.111 6[M-C2H7N]+、282.088 2[M-C2H7N-CH3]+、265.085 0[M-C2H7N-CH3-OH]+、250.061 5[M-C2H7N-CH3-OHCH3]+、237.089 9[M-C2H7N-CH3-OH-CO]+、222.066 9[M-C2H7N-CH3-OH-CO-CH3]+等碎片離子。對照文獻[11-12]及化合物質譜信息，確定為木蘭花堿。

3.2.4 苯肽類化合物 通竅活血湯中的苯肽類化合物主要來源于川芎等。從通竅活血湯中共鑒別出5 個苯肽類化合物，包括化合物22、23、37、38、45。苯肽類化合物在質譜裂解中時易側鏈斷裂脫烯（CnH2n）和開環脫水再脫羰（H2O+CO）。

以化合物37 為例，在正離子模式下，由一、二級質譜數據可知m/z193.122 3 為[M+H]+峰，軟件擬合分子式為C12H16O2，二級質譜有m/z165.068 7[M+HC2H4]+、m/z105.069 2[M+H-H2O-CO-C3H6]+、m/z91.053 8[M+H-H2O-CO-C3H6-CH2]+、m/z77.038 1[M+H-CH2]+等碎片離子。對照文獻[13-14]及化合物質譜信息，確定為洋川芎內酯A。

3.2.5 酚類化合物 通竅活血湯中的酚類化合物主要來源于桃仁、紅花、赤芍、生姜等。從通竅活血湯中共鑒別出 5 個酚類化合物，包括化合物3、4、5、9、42。酚類化合物在質譜裂解中易丟失 H2O、COOH、CO2、CO、CH 等，從而產生相應的特征碎片離子峰。

以化合物5 為例，在負離子模式下，由一、二級質譜數據可知m/z353.087 6 為[M-H]-峰，軟件擬合分子式為C16H18O9，二級質譜有m/z191.055 7[M-H-C9H6O3]-、m/z173.044 9[M-H-C9H6O3-H2O]-、m/z127.038 7[M-H-C9H6O3-H2O-CO]-、m/z85.029 0[M-H-C9H6O3-H2O-CO-H2O-C2]-、m/z59.013 3[M-HC9H6O3-H2O-CO-C4H4O]-等碎片離子。對照文獻[15]及化合物質譜信息，確定為綠原酸。

3.2.6 脂肪酸類化合物 通竅活血湯中的脂肪酸類化合物主要來源于桃仁等。從通竅活血湯中共鑒別出 5 個脂肪酸類化合物，包括化合物39、46、50、53、54。脂肪酸類化合物結構包含脂肪鏈和羧基或酯基基團，容易發生α-裂解產生[M-H-CO]-、[M-HCO2]-、[M-H-H2O]-、[M-H-COOH]-、[M-H-CH]-、[M-H-CH2]-等類型的特征碎片離子。脂肪酸類化合物主要由 Compound Discoverer 3.0 軟件推測得到。

以化合物53 為例，在負離子模式下，由一、二級質譜數據可知m/z255.232 2 為[M-H]-峰，軟件擬合分子式為C16H32O2，二級質譜有m/z237.024 8[M-H-H2O]-、m/z140.995 8[M-H-C5H10COOH]-等碎片離子。對照文獻[16]及化合物質譜信息，確定為棕櫚酸。

3.2.7 其他類化合物 通竅活血湯還鑒別出了糖類、核苷類、苷類、鞣質、聚炔類、酰胺類等6 個化合物，分別為蔗糖（1）、環磷酸腺苷（2）、苦杏仁苷（6）、1,2,3,4,6-O- 五沒食子酰葡萄糖（27）、1,3-Diacetoxy-4,6,12-tetradecatriene-8,10-diyne（43）、芥酸酰胺（55）。

4 討論

通過參考 SciFinder 和中國知網數據庫、文獻報道以及化合物的保留時間、精確準分子離子峰和二級質譜碎片等信息，初步鑒定并推測出55 個化合物，包括黃酮類15 個、萜類13 個、生物堿類6 個、苯肽類5 個、酚類4 個、脂肪酸5 個，此外還有少數其它類型化合物，并對化合物的藥材來源進行了歸屬。對于部分化合物存在同分異構體的情況，需采用對照品及NMR 等技術手段進一步驗證。正、負離子流圖顯示，仍存在一些響應值較高但未鑒定出的成分，這些成分還有待于進一步分離鑒定。因通竅活血湯中麝香藥材的成分麝香酮為揮發性成分，故本實驗未能用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術檢測出麝香藥材中的成分，后續將采用GC-MS 技術等進行深入研究。

方中的黃酮類化合物主要來自紅花、桃仁，紅花中的羥基紅花黃色素A 和羥基紅花黃色素B 可通過調節沉默調節蛋白1 信號通路，減輕氧化應激和細胞凋亡，對腦缺血再灌注損傷起到保護作用[30]，桃仁中的柚皮素可通過抑制炎癥因子分泌，減輕創傷性顱腦損傷后過度炎性反應[31]，萜類化合物主要來自赤芍和大棗，赤芍中的芍藥苷可通過激活 LKB1/AMPK 信號通路對急性腦梗死大鼠神經損傷起到保護作用[32]，大棗中的三萜酸類化合物具有抗氧化、保肝作用[33-34]，川芎中的苯酞類化合物具有抗氧化損傷、抗動脈粥樣硬化、抗凝血、抗炎、抗腦缺血再灌注損傷的藥理作用，廣泛用于治療缺血性腦卒中、骨關節炎[35-36]等，桃仁中的苦杏仁苷及脂肪酸類化合物具有心腦血管保護、抑制動脈粥樣硬化、抗腫瘤作用[37-38]，生姜中的姜辣素類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎作用[39]。這些物質可能為通竅活血湯的藥效物質基礎。

5 結論

本實驗采用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術，快速全面地對通竅活血湯中的化學成分進行了初步定性分析，并對所有化學成分進行了藥材來源歸屬，方法穩定可靠，為進一步對通竅活血湯的入血成分分析做準備，也為深入研究該方的藥效物質基礎及其作用機制和質量控制提供了理論依據。