防風藥材質量調查研究

姚 瑤，于鵬程，宋孝文，趙 楷，關 瑜，孟祥才

（黑龍江中醫藥大學 藥學院,黑龍江 哈爾濱 150040）

防風為傘形科植物防風Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根，具有祛風解表、勝濕止痛、止痙的功效，用于治療感冒頭痛、風濕痹痛、風疹瘙癢、破傷風等[1]。防風喜光、耐旱、耐寒，適應性很強[2]，分布區域廣，不同產地藥材質量相差較大。2020 年版《中國藥典》規定，防風中的升麻素苷和5-O- 甲基維斯阿米醇苷兩種色原酮的總量不得少于0.24%[1]，對不同產地防風質量分析表明升麻素苷和5-O- 甲基維斯阿米醇苷含量差異較大。種質和環境是影響藥材質量的最主要因素[3]。防風依據種質可分為水防風與關防風，水防風指的是河北及內蒙古赤峰種子所種植的防風，而關防風指的是黑龍江及內蒙古種子所種植的防風，兩者為防風植物的不同生態型，其中關防風質量較佳，但產量較低。干旱是影響藥材質量的主要生態因子[4]，防風主要生長在干旱地區，為典型的陽性植物，主產于我國東北地區和華北地區，黑龍江種植面積占全國種植面積的50%以上，以黑龍江和內蒙古產量最大[5]。為此，本文對防風藥材質量進行調查研究，分析藥材質量形成因素，以期為優質藥材生產提供指導。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

42 批防風樣品來源信息見表1，經黑龍江中醫藥大學孟祥才教授鑒定為傘形科植物防風Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根。

表1 防風樣品信息Tab.1 Radix Saposhnikoviae sample information

1.2 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國 Waters 公司）；CPA225D 型精密分析電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.3 試劑

升麻素苷（批號：111522-202214，純度：95.7%）、升麻素（批號：111710-200602，純度≥98.0%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號：111523-202212，純度：97.8%）、亥茅酚苷（批號：111714-200501，純度≥98.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，美國迪馬公司）、娃哈哈純凈水、甲醇（分析純，天津市天力化學試劑有限公司）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基維斯阿米醇苷及亥茅酚苷對照品適量，分別加甲醇溶解并定容制成含量為3.784 mg/mL、0.424 mg/mL、3.488 mg/mL、0.208 mg/mL 的對照品貯備液，精密量取上述各對照品貯備液1 mL 置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取防風粉末（過60 目篩）0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定重量，水浴回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2 色譜條件

DIKMA C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇（A）-水（B）為流動相進行梯度洗脫，0 ～8 min，30%→50%A；8 ～ 18 min，50%→70%A；18 ～30 min，70%A。柱溫：40℃；流速：1.0 mL/min；二極管陣列(PDA)檢測器檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。色譜圖見圖1。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別精密量取“2.1.1”項下制備的各對照品貯備液0.05、0.1 、0.2、0.4 、0.6、0.8、1、1.2 mL，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，以濃度（X，μg/mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，結果見表2。結果表明，升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷在各自濃度范圍內線性關系良好。

表2 色原酮成分的線性關系考察結果Tab.2 Investigation results of linear relationship of chromone components

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下制備的溶液，重復進樣6 次，進樣量10 μL。升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷峰面積的RSD 值分別為1.35%、1.63%、1.25%、1.67%，均小于2.0%，表明該儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取42 號防風樣品粉末，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，并按“2.2”項下的進樣條件進行測定，升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量的RSD 分別為0.28%、2.75%、1.07%、2.79%，均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 取42 號防風樣品粉末，按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液，在室溫放置12 h，分別于0、3、6、9 和12 h 進行測定。升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷峰面積的RSD 分別為1.76%、1.78%、0.79%、1.64%，均小于3.0%，表明供試品溶液在12 h 內穩定。

2.3.5 加樣回收率試驗 取9 號防風樣品粉末，分別添加升麻苷、升麻素、5-O- 甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷對照品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜峰面積并計算加樣回收率，結果見表3，表明該方法回收率良好。

表3 加樣回收率試驗結果（mg，n = 6）Tab.3 Result of sample recovery tests（mg，n = 6）

2.4 統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件進行數據統計和分析，對其進行聚類分析、Pearson 相關性分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 色原酮成分含量測定

3.1.1 色原酮成分含量測定結果 精密稱定防風藥材粉末適量，按“2.1.2”項下制備供試品溶液，后按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜峰面積并計算樣品含量。結果見表4。

表4 防風色原酮含量測定結果（mg/g，n = 3）Tab.4 Determination results of Radix Saposhnikoviae chromone content（mg/g ，n = 3）

所收集的42 份防風樣品中，齊齊哈爾泰來縣所產的4 年生防風色原酮總含量最高，為22.29 mg/g，佳木斯市望江郊區3 年生防風色原酮總含量最低，僅為4.10 mg/g。

3.1.2 防風色原酮含量分布情況 2020 年版《中國藥典》（一部）中規定升麻素苷和5-O- 甲基維斯阿米醇苷的總量不得少于0.24%，即2.4 mg/g。以2.4 mg/g 為一個單位，對42 批防風中升麻苷和5-O- 甲基維斯阿米醇苷的總量進行統計，結果有36 批藥材兩種成分總量超過0.48%，是《中國藥典》限度的2倍(占檢測份數的85.7%)；30 批藥材兩種成分總量超過0.72%，是《中國藥典》限度的3 倍(占檢測份數的71.4%)；有14 批藥材兩種成分總量超過0.96%，是《中國藥典》限度的4 倍(占檢測份數的33.3%)；最高含量是《中國藥典》限度的7.8 倍；另從升麻素苷、5-O- 甲基維斯阿米醇苷、升麻素和亥茅酚苷四種成分的總量分析，也具有相同的分布趨勢，見表5。

表5 42 批防風色原酮含量分布表Tab.5 Distribution of content of 42 batches of Radix Saposhnikoviae chromone

3.2 聚類分析結果

使用SPSS 26.0 軟件對42 批藥材測定結果通過歐式距離平方計算樣品間相似系數，用平均聯接（組間）聚類分析，結果見圖2。42 批樣品一共分為2 大類，其中，32、40 號樣品為一類，其余均屬于另一類。當閾值λ= 5 時，每一大類又分為兩小類，其中，12 ～14、19、23、27、29、3、37、42 號防風樣品為第二類群；32 號樣品為第三類群、40 號樣品為第四類群；其余的防風樣品均歸屬于第一類群。

圖2 42 批不同產地防風藥材中4 種色原酮成分含量聚類分析樹狀圖Fig.2 Cluster analysis dendrogram of the contents of four chromones in 42 batches of Radix Saposhnikoviae materials from different origins

3.3 土壤因素對防風中色原酮含量的影響

根據Pearson 相關性分析得出，土壤因素與升麻素苷、5-O- 甲基維斯阿米醇苷、色原酮總含量之間的相關系數分別為0.348（Sig = 0.000）、0.241（Sig =0.007）、0.302（Sig = 0.001），均呈現出0.01 水平的極顯著差異，這一結果表明升麻素苷成分及5-O- 甲基維斯阿米醇苷成分及色原酮總成分與土壤因素之間具有極顯著的正相關關系，但土壤因素對于升麻素及亥茅酚苷的影響并不顯著。土壤對于色原酮總含量影響均顯示沙土（平均含量為11.417 1±4.755 5 mg/g）優于火山灰土（平均含量為10.030 0±0.252 4 mg/g），顯著優于黑土（平均含量為8.638 7±3.123 5 mg/g）（P＜0.05）。不同土壤類型的物理結構影響著植物根系的生長發育，一般土壤砂性越強，越容易造成干旱的環境，而干旱通常是影響藥材質量的主要因素，這可能是沙質土壤含量高的本質原因[6]。

3.4 生長年限對防風中色原酮含量的影響

5-O- 甲基維斯阿米醇苷、升麻素、色原酮總含量與生長年限的相關性系數分別為0.347（Sig =0.000）、0.319（Sig = 0.001）、0.339（Sig = 0.001），結果表明不同生長年限下的防風其5-O- 甲基維斯阿米醇苷含量、升麻素含量以及色原酮總含量存在極顯著差異（P＜0.01），且與生長年限這一因素均存在正相關性；升麻素苷含量、亥茅酚苷含量與生長年限的相關性系數為0.213（Sig = 0.034）、0.226（Sig =0.024），兩者與生長年限因素均存在0.05 水平上的弱相關關系。上述結果表明，生長年限這一因素對于防風品質的影響還是較為重要的，根據不同年限下防風的色原酮總含量進行排序為4年生＞3年生＞2年生。

3.5 種質對防風中色原酮含量的影響

種質因素也是影響藥材質量的重要原因之一[7]。本試驗分析得出，5-O- 甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量與種質因素的相關性系數分別為為0.325（Sig = 0.000）和0.240（Sig = 0.007），說明種質因素對這兩種成分含量的影響極為顯著，而且均表現為關防風含量明顯高于水防風（P＜0.01），但種質因素對升麻素苷及升麻素成分含量的影響差異無統計學意義（P＞0.05）。種質因素與色原酮總含量之間的相關系數為0.224（Sig = 0.012），表明種質因素對色原酮總含量具有明顯影響（P＜0.05）。

3.6 生產方式對防風中色原酮含量的影響

3.6.1 栽培方法對防風色原酮含量的影響 升麻素苷含量與栽培方式的相關性系數為0.211（Sig =0.026）；5-O- 甲基維斯阿米醇苷含量與栽培方式的相關性系數為0.321（Sig = 0.001）；色原酮總含量與栽培方式的相關性系數為0.296（Sig = 0.002）。說明5-O- 甲基維斯阿米醇苷及色原酮總含量與栽培方式具有極顯著性弱相關（P＜0.01），升麻素苷、色原酮總含量與栽培方式具有顯著性弱相關（P＜0.05），均為直播方式下的成分含量較高。

有研究表明，移栽防風中色原酮含量為直播防風的2 倍[8]，本研究中的試驗結果與之前文獻中的結論不同，分析原因可能是本試驗中的防風為主根，而之前研究中的防風樣品包括了含量較高的側根。側根韌皮部比例較大，側根中的有效成分含量通常較高[9-10]，研究顯示移栽防風側根（升麻素苷0.806%，5-O- 甲基維斯阿米醇苷0.573%）的含量顯著高于全根（升麻素苷0.453%，5-O- 甲基維斯阿米醇苷0.452%）[11]，由此可以推斷防風側根的含量高于主根。在此次試驗中，有4 份樣本為河北防風，河北秧播防風中升麻素苷含量約為直播防風，而升麻素及亥茅酚苷的含量則是直播高于秧播，其中就升麻素含量而言直播防風約為秧播防風的2 倍。

3.6.2 野生與栽培防風色原酮含量的差異 前期研究表明，野生防風藥材較栽培品防風質量佳[12-13]，但本次研究中，有些野生防風中色原酮總含量并不高于栽培品，甚至低于4 年生的栽培防風。就升麻素苷而言，春季采收防風中的含量(7.16 ± 0.29 )mg/g高于夏季(3.33 ± 0.34 )mg/g (P＜0.01);春季采收防風色原酮含量（12.64 ± 0.45） mg/g 較夏季采收的防風色原酮含量(7.25 ± 0.87) mg/g 同樣有極顯著性差異(P＜0.01)。5-O- 甲基維斯阿米醇苷是防風藥材中含量較高的色原酮成分，目前仍作為防風質量的評價指標，但研究顯示該成分在腸道和血液中極不穩定，很快分解[14]，因此，5-O- 甲基維斯阿米醇苷并不適合作為防風藥材質量的指標。以往研究顯示，升麻素苷具有較強的藥理作用，野生防風化學成分特征是升麻素苷比例較高，升麻素苷與5-O- 甲基維斯阿米醇苷二者的比值為1.29 : 1，而栽培防風的比值為0.29 :1[12]。如果去除5-O- 甲基維斯阿米醇苷成分含量，春季采收防風色原酮含量（8.753 3 ± 0.442 6 mg/g）顯著高于夏季(3.898 3 ± 0.509 4) mg/g（P＜0.01），特別是活性更高的升麻素和亥茅酚苷尤為顯著。黑龍江省防風主產區春季氣候干旱，夏季多雨，而且傳統上野生防風的采收季節主要是春季，這可能是野生防風質量佳的主要因素。

4 討論

本研究的聚類分析結果表明，黑龍江省所產防風的質量與產地存在一定關系，產于黑龍江省西南部的防風藥材質量多優于黑龍江省東部及河北省所產的防風質量，大慶市與齊齊哈爾市產區在質量上更為接近，而佳木斯市、雙鴨山市種植出的防風質量更為接近，黑河市防風質量差異不大，但是大慶市區與大慶市林甸縣所產防風分屬不同類群，質量有一定差異，分析可能是由于大慶林甸縣產區具有道地產區優勢，其土質等外在環境適宜防風藥材生長。

防風作為我國藥材市場流通的大宗藥材，也是東北地區的重要代表藥材之一，其中，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷因其含量較高故作為2020 年版《中國藥典》規定的含量測定指標。有效成分的藥效是由化合物的主要活性基團決定的，升麻素為升麻素苷的苷元，較升麻素苷多一個-OH，而且升麻素缺少親水性葡萄糖基，更易透過細胞膜而被吸收入血，因此生物利用度也較高，其藥理作用約是升麻素苷的4 倍左右[15]。亥茅酚苷也比升麻素苷多1 個-OH，具有顯著的抗炎、鎮痛療效[16]，因此在試驗中同樣將這兩種色原酮成分作為探究對象。本研究結果表明，防風中的升麻素含量與采收季節以及生長年限具有一定關系，而亥茅酚苷的含量與種質、生長年限等因素相關聯。防風藥材品質形成過程中影響因素眾多[17]。為了獲得質量穩定、療效可靠的防風藥材，有必要綜合土壤、種質以及生產方式等多方面因素進行考量，從而保證用藥的安全與療效。

5 結論

本試驗對于42 批防風藥材進行含量測定，在先前的色譜條件基礎上作了進一步優化，該方法穩定性、重復性及重現性均良好，在此基礎上結合聚類分析及多成分同時測定，協同多指標定量評價，不僅為防風藥材兩種不同基原(關防風、水防風)的特異性、差異性研究提供了科學依據，同時也為防風的質量控制提供優化方案，從而為今后防風的生產實踐以及種質開發提供依據。