通竅活血湯治療血管性癡呆大鼠的機制研究

盧美住，盧昌均， 徐 榛，周 芝，頓玲露

（1.廣西中醫藥大學第三附屬醫院 神經內科，廣西 柳州 545001；2.廣西中醫藥大學 研究生院，廣西 南寧 530200）

血管性癡呆（VD)是一種常見的癡呆類型，主要繼發于缺血性或出血性卒中等腦血管病，是一組獲得性的慢性進行性疾病，臨床主要表現為學習記憶、認知功能障礙，因而又稱為“卒中癡呆”[1]。調查研究顯示，隨著老齡化增長和危險因素的流行，卒中發病率在逐年上升[2]。VD 常繼發于卒中等腦血管病，VD 的發生不僅會對患者神經功能的恢復有嚴重影響，還會增加致殘率和死亡率，目前尚無有效治療方法[3-5]。神經元凋亡是卒中后神經功能進行性惡化最關鍵的因素，而腦缺血缺氧、低灌注及再灌注損傷均可加劇神經元自噬與凋亡，從而導致卒中后認知功能障礙，甚至造成VD，故尋找具有抗神經元凋亡的藥物對治療具有重要意義。

通竅活血湯出自《醫林改錯》，其書中記載該方可“治頭面、四肢、周身血管血瘀之證”，說明其有著活血通絡、開竅醒神之功，而瘀血阻滯腦絡、腦竅失養是臨床上引起卒中和VD 最常見的原因，現代醫學研究也證明通竅活血湯具有保護血管內皮細胞、降低氧化損傷、減輕腦組織水腫、抑制細胞凋亡、改善腦循環及促進神經元修復的作用[6-8]。本研究通過建立VD 大鼠模型，從神經元保護角度探討通竅活血湯的作用機制，為臨床使用通竅活血湯治療VD 提供更多的實驗依據。

1 材料

1.1 動物

選 用60 只 健 康 雄 性SD 大 鼠， 體 質 量 為（220±20）g（長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXK 湘 2019-0013），并在實驗室適應性飼養2 周，實驗室喂養標準：環境安靜，空氣通暢，室溫（22±3）℃，相對濕度50% ～ 60%，自然光照，12/12h 晝夜循環，避免強光、噪音等刺激，普通飼料喂養，自由進食飲水。本研究方案已通過柳州市中醫醫院（柳州市壯醫醫院）倫理委員會批準（批號：2022-KY-XS-023-01）。

1.2 藥物與試劑

通竅活血湯配伍組成：赤芍3 g，川芎3 g，紅花9 g，桃仁（研泥）3 g，大棗（去核）10 g，老蔥（切碎）5 g，生姜（切片）9 g，人工麝香（絹布包）0.15 g，黃酒250 mL。制備方法：用黃酒250 mL 把赤芍、桃仁、川芎、紅花、老蔥、生姜、大棗等7味先煎至150 mL，去滓加入人工麝香，再煎煮使藥液濃縮至100 mL，最后濾過，將濾液配制成含生藥2 g/mL 溶液，最后將制好的溶液放置于4 ℃的冰箱備用。鹽酸多奈哌齊片(植恩生物技術股份有限公司，規格：5 mg/片，批號：02220390，批準文號：國藥準字H20010723)；Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司，批號：400209）；逆轉錄試劑盒（批號：05256502）定量聚合酶鏈式反應（RT- PCR）試劑盒（批號：05246001），購自于上海近岸科技有限公司；4%多聚甲醛通用型組織固定液（北京生命科學biosharp 公司，批號：22329929）；蘇木素染液、伊紅染液（北京索萊寶科技有限公司，批號均為20221214）。

1.3 主要儀器

CX41RF 型生物顯微鏡（日本OLYMPUS）；Morris 水迷宮（中國醫學科學院藥物研究所）；2-6型 Sigma 低溫離心機（德國Sigma 公司）；CF16RX Ⅱ型高速低溫離心機（日本Hitachi 公司）；Multiskan SkyHigh 型酶標儀（美國Thermo Scientific 公司）；HH-W21-600 型電熱恒溫水浴箱（上海醫療器械七廠）；YT-7FB 型生物組織攤烤片機、YB-6LF 型生物組織石蠟包埋機、ZT-12M 型生物組織自動脫水機（湖北省孝感市亞光電子技術有限公司）；Rm2235 型石蠟切片機（德國LAICA 公司）；7500 型實時熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher 公司）。

2 方法

2.1 動物模型制備

使用改良2-VO 法[8]制備VD 大鼠模型：將充分麻醉后的大鼠固定在操作板上，頸前部去毛，碘伏常規消毒，沿頸部正中垂直切口（長約1.5 ～2 cm)，采用血管鉗鈍性逐層分離直至完全暴露雙側頸總動脈(CCA)，改用鑷子將CCA 與迷走神經小心鈍性分離，待雙側血管充分暴露后用無創動脈夾同時夾閉雙側CCA 以阻斷大腦血流，10 min 后取下動脈夾恢復灌注，10 min 后再次進行夾閉，共反復夾閉-再通3 次后用5 - 0 號無菌手術線永久性結扎雙側頸總動脈，術畢縫合切口，慶大霉素噴灑消毒后將大鼠放回籠中，待醒后正常飼養。假手術組不進行造模操作，僅分離雙側頸總動脈，后續操作同造模組。造模后因各種不明原因死亡脫落8 只，術后出現明顯活動障礙（無法正常行走及游泳）脫落4 只，均予以剔除。

2.2 動物分組

造模手術后采用 Longa 5 級評分法[9]判斷神經行為學：無神經功能損傷為0 分；梗死對側前爪伸縮困難為1 分；行走時向功能障礙側轉圈為2 分；行走時向功能障礙側傾倒為3 分；意識障礙、完全不能行走為4 分。實驗選取分值為1 ～ 3 分的大鼠入組觀察。用Morris 水迷宮實驗確認造模效果[10]，即以對照組大鼠的逃避潛伏期作為參考值，實驗組大鼠造模后的逃避潛伏期與參考值之差與該鼠逃避潛伏期之比大于20%定為VD 大鼠。經排除造模后死亡與不符合標準的模型大鼠，最終選取48 只作為實驗大鼠，隨機分為四組：假手術組、模型組、西藥組和中藥組，每組12 只。根據動物與人體間的等效劑量換算[11]，算出鹽酸多奈哌齊和通竅活血湯的大鼠臨床等效劑量分別為0.5 mg/kg 和20.0 g/kg，假手術組和模型組則灌胃0.9%氯化鈉溶液，使用等體積灌胃法（即1 mL/100 g）于造模后第3 天進行灌胃，每日1 次，持續30 d。

2.3 觀察指標

2.3.1 定位航行與空間探索實驗 將Morris 水迷宮分4 個象限，平臺置于第3 象限，水位沒過平臺約2 cm，將大鼠頭對著水迷宮壁的不同方向放入，記錄大鼠逃避潛伏期時間，即入水到爬上平臺的時間。若大鼠在120 s 內未找到平臺，則引導大鼠爬上平臺并停留10 s，逃避潛伏期時間記為120 s。每只大鼠從4 個象限隨機入水，將大鼠入水后到發現平臺的時間和游泳軌跡作為觀察指標，每個象限各訓練1 次，連續訓練5 d，記錄大鼠每次到達平臺的時間，并計算平均值，作為大鼠定位航行實驗成績。第6 天撤去平臺進行空間探索實驗，記錄實驗大鼠120 s 內在目標象限停留時間和穿越原平臺的次數，以此作為評價大鼠空間記憶能力的標準。

2.3.2 心臟灌流固定 每個實驗組隨機抓取5 只大鼠進行心臟灌流，用于海馬組織病理觀察。腹腔注射足量麻藥將大鼠深度麻醉后，剪開胸廓，露出心臟，將灌注針的針頭從左心房向左斜上刺入升主動脈，固定針頭，剪開右心耳，迅速注射一定量0.9%氯化鈉溶液直至大鼠肝臟變白、從右心耳流出的液體為透明清亮無血色，隨后滴灌約250 mL 左右4%的多聚甲醛固定液，先快后慢，直到大鼠頸項強直、身體與四肢完全僵硬、眼球完全透明。灌注結束后立即將大鼠斷頭、冰上取腦，沿冠狀面切開腦組織（厚度約2 ～3 mm），放入固定液中并置于4℃冰箱保存24 h 后行石蠟包埋切片用于HE 染色。剩余每組7 只未灌流大鼠斷頭、冰上取海馬并將其置于- 80℃冰箱中保存。

2.3.3 蘇木素-伊紅染色 將固定后的大腦組織梯度乙醇脫水（70% 、80% 1h、90%1 h、95% 1 h、無水乙醇Ⅰ 1 h、無水乙醇Ⅱ 1 h）、二甲苯透明、石蠟包埋切片（切片厚度 3.5 μm），二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，伊紅染色，梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察海馬CA1 區的組織形態并任意選取2 ～ 3 個視野進行攝片記錄。

2.3.4 RT-PCR 檢測 取剩下未灌流大鼠海馬組織，采用Trizol 法進行總RNA 提取，Multiskan SkyHigh 儀器檢測RNA 的濃度和純度。按照逆轉錄試劑盒進行實驗，反應條件：50℃ 15 min，85℃ 5 s，終止反應，冰上冷卻，于-80℃保存備用。PCR 引物設計由上海生工設計完成，按照PCR 試劑盒進行操作，2×NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL，上游引物和下游引物各1μL，cDNA 模板1μL，ROX 0.4 μL，RNase Free Water 6.6 μL。反應程序為95℃預變性1 min，兩步法擴增，條件為95℃ 20 s，60℃1 min，共進行40 個循環，反應完成后作熔解度曲線分析以排除非特異性擴增，GAPDH作為內參基因，運用2-ΔΔCt法計算mRNA 相對表達量。PI3K、Akt、Bad及內參基因引物的設計序列見表1。

表1 各目標基因引物的設計序列Tab.1 Design sequences of primers of each target gene

2.4 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件對數據進行處理，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 定位航行結果

造模結束后，待大鼠切口完全愈合后進行水迷宮測試。經過5 d 的定位航行訓練，各組逃避潛伏期均縮短，與假手術組相比，模型組的逃避潛伏期明顯延長(P＜ 0.05)，表明造模成功；經通竅活血湯和鹽酸多奈哌齊灌胃干預治療后，VD 大鼠空間學習能力均得到明顯提高，其中，第1 天、第2 天、第5 天中藥組平均逃避潛伏期均比西藥組縮短(P＜ 0.05)，表明通竅活血湯治療效果更顯著，見表2。

表2 各組大鼠平均逃避潛伏期結果比較(s，x±s，n = 12）Tab.2 Comparison of average escape latency in each group(s，x±s，n = 12）

3.2 空間探索實驗

定位航行訓練結束后第2 天進行空間探索實驗。與模型組相比，西藥組和中藥組目標象限停留時間和穿越平臺次數均明顯增加(P＜0.05)，說明鹽酸多奈哌齊和通竅活血湯干預治療均可以改善VD大鼠的學習記憶能力，而中藥組在目標象限停留時間更長(P＜ 0.05)，說明通竅活血湯治療效果更佳，見表3。

表3 大鼠空間探索實驗結果比較(x±s，n = 12）Tab.3 Comparison of experimental results of space exploration in rats(x±s，n = 12）

3.3 HE 染色結果

光學顯微鏡下觀察各實驗組大鼠海馬組織CA1區神經細胞組織形態，假手術組神經細胞結構完整，形態規則，層次清晰，排列緊密整齊，無明顯的神經元丟失；中藥組和西藥組CA1 區神經細胞排列不十分完整，形態尚規則，排列較緊密，細胞間質可見水腫表現，神經元與周圍組織間隙較寬，表明有部分神經元丟失。而模型組海馬組織CA1 區神經細胞排列凌亂、疏松，組織形態十分不規則，細胞核體積變小、呈核固縮表現，神經元與周圍組織間隙明顯增寬，提示有大量神經元丟失，見圖1。

圖1 各組大鼠海馬CA1 區神經元形態結構（HE，×40）Fig.1 Morphological structure of neurons in hippocampal CA1 region of rats in each group（HE，×40）

3.4 RT-PCR 實驗結果

與假手術組比較，模型組PI3K、AktmRNA 表達明顯下降，BadmRNA 表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊治療組及通竅活血湯治療組PI3K、AktmRNA 的表達明顯升高，BadmRNA的表達明顯下降（P＜0.05），見表4。

表4 PI3K、Akt、Bad mRNA 相對表達量（x±s，n = 12）Tab.4 The expression levels of PI3K, Akt and Bad mRNA relative to GAPDH （x±s，n = 12）

4 討論

VD 常繼發于各種腦血管疾病，主要與腦組織缺血缺氧損傷相關，具體發病機制尚不明確。海馬區作為大腦組織中與學習、記憶關系最為密切的功能區，徑直參與信息的處理和儲存，其神經元數量及形態改變會影響機體學習記憶功能的正常獲取及儲存，而海馬結構和功能的完整性則與空間學習能力密切相關，神經元凋亡或丟失將會影響海馬接收其他聯絡區域信息，從而導致學習和記憶障礙[12-13]。

本研究通過夾閉雙側頸總動脈復制VD 模型，造模后大鼠海馬CA1 組織結構紊亂、排列稀疏，Bad基因表達明顯升高，PI3K/Akt基因表達明顯減少，表明缺血-再灌注損傷可能加速了促凋亡蛋白基因表達，抑制了抗凋亡蛋白基因的表達，造成海馬神經元凋亡或丟失，導致大鼠學習、記憶功能障礙。給藥干預治療后大鼠Bad基因表達明顯減少，PI3K/Akt基因表達明顯升高，其機制可能與鹽酸多奈哌齊和通竅活血湯激活了PI3K/Akt/Bad信號通路，促進了PI3K活化及Akt磷酸化，進而抑制凋亡信號蛋白的磷酸化或調節轉錄因子，加速促凋亡蛋白Badser136位點磷酸化，使之與Bcl-2 解離有關。通竅活血湯是臨床上治療VD 的常用方，方中麝香味辛、性溫，具有開竅通閉、解毒活血之效，現代研究發現麝香能降低大腦中動脈閉塞模型大鼠腦組織金屬蛋白酶的表達和降低大鼠血腦屏障的通透性，進而改善腦缺血損傷，發揮保護神經細胞的功效[14]；桃仁、紅花、赤芍活血化瘀；川芎性溫味辛，活血行氣、祛風止痛；老蔥通陽開竅、溫經散寒；生姜、大棗則補中養血，使氣血化生有源；加入黃酒同煎則活血、溫經通脈之力愈勝，全方具有抗血小板聚集、抗氧化應激、抗炎、促進神經元再生等多方面腦保護作用[15]。本研究中，通竅活血湯治療組較西藥組大鼠海馬區PI3K/Akt基因表達升高更明顯，Bad基因表達下降更顯著，海馬區組織形態結構更完整，大鼠學習記憶功能恢復更明顯，治療效果更佳，與本課題組前期臨床研究結果一致[16-20]。綜上說明，通竅活血湯可上調PI3K/Akt基因表達、下調Bad基因表達，通過調控PI3K/Akt/Bad信號通路，發揮抗細胞凋亡作用，改善VD 大鼠的認知功能。

5 結論

通竅活血湯可改善VD 大鼠學習、記憶功能，降低海馬組織細胞結構病理損害，修復受損神經元細胞，這可能與PI3K活化，促進Akt磷酸化，激活PI3K/Akt/Bad信號通路，使抗凋亡因子升高，減少促凋亡因子的表達有關。本實驗采用改良2-VO 法復制VD 模型，相較于傳統2-VO 法，避免了因突然夾閉造成大腦急性缺血-低灌注損傷引起腦組織水腫造成大鼠死亡，同時彌補了單純夾閉-再通可能使大鼠腦組織缺血壞死面積不夠大而影響造模成功率的不足，但本研究中未能對相關蛋白的表達含量與神經凋亡細胞進行檢測，實驗結果具有一定的局限性，未來可進一步檢測通路相關蛋白的表達，計算海馬神經細胞凋亡率，為臨床用藥提供更可靠依據。