微波消解—ICP-MS 法測定替考拉寧原料藥中的元素雜質

覃玉梅，段光玉，吳素芬，邵伍軍，楊荷友，袁紅露，楊凱麗

（浙江海正藥業股份有限公司，浙江 臺州 318000）

替考拉寧（teicoplanin）是一種新型糖肽類抗菌藥物，主要對革蘭陽性需氧或厭氧球菌有較強的抗菌活性且耐藥菌株少[1-2]，可用于治療不能使用頭孢菌素和青霉素類抗生素的患者，治療各種嚴重耐藥革蘭氏陽性菌所致的感染[3-4]?，F行版美國藥典未收載替考拉寧原料藥及制劑；歐洲藥典[5]收載替考拉寧原料藥，但無重金屬檢查項；中國藥典[6]和日本藥局方[7]收載替考拉寧原料藥，且均有重金屬檢查項，中國藥典要求重金屬不超過20 μg/g，日本藥局方要求重金屬不超過5 μg/g。對于定性和定量分析，重金屬檢查法靈敏度差且專屬性不足。ICP-MS 法分析速度快，專屬性強，靈敏度和準確度高[8-10]。本試驗采用微波消解—ICP-MS 法檢測替考拉寧中10 種元素雜質，可為替考拉寧的質量控制提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

美國PE NexION2000 電感耦合等離子體質譜儀；奧地利Anton Paar Multiwave PRO超高壓微波消解儀；瑞士梅特勒XPE205 電子天平；德國Merck Millipore超純水儀。UP 級硝酸（純度68%～ 70%，蘇州晶瑞）；單元素標準溶液Li、V、Co、Ni、Cu、Cd、Hg、As、Sb、Pb、Y、Ge、In、Bi、Au（1 000 μg/mL，CRM，美國SPEX）；調諧液為Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U 混合標準溶液（1 μg/L，美國PE）；替考拉寧（海正藥業）。

1.2 儀器條件

載氣（高純氬氣）、輔助氣、離子體的流量分別為1.04 L/min、1.20 L/min、15.00 L/min，射頻功率1 600 W。檢測模式定量分析，檢測器模式雙檢測器，數據采集方式跳峰，校正模式線性過零點。Rpa（抗干擾參數a）均為0（65Cu 為0.011），Rpq（抗干擾參數q）均為0.25，池氣體流量均為3.00 mL/ min。樣品重復測定次數3，掃描次數20，KED 模式。7Li、51V、59Co 以89Y 為內標，60Ni、65Cu、75As 以74Ge為內標，111Cd、121Sb 以115In 為內標，202Hg、208Pb以209Bi 為內標。微波消解：由室溫升至120 ℃用時10 min（維持10 min）；10 min 內升至160 ℃（維持10 min），10 min 內升至180 ℃（維持10 min）；功率1 500 W，Internel Temperature Limit 設置185 ℃，Temperature Control Mode 選擇Average。

1.3 標準及供試品溶液配制

標準溶液：移取各單元素標準溶液Li、V、Co、Ni、Cu、Cd、Hg、As、Sb、Pb 適量，用5%硝酸稀釋得Li、V、Co、Ni、Cu、Cd、Hg、As、Sb、Pb 濃度 為50、2、1、4、60、0.4、0.6、3、18、1 μg/ mL的混合儲備液。將Au 單元素標準溶液用5%硝酸稀釋得100 μg/mL Au 標準溶液。移取混合儲備液0.06、0.1、0.2、0.3、0.4 mL 至5 個50 mL 量瓶中，各加入100 μg/mL Au 標準溶液0.1 mL，用5%硝酸稀釋至刻度，制得線性標準溶液1～ 5。用5%硝酸制得Au 200 μg/L 的線性空白。用5%硝酸稀釋制得含10、20、5、10 μg/L 的Y、Ge、In、Bi 混合內標溶液。

供試品溶液：稱取替考拉寧0.2 g，置消解罐中，加入100 μg/mL Au 標準溶液0.05 mL 和硝酸5 mL，置趕酸儀中60 ℃預消解1 h，再進行微波消解，冷卻后置趕酸儀中60 ℃趕酸1 h，冷卻后用水多次洗滌并轉移稀釋至25 mL。同法制樣品空白。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理

替考拉寧易溶于稀酸和水，幾乎不溶于乙醇（96%）。采用稀硝酸直接溶解，無法完全消解樣品，基質干擾嚴重，故用微波消解。根據微波消解儀的稱樣量要求，一般取0.2 g 樣品（消解后定容至25 mL），分別考察不同的微波消解程序，包括升溫步驟、溫度控制模式（Temperature Control Mode）的選擇、預消解，各配制30%限度濃度加標溶液（平行配制3 份）檢測計算加標回收率。由于汞具揮發性，微波消解樣品產生的揮發性產物較多，反應較劇烈會引起爆罐，結果導致汞元素流失，因此增加預消解（60 ℃常壓預消解1 h）并分步程序升溫。同時，微波消解溫度太高，壓力過大易引起爆罐，在確保樣品消解完全的前提下，選擇溫度控制模式為Average，最高消解溫度180 ℃，內置溫控（Internel Temperature Limit）185 ℃（超過此溫度消解罐易變形，消解液沖出損失）。實驗結果顯示，各元素加標回收率結果均符合要求，優化出了最佳的樣品前處理方法。

2.2 質譜干擾的消除

樣品的基體效應、多原子離子及同質異位素等影響ICP-MS 準確性，樣品基體的干擾會造成儀器信號漂移。為減少樣品基體的干擾，采用同步進樣內標，即稀釋了待測溶液，內標與待測元素響應值比值可對系數進行校正，減少信號漂移。內標盡量選用質量數相近且電離能相近的元素，同時考慮樣品基質的干擾，根據加標回收率及標準溶液回測情況篩選內標元素，內標篩選結果見“1.2”。

2.3 儀器條件優化

針對受干擾最大的Cu 和As，內標相同時發現STD 模式比KED 模式偏差大，其他待測元素受干擾較小，故采用KED 模式，用質譜調諧液（Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U 均1 μg/L）優化，要 求信號 值Be ＞2 000 cps，（CeO/Ce）≤0.025，（Ce++/Ce）≤0.03，In ＞40 000 cps，Bkgd ≤3 cps，U ＞30 000 cps，得到最佳儀器條件見“1.2”。

2.4 汞殘留

汞溶液具揮發性，易吸附具記憶效應，待測溶液中加入金，形成金汞齊，降低汞的殘留。

2.5 線性關系、檢測限與定量限

采用在線加入內標，對線性空白、線性標準溶液進行分析，響應值取重復讀數3 次的平均值，繪制標準曲線?？v坐標為待測元素響應值與內標元素響應值的比值，橫坐標為濃度。同法制樣品空白連續測定11 次計算其標準偏差（SD），LOD=3SD/斜率/樣品濃度，LOQ=10SD/斜率/樣品濃度，由表1 可知線性關系良好，方法靈敏度高。

表1 線性關系、檢測限和定量限Tab.1 Linear relationship，limit of detection（LOD）and limit of quantification（LOQ）

2.6 準確度和精密度

以30%、100%、150%限度配制準確度加標溶液9 份（n=3），以100%限度配制精密度加標溶液6 份（n=6）。準確度加標回收率平均值為88.3%～ 103.7%（n=3），RSD 為0.28%～ 13.1%（n=3）；精密度加標回收率平均值為89.1%～ 103.8%（n=6），RSD 為1.1%～ 5.1%（n=6）。表明準確度和精密度良好。

2.7 專屬性

檢測信號的專屬性由ICP-MS 檢測出的元素質量數判斷；由空白溶液信號值判斷無干擾；由樣品溶液、加標樣品溶液回收率測試及標準溶液回測，判斷樣品基質無干擾。

2.8 樣品檢測

按“1.3”制備6 批替考拉寧樣品溶液，結果待測元素含量均小于元素雜質控制閾值。

3 結論

作為一種新型糖肽類抗菌藥物，與萬古霉素相比，替考拉寧脂溶性更強，半衰期更長，體液分布性良好，不良反應輕，給藥方式為靜脈或肌肉注射[3]。在合成替考拉寧時，元素雜質會由設備、制藥用水及生產原材料等帶入。在元素雜質指導原則[ICH Q3D（R2）][11]中，元素雜質包括1 類元素砷、鎘、汞、鉛（藥品生產中禁止使用），2A 類元素鈷、鎳、釩（需對其潛在來源及攝入途徑進行風險評估），2B 類元素（僅有意添加時才需評價其潛在來源）和3 類元素[依給藥途徑進行風險評估，若注射劑的每日允許暴露量（Permitted Daily Exposure，簡稱PDE）低于500 μg/ day，則須進行安全性評價]，注射劑PDE 低于500 μg/day 的元素有鋰、銅、銻。10種元素的注射劑PDE 為鋰250 μg/ day、釩10 μg/ day、鈷5 μg/ day、鎳20 μg/day、銅300 μg/ day、鎘2 μg/ day、汞3 μg/day、砷15 μg/day、銻90 μg/ day、鉛5 μg/ day。根據Q3D（R2）選項1（Option 1）方法，元素限度（μg/g）=PDE（μg/day）/ 每日攝入藥品量（g/ day），每日攝入注射劑10 g 的元素限度 鋰≤25 μg/g、釩≤1 μg/g、鈷≤0.5 μg/g、鎳≤2 μg/ g、銅≤30 μg/g、鎘≤0.2 μg/g、汞≤0.3 μg/g、砷≤1.5 μg/g、銻≤9 μg/g、鉛≤0.5 μg/g。元素控制閾值=30%元素限度，替考拉寧注射劑中元素控制閾值為鋰≤7.5 μg/g，釩≤0.3 μg/g，鈷≤0.15 μg/ g，鎳≤0.6 μg/g，銅≤9 μg/g，鎘≤0.06 μg/g，汞≤0.09 μg/g，砷≤0.45 μg/g，銻≤2.7 μg/g，鉛≤0.15 μg/g。依美國藥典[12]，ICP-MS 法需進行線性、范圍、專屬性、準確度、精密度及定量限驗證并滿足相應接受標準；若藥品中總元素水平始終低于元素控制閾值，元素雜質可免檢，但元素雜質評估測試要求不少于6 批連續的中試批次或不少于3 批連續的商業化批次。故本實驗建立了微波消解-ICP-MS 法檢測替考拉寧中10 種元素含量，并連續測試了6 批商業化批次樣品，該方法簡單，空白干擾小，靈敏度高，準確度和精密度良好，可用于替考拉寧原料藥中元素雜質的檢測。