三種微藻對不同氮源去除率及CO2 固定效率的研究

龍成鳳，張達娟，王澤斌，張樹林，畢相東，戴偉

（天津農學院 水產學院 天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300392）

隨著我國工業及城鎮化進程加快，工業廢水、生活污水、溫室氣體排放量增加，水體富營養和大氣污染等已對生態環境造成嚴重影響，甚至威脅人類生存和發展[1-3]，因此推廣綠色高效的環境修復技術是亟待完成的任務之一。為解決這一問題，20 世紀中葉OSWALD 和GOTAAS 提出用微藻治理污水[4-5]。微藻屬于自養型微生物，能將光能轉化為化學能，在生長過程中可吸收降解污水中的氮、磷等污染物，從而起到凈化水質的作用[6-9]。李超等[10]用四尾柵藻（Scenedesmus quadricauda）和蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）去除模擬生活污水中的總氮，去除率分別達到78.33%、76.67%。李興涵等[11]用小球藻（Chlorellasp.）對天然橡膠加工廢水進行處理，結果表明，小球藻對廢水中總氮、總磷均具有較好去除效果，去除率分別為89.21 %和70.00 %。

此外，我國在2020 年提出在2030 年前完成碳達峰，爭取2060 年前完成碳中和的“雙碳”目標。CO2作為主要的溫室氣體之一，降低其在大氣中的含量，對實現“雙碳”目標具有重要意義。微藻廣泛存在于水體中，可以直接利用光能且繁殖速度快，固定CO2效率是陸生高等植物的10～50 倍[12]。20 世紀末，WERNER 等[13]提出藻類的分子式為C106H263O110N6P，并給出其光合作用反應式：106CO2+16NO3-+HPO42-+122H2O+18H+→C106H263O110N6P+138O2，可以看出微藻能直接利用CO2，大大減少了固碳的時間。另外，由于水體中CO2與空氣CO2濃度含量差距較大，且CO2在水體中擴散的速度僅為大氣中的萬分之一，微藻為了適應水體較低濃度的CO2，建立了一套可以濃縮CO2的機制，以提高細胞內CO2濃度從而保證高效的光合作用，因此，微藻在CO2的減排應用上備受關注。

有些學者將固定CO2和污水處理結合起來，篩選出一些既能固定CO2又能清潔污水的微藻。如：趙云等[14]在光照強度240 μmol/（m·s）、初始氮濃度128 mg/L、通氣比0.3 m3/（m3·min）、通氣通斷間隔15 s/60 s 條件下培養小球藻，研究其對CO2固定和脫氮除磷效果，結果表明在培養期間，小球藻最高固碳速率達到564.67 mg/（L·d），氮、磷去除率分別為66.72%、55.95%。楊梟等[15]在微重力條件下研究小球藻在四種廢水中以及通入高濃度二氧化碳時的生長狀況，試驗結果表明，小球藻在四種廢水中均能生長，且能有效吸收氮磷等污染物，通入高濃度CO2時，小球藻的固碳效率有顯著提升。耦合CO2減排和污水生態處理微藻資源化培養是現今環境領域關注的主題，但現在大多學者主要關注的是CO2耐受藻的選擇及微藻對工業CO2的吸收效果研究，忽略了微藻在自然條件下對CO2的吸收。因此本次試驗選取斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、 綠球藻（Chlorococcumsp.）和普通小球藻為試驗對象，研究三種微藻在相同條件下對尿素氮、硝態氮、銨態氮的去除率及對CO2固定的效率。

1 材料與方法

1.1 材料

斜生柵藻、綠球藻和普通小球藻由天津農學院天津市水產生態及養殖重點實驗室提供，均培養于BG-11 培養基中，培養條件如下：溫度25 ℃，光照強度4 000 lx，光暗比12 h∶12 h。

1.2 試驗設計

將對數生長期的斜生柵藻、綠球藻和普通小球藻分別接種至無碳源且以尿素氮（CH4N2O）、硝態氮（NaNO3）和銨態氮（NH4Cl4）為混合氮源的BG-11 培養基中，各氮素質量比為1∶1∶1，氮的質量濃度為247 mg/L，藻細胞初始密度均為1×106cells/mL，培養體積為1.5 L，每組設3 個平行，培養周期為6 d，期間持續通入空氣（流速為300 mL/min）以提供碳源，培養條件與藻種培養時一致，每天震蕩3 次。取樣測定培養液中尿素氮、硝態氮和銨態氮的含量及微藻的細胞密度和干重。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養液中各成分氮的測定方法

采用鋅鎘還原法測定硝態氮[16]（GB17378.4-2007），采用納氏試劑法測定銨態氮[17]（GB17378.4-2007），尿素氮采用國際標準二乙酰一肟分光光度法[18]（GB/T 18204.29-2000）。

1.3.2 微藻細胞密度—吸光度曲線建立

以微藻細胞密度為橫坐標，不同密度微藻在750 nm 處的吸光值為縱坐標，分別作出三種微藻與吸光值之間的相關性標準曲線，從而通過測定吸光值確定微藻細胞密度。經測定斜生柵藻、綠球藻和普通小球藻細胞密度與吸光度之間的關系分別為：y＝0.000 6x+0.417 4，R2＝0.997 6；y＝0.001 1x+0.252 1，R2＝0.990 5 和y＝0.000 6x+0.191 4，R2＝0.990 8。

1.3.3 微藻干重-吸光度曲線建立

微藻細胞干重測定是將孔徑為0.45 μm 的玻璃纖維濾膜編號后放置于105 ℃烘箱內烘干過夜至恒重后稱重，并記錄為W1。取不同濃度的柵藻、綠球藻和小球藻藻液各20 mL，通過0.45 μm 玻璃纖維濾膜抽濾，將帶有藻體的濾膜分別放于105 ℃烘箱內烘干至恒重，稱取其質量W2，各種藻類的兩次質量之差即為微藻干重。將不同濃度的三種微藻利用分光光度計于750 nm處分別測定吸光值，并各記錄為A。從而建立微藻干重與吸光度之間的曲線。經測定斜生柵藻、綠球藻和普通小球藻三者細胞干重與吸光度之間的關系分別為：y＝1.615 1x+0.396 4，R2＝0.999 8；y＝1.812 7x+0.157 5，R2＝0.998 7 和y＝1.694 7x+0.211 6，R2＝0.993 4。

1.4 微藻比生長率、生物量生產率及CO2 固定速率計算

1.4.1 微藻的比生長率及生物量生產率

微藻的比生長率及生物量生產率計算參考文獻[19]，公式如下：

式中：t為培養時間，d；Nt2、Nt1為第t2天和第t1天微藻細胞密度，cells/mL；μ為微藻比生長率，d-1。

式中xP表示微藻生物量產率[g/（L·d）]；Xt表示時間t（d）藻細胞干重（g/L）；X0表示時間t0（d）初始接種液藻細胞干重（g/L）。

1.4.2 微藻CO2的固定速率

微藻CO2的固定速率計算方法參考文獻[20]，公式如下：

式中：為CO2固定速率[/（L·d）]；Px為微藻最大生物量產率[g/（L·d）]；Cc 為微藻干細胞含碳率，研究分析表明，微藻細胞干重含碳率為50%；為CO2的分子質量，44；MC為C 原子質量，12。

1.4.3 數據處理與分析

試驗數據均用“平均值±標準差”表示，采用Origin 2018、Excel 2019 進行繪圖，使用SPSS 單因素方差分析和LSD 多重比較進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 三種微藻生長曲線

如圖1 所示，在相同條件下三種微藻生長曲線呈現指數增長，符合微藻生長規律。從第三天開始，三種微藻生長差異顯著（P＜0.05），普通小球藻的細胞密度顯著高于斜生柵藻和綠球藻（P＜0.05）。第六天時斜生柵藻、綠球藻和普通小球藻細胞密度分別為687.67×104、616.87×104和1161.52×104cells/mL。

圖1 三種藻類的生長曲線

2.2 三種微藻比生長率變化及CO2 的固碳速率

微藻比生長率見表1，培養期間三種微藻的比生長率均呈先上升后下降趨勢，以第三天時最高；三種藻類間以普通小球藻最高，第三天時為0.87 d-1，顯著高于斜生柵藻和綠球藻（P＜0.05）。第六天時，斜生柵藻、綠球藻和普通小球藻的比生長率分別為0.18、0.19、0.15 d-1，三者間無顯著差異（P＞0.05）。試驗期間，在通入300 mL/min 自然空氣情況下，普通小球藻對CO2的固定速率呈先上升后下降的趨勢（圖2），第三天達到最大值，為0.217 g/（L·d），顯著高于綠球藻和斜生柵藻（P＜0.05）；斜生柵藻和綠球藻在第六天達到最大值，分別為0.125 和0.142 g/（L·d），普通小球藻為0.119 g/（L·d），此時三者間無明顯差異。

表1 微藻比生長率 d-1

圖2 三種微藻CO2 固碳速率

2.3 三種微藻對不同氮源的去除率

斜生柵藻對三種氮源的去除率如圖3 所示，自第一天開始，斜生柵藻對尿素氮、硝態氮、銨態氮的去除率存在顯著差異（P＜0.05），至第六天時，培養液中三種氮源濃度分別為6.73、73.44、81.54 mg/L，去除率分別為92.86%、79.28%、22.86%，斜生柵藻對尿素氮的去除率顯著高于對硝態氮和銨態氮的去除率（P＜0.05）。綠球藻對三種氮源的去除率在第二天開始存在顯著差異（P＜0.05），第六天時，培養液中尿素氮、硝態氮和銨態氮的濃度分別為20.78、70.56 和64.00 mg/L，綠球藻對硝態氮的去除率為80.10%，顯著高于對尿素氮（77.98%）和銨態氮（39.45%）的去除率?？梢娋G球藻對硝態氮的去除效果優于尿素氮和銨態氮。普通小球藻對三種氮源的去除率從第三天開始存在顯著性差異（P＜0.05），第六天時，培養液中尿素氮、硝態氮、銨態氮濃度分別為35.89、67.20、69.07 mg/L，對三種氮源的去除率分別為61.96%、81.04%、34.66%，三者間存在顯著差異（P＜0.05），說明普通小球藻對硝態氮的去除效果最好。

圖3 三種微藻對不同氮源的去除率

3 討論

3.1 三種微藻的生長及固碳速率

微藻由于自身的結構特性，能夠進行光合作用，合成有機物，滿足自身生長需求并儲存多余能量。通過食物鏈，將固定的碳傳遞至魚類、鳥類或哺乳類等高等生物，這些生物的排泄物又可被低等生物利用。經食物鏈的傳遞，一部分碳被固定進入底泥，另外一部分被移出水體。相對于森林儲存的碳幾百年內大部分會重返大氣，儲存在水體中的碳則幾乎很少返回大氣[21]。據測算小球藻、柵藻和水華魚腥藻含碳量分別達46.38%、51.28%和68.76%。因此藻類被公認為提高碳匯的重要載體。了解微藻的自然生長及固碳速率可以為碳匯測算提供理論基礎。

本研究中三種藻類在培養期間細胞密度隨時間的增加而增加，說明在該條件下三種微藻均能正常生長。三種微藻比生長率逐漸上升在第三天達到最大值，隨后降低，其中普通小球藻的平均比生長率高于綠球藻和斜生柵藻，說明普通小球藻在培養期間物質積累最多，且藻種不同物質積累的速率也有差異。

CO2作為光合作用的必要條件之一，其固定速率反應了微藻對CO2的吸收轉化能力，對我們篩選和評價微藻固定CO2能力有重要意義。不同微藻固碳能力不同[22]，因此了解微藻的固碳差異對后續研究具有現實意義。劉明升等[23]對水華魚腥藻（Anabaena flos-aquae）、小顫藻（Oscillatoriatenuis）、阿氏顫藻（Oscillatoria agardhii）、水網藻（Hydrodictyon reticulatum）、斜生柵藻和鞘藻（Oedogonium sp.）六種淡水微藻在相同條件下進行培養，發現六種微藻的固碳速率有顯著差異；衛晴等[24]以藻液初始濃度A680＝0.3±0.1 接種，無碳的BG-II 培養基為基礎通入0.04%、5.00%和20.00%的CO2（v/v），氣體流量為200 mL/min 的條件下，研究兩株綠藻對CO2濃度響應，結果表明在0.04%條件下小球藻FACHB-1580 和柵藻FACHB-1618 CO2平均固定效率分別為0.352 和0.425 g/（L·d），5.00%和20.00% CO2條件下平均固碳速率均高于0.04%。本文中普通小球藻、綠球藻和斜生柵藻平均固碳速率分別為0.115、0.096和0.067 g/（L·d），說明在整個培養期間，普通小球藻吸收的CO2比綠球藻和斜生柵藻多，具有較好效果。其中普通小球藻與斜生柵藻平均固碳速率低于衛晴的試驗結果，這可能與微藻初始濃度及氮源不同有關。普通小球藻固碳速率在第三天出現拐點，這是由于細胞密度較大，藻液對光的掩蔽效應增強，光合作用變弱。

3.2 微藻對不同氮源的吸收和利用

微藻能直接利用水體中的銨態氮，通過轉氨基，迅速合成自身所需氨基酸；而硝態氮和尿素氮需要經過硝酸酶和尿素酶通過還原和脫羧產生銨態氮，最終被微藻吸收[25]。當硝態氮、尿素氮作為唯一氮源時，藻類生長需要面臨更多的還原壓力，因此硝態氮、尿素氮被認為不是一種經濟的生存策略。但不同微藻對不同形態的氮源利用存在差異，且對濃度要求也不一樣，如：低濃度銨態氮促進銅綠微囊藻生長，高濃度會對其產生生長脅迫[26]。

研究發現，硝酸氮是小球藻最適氮源，而王順昌等[27]發現尿素對蛋白小球藻生長、色素積累優于硝態氮和銨態氮；胡章喜等[28]研究不同氮源對布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）生長、總脂和總烴含量的影響中發現硝態氮是布朗葡萄藻764 和布朗葡萄藻765 較好的氮源；胡章喜等[28]指出相同條件下，亞心形扁藻（Platymonassubcordiformis）對尿素氮的去除利用優于硝態氮和銨態氮，可見微藻種類、培養條件均會影響其對氮源的吸收。本試驗中，三種微藻均能利用尿素氮、硝態氮、銨態氮，且尿素氮和硝態氮的去除率均顯著高于銨態氮，說明三種微藻對不同氮源去除存在差異。斜生柵藻對三種不同氮源去除率為：尿素氮＞硝態氮＞銨態氮，綠球藻為：硝態氮＞尿素氮＞銨態氮，普通小球藻為：硝態氮＞尿素氮＞銨態氮，三種微藻對不同氮源的去除率均不同，與微藻優先利用銨態氮的說法有所差異。我們認為是同一微藻在單一氮源和混合氮源中對氮源的吸收有所差異造成的。馬紅芳等[29]的研究結果表明，斜生柵藻偏好銨態氮，但楊坤等[30]在柵藻和小球藻對養殖廢水的試驗中，發現在混合氮源中，硝態氮的濃度大于銨態氮時，硝態氮的存在會抑制微藻對銨態氮的吸收。本文三種微藻銨態氮去除率最低，與上述結論相符。除此之外，對比三種微藻發現，不同微藻在相同混合氮培養下，單一氮源對其他形式氮源的影響也具有差異。斜生柵藻尿素氮抑制硝態氮和銨態氮的吸收，綠球藻及普通小球藻硝態氮抑制尿素氮和銨態氮的吸收。因此，選擇微藻處理污水時，既要考慮微藻的特性也要考慮其他氮源的影響。