藻-菌混合培養及添加NaHCO3促進柵藻生長和脂類合成

王雪晴，邢向英，董慶霖，燕 然，李文娜

(1.河北工業大學 化工學院，天津 300130； 2.河北工業大學 代謝工程實驗室，天津 300130)

微藻生長速率快[1]，易于培養，脂類含量高[2]，是生產生物柴油的主要原料[3-5]。然而，與化石燃料相比，生物柴油的生產成本仍然較高，無法實現可持續的商業化生產[6-8]。因此，如何提高微藻產量和脂類含量是生物柴油原料生產的關鍵問題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藻種及培養基

柵藻(Scenedesmusobliquus)培養液(含雜菌)購自中科院武漢水生生物研究所。

1.5N-BBM培養基：NaNO3375 mg/L，KH2PO4175 mg/L，MgSO4·7H2O 75 mg/L，K2HPO475 mg/L，EDTANa250 mg/L，KOH 31 mg/L，NaCl 25 mg/L，CaCl2·2H2O 25 mg/L，H3BO311.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.82 mg/L，MnCl2·4H2O 1.44 mg/L，Na2MoO41.79 mg/L，CuSO4·5H2O 1.57 mg/L，Co(NO3)2·6H2O 0.49 mg/L，FeSO4·7H2O 4.98 mg/L，H2SO41 mL/L。

LB培養基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂18 g/L。

PDA培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂18 g/L。

1.1.2 儀器與設備

GXZ-300D光照培養箱，HZQ-QG全溫振蕩器，723N可見分光光度計，LRH-150S恒溫恒濕培養箱，XSZ-H光學顯微鏡，LG16-B臺式高速離心機，JY96-II超聲波細胞粉碎機，YX280加壓滅菌鍋，DH-101-0S電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 無菌柵藻的制備

在100 mL柵藻培養液中加入15 μL硫酸卡霉素(90 μg/mL)與80 μL硫酸慶大霉素(90 μg/mL)，置于光照培養箱內培養3 d(溫度25℃，光照強度60 μmol/(m2·s))。離心收集藻細胞(8 500 r/min，10 min)，將藻細胞用無菌水稀釋至10-4，涂布在添加2%葡萄糖的BBM固體培養基(NaNO3質量濃度250 mg/L)，置于光照培養箱培養5 d(溫度25℃，光照強度60 μmol/(m2·s))。將生長出的單藻落轉接至BBM液體培養基內培養制備成種子培養液。

1.2.2 柵藻共生微生物的分離與種類確定

柵藻的共生微生物通過稀釋涂布法分離。取0.5 mL柵藻培養液稀釋至10-3、10-4、10-5，分別涂布在添加2%葡萄糖的BBM固體培養基，置于光照培養箱培養5 d(溫度25℃，光照強度60 μmol/(m2·s))，根據菌落不同的形態特征挑選單菌落，分別轉接至LB或PDA培養基內培養。將分離得到的微生物進行顯微鏡觀察與革蘭氏染色，確定微生物種類。

1.2.3 促進柵藻生長微生物的篩選

在裝有100 mL 1.5N-BBM培養基的錐形瓶中分別接入10 mL無菌柵藻(1.15×107個/mL)和1接種環1.2.2分離的菌體，置于光照培養箱內培養10 d(溫度25℃，光照強度60 μmol/(m2·s))，測定生物量和脂類含量。

1.2.4 藻-菌混合培養(M)

細菌接種液的制備：將篩選的細菌接種至LB培養基內，置于恒溫搖床培養3 d(溫度25℃，搖床速度120 r/min)，細菌發酵液細胞濃度約為2×108個/mL。取4 mL細菌發酵液于8 500 r/min離心10 min，收集細胞，用無菌水洗滌2次，稀釋，制備細菌接種液(1×108個/mL)。

混合培養：在100 mL 1.5N-BBM培養基內加入10 mL無菌柵藻(2.5×107個/mL)及不同體積細菌接種液，使接種比例(藻菌細胞濃度比)達到1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，置于光照培養箱內培養10 d(溫度25℃，光照強度60 μmol/(m2·s))，測定生物量和脂類含量。

1.2.5 添加NaHCO3培養柵藻(C)

在100 mL 1.5N-BBM培養基中加入10 mL無菌柵藻(2.5×107個/mL)與不同體積NaHCO3溶液(10 g/L，無菌過濾)，使培養液中NaHCO3質量濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L，置于光照培養箱內培養10 d(溫度25℃，光照強度60 μmol/(m2·s))，測定生物量和脂類含量。

1.2.6 添加NaHCO3的藻-菌混合培養(MC)

按1.2.4、1.2.5確定的藻菌最佳接種比例和NaHCO3質量濃度進行添加NaHCO3的藻-菌混合培養(MC)，以柵藻單獨培養(CK)、藻-菌混合培養(M)、添加NaHCO3培養(C)3種培養方式為對照，置于光照培養箱內培養16 d(溫度25℃，光照強度60 μmol/(m2·s))，測定不同培養方式下的生物量和脂類含量。

1.2.7 反應參數測定

1.2.7.1 生物量及細胞生長動力學參數

柵藻生物量(細胞干重，DCW)參照Dong等[13]的方法測定。

細胞生長動力學參數參照文獻[26-27]按下式計算。

(1)

(2)

式中：Xn與X0分別為時間tn與t0時的生物量。

1.2.7.2 培養液中硝態氮濃度

硝態氮濃度按Hecht等[28]的方法分析測定。

1.2.7.3 培養液pH

取5 mL柵藻培養液，離心，取上清液用pH計測定。

1.2.7.4 脂類含量、合成動力學參數及脂肪酸組成

脂類含量的測定參照文獻[26]方法按下式計算。

(3)

式中：GL為總脂量；V為藻液體積，X為細胞濃度(生物量)。

脂類合成動力學參數參照文獻[26-27]按下式計算。

(4)

(5)

式中：X0、Xn與G0、Gn分別為t0與tn時的生物量與脂類含量；r為脂類合成速率。

脂類脂肪酸組成參照文獻[26]方法進行分析。

2 結果與討論

2.1 無菌柵藻

按照1.2.1方法制備無菌柵藻，發現經抗生素處理后稀釋的柵藻在平板上形成了無菌的單藻落(見圖1)。用接種環將單藻轉接至BBM液體培養基中培養得無菌柵藻種子培養液用于后續實驗。

圖1 柵藻在平板上形成的藻落

2.2 柵藻的共生微生物

按照1.2.2分離柵藻的共生微生物，得到4種微生物，其在平板上形成的菌落見圖2。

注：A.黃色菌(B1)；B.紅色菌(B2)；C.白色菌(B3)；D.白色菌(F1)。

由圖2可看出，分離得到的4種微生物中A、B和C平板菌落為球形，表面及邊緣光滑，呈現黃色、紅色和白色。顯微鏡觀察和革蘭氏染色結果表明：B1、B2和B3細胞呈球狀，直徑1.0～3.0 μm，革蘭氏染色分別為陰性、陽性和陰性，故B1、B2、B3屬于細菌。D平板的菌落為疏松的毛絨狀，營養菌絲為白色毛絨狀，直徑為1.5～3.5 μm，孢子囊自孢子梗生出，因此F1屬于真菌。將分離的4種微生物分別制備斜面菌種保存。

2.3 促進柵藻生長的微生物

按1.2.3方法將得到的4種微生物接種至無菌柵藻中培養，測定柵藻與不同微生物混合培養的生物量和脂類含量，結果見圖3。

注：CK.柵藻單獨培養；M1.柵藻與B1混合培養；M2.柵藻與B2混合培養；M3.柵藻與B3混合培養；M4.柵藻與F1混合培養。

由圖3可知，實驗結束時M1、M4和M2的生物量與脂類含量均高于CK(0.64 g/L，158.4 mg/g)，生物量分別達到1.1、1.0、0.92 g/L，脂類含量分別為215.6、211.2、203.4 mg/g，而M3的生物量與脂類含量(0.61 g/L，153.6 mg/g)則低于CK，說明細菌B3對柵藻的生長有抑制作用，而細菌B1、真菌F1和細菌B2則能促進柵藻的生長。其中細菌B1對柵藻生長的促進效果最顯著，因此將細菌B1作為促進柵藻生長的最佳微生物用于進一步的實驗。

2.4 柵藻與細菌B1混合培養的最佳接種比例

按照1.2.4方法考察柵藻與細菌B1不同接種比例混合培養的生物量和脂類含量，結果見圖4。

圖4 柵藻與細菌B1不同接種比例混合培養的生物量和脂類含量

由圖4可知：柵藻與細菌B1接種比例為4∶1時，柵藻生物量與脂類含量分別達到最高值(1.18 g/L、217.1 mg/g)，較柵藻單獨培養(CK)的生物量(0.7 g/L)與脂類含量(158.3 mg/g)分別提高了68.6%、37.1%。因此，后續實驗中均以柵藻與細菌B1的最佳接種比例4∶1進行實驗。

2.5 促進柵藻生長的最佳NaHCO3質量濃度

按照1.2.5方法考察柵藻在不同NaHCO3質量濃度條件下的生物量和脂類含量，結果見圖5。

圖5 柵藻在不同NaHCO3質量濃度條件下的生物量和脂類含量

由圖5可知，與柵藻單獨培養(0.72 g/L，156.8 mg/g)相比，NaHCO3質量濃度為0.3 g/L時柵藻的生物量與脂類含量均達到最大值(1.38 g/L，225.1 mg/g)，分別提高91.7%和43.6%，因此添加 NaHCO3培養柵藻的最佳NaHCO3質量濃度為0.3 g/L，后續實驗中NaHCO3的添加量按此質量濃度進行。

2.6 不同培養方式下反應參數的比較

2.6.1 生物量及生長動力學參數(見圖6、表1)

表1 不同培養方式下的細胞生長動力學參數

注：CK.柵藻單獨培養；M.柵藻與B1以接種比例4∶1混合培養；C.添加0.3 g/L NaHCO3培養柵藻；MC.0.3 g/L NaHCO3條件下，柵藻與B1以接種比例4∶1混合培養。下同。

由圖6可知：CK的生物量初期增長較為緩慢，8 d后上升速度加快，14 d后趨于穩定，最終達到0.82 g/L；M和C的生物量分別從6 d和4 d開始快速上升，培養結束時分別達到1.38 g/L和1.63 g/L；MC的生物量則在3 d即開始迅速上升，至12 d時趨于穩定，培養結束時達到2.42 g/L。與CK相比，M、C和MC的生物量分別提高了68.3%、98.8%和195.1%。

由表1可知，與柵藻單獨培養相比，M、C和MC平均比生長速率分別提高了20.0%、26.7%和46.7%，平均生長速率分別提高73.1%、107.7%和211.9%。其中，M促進柵藻生長的機理可能與其他光合自養條件下藻-菌混合培養[29-32]的機理相似，即柵藻光合作用釋放的氧氣和胞外有機物被細菌吸收代謝后，解除了高濃度氧對柵藻光合作用的抑制并釋放出CO2促進了光合作用。而C促進柵藻生長的原因顯然是提高了反應體系內CO2的濃度，進而提高了光合作用效率。MC比M和C更能促進柵藻的細胞生長是由于提高了柵藻對NaHCO3的吸收。

2.6.2 培養液中硝態氮質量濃度(見圖7)

圖7 不同培養方式下培養液中硝態氮質量濃度變化曲線

由圖7可知，不同柵藻培養液的硝態氮質量濃度在0～2 d均快速下降，這可能與實驗過程中的錐形瓶瓶壁吸附或硝態氮快速進入細胞但未被利用有關。2～4 d硝態氮質量濃度下降緩慢，4 d開始快速下降，其中MC的下降速率最快，至12 d降為0，實驗結束時M和C的硝態氮質量濃度分別為11.8 mg/L和0.1 mg/L，CK中硝態氮的下降速率最慢，實驗結束時的質量濃度仍然較高，達到33.2 mg/L。MC的硝態氮質量濃度下降速率比M和C以及CK的快，說明MC較M和C促進了柵藻對NaNO3的吸收和利用。

2.6.3 培養液pH(見圖8)

由圖8可知，CK和M的pH由初始值6.2緩慢上升，10 d后M的pH趨于平穩，而CK的pH繼續升高，實驗結束時CK和M的pH分別達到8.45和8.14，整個培養過程中M的pH始終比CK的低。C和MC由于添加了NaHCO3,其pH初始值較高，培養過程中C的pH由初始8.2迅速升高至9.9后開始逐漸下降，最終穩定在8.6；MC的pH在4 d時升高至10.1后趨于穩定，8 d后開始緩慢下降，培養結束時達到8.91。藻類光合自養培養過程中，由于藻細胞對生理堿性鹽的吸收，導致培養液pH上升。CK的pH緩慢上升主要是由于柵藻對NaNO3的吸收所致，而M的pH低于CK的pH可能是由于細菌B1釋放的CO2和分泌的酸性胞外產物造成的。相比之下，C和MC的pH上升是由于柵藻對NaNO3和NaHCO3的吸收導致的，而整個培養過程中MC的pH始終高于C的pH，說明MC比C促進了NaHCO3的吸收和利用。

圖8 不同培養方式下培養液pH變化曲線

2.6.4 柵藻脂類含量(見表2)

表2 不同培養方式下的柵藻脂類含量、合成速率和比合成速率

由表2可知，與CK相比，M、C、MC體系柵藻的脂類含量，分別提高了35.6%、41.6%、50.4%，脂類合成速率分別提高了133%、189%、354%，脂類比合成速率分別提高了37.4%、45.5%、54.5%。與CK相比，M和C均能提高反應體系的C/N，MC的NaNO3質量濃度比M和C的低，具有更高的C/N，因而更有利于細胞內碳代謝通量流向脂類合成方向，促進了脂類的合成[33]。MC在12 d時的NaNO3質量濃度已降為0，使藻細胞提前進入“氮饑餓”狀態，而高C/N和“氮饑餓”均能促進藻類脂類合成[33-35]。

2.6.5 柵藻脂類的脂肪酸組成(見表3)

由表3可知，柵藻在不同培養方式下的脂類脂肪酸組成基本相同，碳原子數介于14～22之間，其中C16∶0、C18∶1和C18∶2含量較高。與CK相比，M、C、MC C16∶0含量分別提高20.4%、27.9%、38.3%，C18∶1含量分別提高了17.0%、30.9%、47.4%，C18∶2含量提高了7.1%、14.7%、20.5%。

表3 不同培養方式下柵藻的脂肪酸組成及含量 %

3 結 論

藻-菌混合培養和添加NaHCO3培養均能提高柵藻的生物量和脂類含量，而添加NaHCO3的藻-菌混合培養則進一步提高了柵藻的生物量和脂類含量以及脂類組成中C16∶0、C18∶1和C18∶2的含量。因此，添加NaHCO3的藻-菌混合培養比單獨的 藻-菌混合培養和添加NaHCO3培養更能促進細胞生長和脂類合成，是一種高效的生物柴油原料生產模式。