中華鱉Dkkl1 基因的分子特征及對外源性激素處理的響應

汪泳昌，祝駿賢，李建松，陳 辰，紀利芹，洪孝友，劉曉莉，王亞坤，吳聰聰，余汶君，羅來福，陳海港，魏成清，朱新平，張俊杰，李 偉

1.新疆農業大學 生命科學學院，新疆 烏魯木齊 830052

2.中國水產科學研究院珠江水產研究所/農業農村部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，廣東 廣州 510380

3.惠州市財興實業有限公司，廣東 惠州 516000

Dkkl1 (Dickkopf-like 1) 是Dickkopf (DKK) 基因家族中的一員，屬于分泌型糖蛋白，最初是在非洲爪蟾 (Xenopus laevis) 中被鑒定為胚胎頭部誘導劑和Wingless (Wnt) 拮抗劑[1]。已有研究證明Dkkl1 可以在脊椎動物的多種細胞類型中抑制Wnt 誘導的β-catenin 的穩定性[2-3]。在小鼠 (Mus musculus) 中，Dkkl1 由單個基因編碼，其表達首先在2 細胞期和4 細胞期中檢測到[4]，在胚胎第15 天時，Dkkl1基因在發育中的骨骼和眼睛中表達，但在性腺原基中不表達。然而在成年小鼠中，Dkkl1基因的表達只限于睪丸，Dkkl1mRNA 在發育中的精母細胞中豐富表達，首先在發育中的頂體中表達，然后在成熟精子的頂體中積累[5]。不僅如此，Dkkl1 還是一種N-糖基化蛋白，在精母細胞成熟過程中參與精子合成[6]，它標志著發育中的精母細胞和精子細胞，通過靶向敲除Dkkl1基因，小鼠胚胎正常發育，形成可育后代[7]。但是，Dkkl1基因的缺失會導致精子體外受精能力嚴重受損，而這種作用在體內受精中似乎得到了某種因素的補償。此外，Dkkl1基因還與人 (Homosapiens)的弱精子癥[8]和不育癥[9]密切相關。上述研究表明，Dkkl1基因在哺乳動物睪丸發育和精子發生過程中扮演著十分重要的角色，但是目前關于Dkkl1基因在龜鱉類動物中的研究還鮮有報道。

爬行綱在物種進化過程中具有特殊的進化位置，是第一批真正擺脫水環境依賴而登陸的脊椎動物，也是羊膜動物中最早的一種，既能進化為哺乳類，又能演化為鳥類，在動物學研究中占有舉足輕重的地位[10]。中華鱉 (Pelodiscussinensis) 隸屬于爬行綱、龜鱉目、鱉科、中華鱉屬，是我國淡水特種養殖中的重要品種，因其獨特的營養價值[11]和藥用價值[12]而深受市場青睞，直接經濟價值超過百億。隨著年齡的增長，中華鱉睪丸發育呈現出不同的形態特征，大致可分為4 個時期：精原細胞期、精母細胞期、精子細胞期和精子期。1 冬齡雄性中華鱉精巢中的細胞分散，曲細精管內主要由精原細胞組成；2 冬齡曲細精管中的生精上皮除了有精原細胞外，初級精母細胞也逐漸分化形成；3 冬齡精巢已具備各種類型的精細胞，曲細精管腔內出現大量精子[13-14]。中華鱉的睪丸發育和精子發生受多基因的調控，例如：L i 等[15]發現中華鱉中Hmgb2基因的表達呈現睪丸特異性，主要存在于圓形精子細胞和精子中，證實其在中華鱉的精巢發育和精子生成過程中具有重要功能；Lei 等[16]發現Spats1是一個雄性表達特異的基因，其主要存在于中華鱉的初級精母細胞、次級精母細胞和精子中，與中華鱉的精子發生和釋放密切相關；Zhou 等[17]使用RNA 干擾技術成功敲除Amh基因，證明其在促進中華鱉的睪丸發育和精子發生方面具有必要和充分的作用。然而，除了關鍵基因之外，外源性激素也可以在一定程度上調控睪丸發育和精子發生[18-19]，且在不同發育時期發揮著不同的作用[20]。例如：意大利壁蜥 (Podarcis sicula) 在高濃度17β-雌二醇 (E2) 和低濃度甲基睪酮 (MT)中會阻滯精子發生[21]，而在低濃度E2和高濃度MT 中可誘導精子發生的恢復[22]。鋸蓋魚 (Centropomusundecimalis)在15 和30 mg·kg–1的MT 下可刺激睪丸的發育和生長并加速精子發生[23]；產后15～30 d 的大鼠暴露于E2下會延遲精子發生[24]。然而，近年有關Dkkl1基因的研究十分匱乏，且現有的研究還遠不足以闡明中華鱉精子發生的背后機制。因此本研究克隆了中華鱉Dkkl1基因的cDNA 序列，對其序列特征進行詳細分析，探索其在不同體組織和不同時期性腺中的表達模式，以及其對外源性激素 [E2和17α-甲基睪酮 (17α-MT)] 處理的響應，為深入探討Dkkl1基因在中華鱉睪丸發育和精子發生中的功能研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料的收集

本研究所用中華鱉采購自廣東省惠州市財興實業有限公司，選取1、2、3 冬齡健康中華鱉，麻醉后放血。取3 冬齡中華鱉的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、肌肉、卵巢和1、2、3 冬齡的精巢組織于無酶凍存管中，并將其迅速放入液氮中速凍，于-80 ℃超低溫冰箱保存，每種組織均取3 個生物重復。

1.2 總RNA 提取及cDNA 第一鏈合成

使用Trizol 法提取中華鱉各組織的總RNA，提取RNA 的濃度和質量由NanoQTM核酸檢測儀和1% (w) 瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用HiScript?III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper) 反轉錄試劑盒 (Vazyme，中國) 去除基因組DNA 污染，合成cDNA 第一鏈。

1.3 中華鱉Dkkl1 cDNA 的克隆

參考NCBI GenBank 公布的中華鱉Dkkl1基因序列信息 (XM_014572465) 設計引物Dkkl1-F/Dkkl1-R (表1)，以3 冬齡中華鱉精巢cDNA 為模板，將Dkkl1基因的開放閱讀框 (Open reading frame,ORF) 區域進行擴增，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產物進行檢測。目的片段使用Gel Extraction Kit (Omega，中國) 膠回收試劑盒進行回收，連接至pMD19-T (TaKaRa，中國) 載體上，將連接產物轉化至DH5α 感受態細胞 (TaKaRa，中國) 中。最后，從轉化后的細胞中篩選出陽性克隆，并送至廣州天一輝遠基因科技有限公司進行測序。

1.4 Dkkl1 基因的生物信息學分析

使用ExPASy (https://web.expasy.org/translate/) 在線網站預測開放閱讀框[25]，采用DNAMAN 軟件進行氨基酸序列的翻譯和同源性比較[26]、ClustalW (BioEdit) 軟件進行氨基酸序列的多重比對[27-28]，通過ProtParam 分析Dkkl1 蛋白的理化性質[29]和SOPMA 分析Dkkl1 蛋白二級結構[30]，利用SWISS-MODLE 同源建模構建Dkkl1 蛋白質三級結構[31]。

1.5 組織表達分析

運用Primer 軟件設計實時熒光定量PCR (RT-qPCR) 所需引物Dkkl1-qF/Dkkl1-qR，同時選擇中華鱉的Ef1α基因作為內參基因[32](表1)。以中華鱉不同組織的cDNA 作為模板，利用Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems，新加坡)對其進行實時熒光定量PCR 分析。反應體系為20 μL，其中2×iTaq Universal SYBR Green (BIO-RAD，美國) 10 μL，引物Dkkl1-qF/Dkkl1-qR 各0.5 μL，cDNA 模板2 μL，雙蒸水 (ddH2O) 7 μL。半定量分析使用與RT-qPCR 相同的特異性引物 (Dkkl1-qF/Dkkl1-qR)，采用各組織的cDNA 作為模板進行普通PCR (RT-PCR) 擴增。擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠分離并進行拍照 (GenoSens2200，中國)。

1.6 成體雄性中華鱉外源性激素處理

選取體表無傷、活躍的3 冬齡雄性中華鱉33 只，其中30 只平均分為2 組 (E2處理組和17α-MT 處理組)，從腿部肌肉注射E2和17α-MT，質量濃度為50 μg·μL-1，劑量為10 mg·kg-1[16]；另外3 只注射等劑量的溶劑作為空白對照組，分別于激素處理后第6、第12、第24、第48 小時和第7 天隨機采集3 只雄性性腺，置于液氮中進行總RNA 提取和實時熒光定量PCR 分析。

1.7 數據分析

使用2-ΔCt法于第6、第12、第24、第48 小時計算目的基因的相對表達量[15]，每個實驗至少獨立重復3 次，所有數據均以“平均值±標準誤”表示。采用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析，P<0.05 表示具有顯著性差異。

2 結果

2.1 中華鱉Dkkl1 基因克隆結果及其編碼蛋白氨基酸序列分析

克隆獲得的中華鱉Dkkl1cDNA 序列長為823 bp，其中3' 非編碼區 (UTR) 長67 bp，5' UTR 長90 bp，ORF 長666 bp，共編碼222 個氨基酸(圖1)。中華鱉Dkkl1 蛋白的相對分子質量為24.924 77 kD，理論等電點為10.8，不穩定系數為58.71，脂溶系數為84.91，總平均親水系數為-0.418，表明Dkkl1 蛋白是一種穩定性較差、親水性較強的堿性蛋白質。其二級結構主要由α-螺旋、β-折疊、無規則卷曲和延伸鏈組成，其中α-螺旋占33.78%，β-折疊占5.86%，無規則卷曲占46.85%，延伸鏈占13.51%，三級結構主要以α-螺旋和無規則卷曲為主。氨基酸序列同源性比對結果顯示：其與中華草龜(Chinemysreevesii)的相似性較高 (81%)，與棱皮龜 (Dermochelyscoriacea)的相似性較低(70%)，與綠海龜(Cheloniamydas)、三趾箱龜(Terrapene carolinatriunguis)、巴西紅耳龜(Trachemysscriptaelegans)、西部錦龜(Chinemyspictabellii) 的同源性分別為80%、79%、78%、78% (圖2)。

圖1 中華鱉 Dkkl1 基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide of P.sinensis Dkkl1 gene and its encoded protein sequence

圖2 中華鱉與其他物種的 Dkkl1 氨基酸序列同源相似性比對注：所有的氨基酸序列來自于NCBI 數據庫：巴西紅耳龜，XM_034791724.1；綠海龜，XM_037888484.1；三趾箱龜，XM_026659251.1；中華草龜，XM_039510142.1；西部錦龜，XM_024113109.1；棱皮龜，XM_038381465.2。黑色陰影為氨基酸序列比對相同的位點，灰色陰影為相近位點。Fig.2 Homologous comparison of Dkkl1 amino acid sequence of P.sinensis with other speciesNote: All amino acid sequences come from NCBI database: T.scripta elegans,XM_034791724.1; C.mydas,XM_037888484.1;T.carolinatriunguis,XM_026659251.1; C.reevesiis,XM_039510142.1; C.picta bellii,XM_024113109.1; D.coriacea,XM_038381465.2.The black and gray shadows represent the same and similar sites,respectively.

2.2 中華鱉Dkkl1 基因的組織表達

RT-qPCR 結果顯示，中華鱉Dkkl1mRNA 在3 冬齡成體精巢中極顯著性高表達 (P<0.001)，而在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、肌肉和卵巢中幾乎不表達 (圖3-a)。RTPCR 結果顯示，該基因僅在3 冬齡中華鱉成體精巢組織中檢測到目的條帶，而在其他體組織中均未檢測到 (圖3-b)。

圖3 中華鱉 Dkkl1 基因在 3 冬齡成體組織中的表達情況注：***.P<0.001；M.DL2000 Marker。Fig.3 Expression of Dkkl1 gene in tissues of 3-winter-age adult P.sinensisNote: ***.P<0.001; M.DL2000 Marker.

2.3 中華鱉不同發育時期精巢中Dkkl1 基因的表達變化

通過RT-qPCR 檢測中華鱉Dkkl1基因在不同發育時期精巢中的表達變化。結果顯示，隨著中華鱉年齡的增長，其精巢中Dkkl1基因的表達量逐漸上升，并在3 冬齡時達到頂峰。此外，Dkkl1基因在2 冬齡和3 冬齡精巢中的表達量極顯著高于1 冬齡 (P<0.001)，而2 冬齡和3 冬齡精巢之間的表達差異不顯著 (P>0.05) (圖4)。

圖4 中華鱉 Dkkl1 基因在不同發育時期精巢中的表達情況注：**.P<0.01表示差異極顯著。Fig.4 Expression of P.sinensis Dkkl1 gene in different developmental periods of testisNote: **.P<0.01 represents very significant difference.

2.4 E2 和17α-MT 處理對中華鱉精巢Dkkl1 基因表達的影響

對雄性中華鱉進行E2和17α-MT 激素處理后，其精巢中Dkkl1基因的表達量顯著降低 (P<0.05)。E2處理后，精巢中Dkkl1基因的表達量持續下降，至第48 小時幾乎為0，但是在7 d 后得到部分恢復；17α-MT 處理后，精巢中Dkkl1基因的表達量同樣受到顯著性抑制 (P<0.05)，在第48 小時達到最低值，但在第7 天顯著上升 (P<0.05) (圖5)。

圖5 中華鱉精巢中 Dkkl1 基因對 17β-雌二醇和17α-甲基睪酮處理后的表達響應注：不同小寫字母表示組間存在顯著性差異(P<0.05)。Fig.5 Expression response of Dkkl1 gene in testis of P.sinensis to E2 and 17α-MT treatmentNote: Different lowercase letters represent significant differences between groups (P<0.05).

3 討論

本實驗通過克隆得到中華鱉Dkkl1基因的cDNA 序列，序列長823 bp，共編碼222 個氨基酸，氨基酸序列比對和NJ 進化樹結果表明其與爬行類親緣關系最近。RTqPCR 和RT-PCR 結果顯示Dkkl1mRNA 在精巢組織中高表達且極顯著高于卵巢等其他組織 (P<0.001)，表明Dkkl1基因表達在中華鱉中具有性別二態性和組織特異性。這與在小鼠和人類中發現的兩性差異表達模式類似。Dkkl1基因的組織分布研究表明，Dkkl1mRNA 僅在睪丸中表達豐富，而在附睪和其他組織中幾乎不表達。此外，人類基因芯片結果顯示Dkkl1基因在成年男性睪丸中的雜交信號強度是胎兒睪丸的405.56 倍，對人體多個組織的RTPCR 分析表明，Dkkl1mRNA 僅在睪丸中表達，Western blot 分析也表明Dkkl1基因主要在人睪丸中表達[5]。綜上所述，推測Dkkl1基因在中華鱉睪丸形成或功能維持上可能具有重要的調控作用。

同時，本實驗發現，隨著中華鱉年齡的增長，其精巢中Dkkl1基因的表達量逐漸上升，并在3 冬齡時達到頂峰，Dkkl1基因在中華鱉成體睪丸中的表達與其睪丸發育和精子發生的過程大致吻合。1 冬齡中華鱉的睪丸主要由精原細胞組成；2 冬齡時逐漸分化為初級精母細胞和次級精母細胞，并且在生精管中觀察到少量精子；3 冬齡時已經完全性成熟，睪丸中產生大量成熟精子[33]。Dkkl1基因這種特殊的表達模式與睪丸發育成熟程度呈正相關，并且很可能參與了精子發生過程。因此，在生產實踐中通過Dkkl1基因的相對表達量可預估中華鱉睪丸的發育成熟程度，這可為選育高繁殖力和優秀的雄性親本提供新的生物指標。

精子發生是雌激素與雄激素共同調節的結果[34]。E2是一種天然的雌激素[35]，17α-MT 是一種具有雄激素效應的內分泌干擾物[36]，這兩種物質已被廣泛用于與睪丸發育和精子發生有關的功能研究[37-38]。本實驗通過向雄性中華鱉注射外源性激素E2和17α-MT 后，發現兩者均可顯著抑制Dkkl1基因的表達。相比于17α-MT，E2對Dkkl1基因的抑制作用更強，在注射12 h 后，其表達量幾乎為零。有研究表明，外源性雌激素可通過影響雌激素受體途徑誘導精子發生障礙，并對精子的質量和受精潛力產生負面影響[39]，低劑量的E2可延遲精子產生，而高劑量的E2則會完全抑制精子產生[40]。Dkkl1基因在精子發生過程中被定位在成熟的精子或精子的頂體中[4]，同時還發現Dkkl1基因在小鼠胎盤發育和精子發生過程中表達，并且具有促進精子穿透透明帶的能力，將其敲除后，小鼠體外受精能力顯著降低[6]。因此，外源性激素E2處理可能是抑制Dkkl1基因表達的關鍵因素。雌、雄激素通過不同的受體途經影響精子發生，而雄激素大多是通過雄激素特異性受體AR 介導的[41]。本實驗中，通過注射外源性激素17α-MT 導致Dkkl1基因的表達受到顯著抑制。Dakhova 等[42]發現Dkkl1基因是睪酮產生的負調控因子，敲除Dkkl1基因導致類固醇生成酶基因Cyp11a和Cyp17表達量增加，使睪酮的合成局部上調。而注射外源性激素17α-MT 會導致生物體內睪酮水平瞬間升高[43]，從而可能抑制中華鱉Dkkl1基因的轉錄，以響應體內睪酮水平的升高。

4 結論

本實驗通過克隆得到中華鱉Dkkl1基因的cDNA 片段，對其進行生物學信息分析，發現中華鱉在進化關系上與爬行類動物相近。運用RT-PCR 和RT-qPCR 對Dkkl1基因在雌、雄中華鱉各組織和精巢不同發育時期的表達差異進行了分析，確定Dkkl1基因在3 冬齡成體精巢中顯著高表達，并且隨著年齡的增長其表達量逐漸升高。通過注射外源性激素E2和17α-MT，發現其可顯著抑制Dkkl1基因在精巢中的表達。由以上結果可以推論，Dkkl1基因在中華鱉睪丸發育和成熟過程中起著重要作用，可能與精子發生密切相關，且可受外源性激素調控，這為今后龜鱉類動物睪丸發育及精子發生機制的研究拓展了新思路。