基于微衛星多重PCR 的黃鱔親子鑒定技術

魯弘毅，田海峰，胡喬木，李 忠

1.中國水產科學研究院長江水產研究所，湖北 武漢 430223

2.華中農業大學 水產學院，湖北 武漢 430070

黃鱔 (Monopterusalbus) 屬于硬骨魚綱、合鰓魚目、合鰓魚科，為淡水肉食性魚類[1]，主要分布于中國、日本、印度，以及泰國、印度尼西亞、緬甸等一些東南亞國家[2]。在我國，黃鱔分布在除青藏高原以外的廣泛區域，是我國重要的名特優淡水經濟魚類之一，其肉質鮮美，具有很高的營養價值[3]。根據《中國漁業統計年鑒》數據，湖北、江西、安徽、湖南、四川是我國黃鱔養殖主產區，在2016—2020 年間年均產量超30 萬噸，其中湖北省的產量最高，其年產量占全國的40%以上[4-8]。黃鱔通常在完成第一次產卵后會由雌性轉為雄性，導致適齡繁育的雌性親本數量稀缺，極大限制了其產業發展[9]。目前，我國黃鱔養殖主要依賴于野生苗種捕撈，質量參差不齊，這種高強度捕撈對黃鱔養殖產業的可持續性及種質資源造成了極大破壞。在育種方面，目前尚無國家認定的黃鱔養殖品種，因此開展黃鱔品種選育、篩選優良品系、進行家系管理，是當下黃鱔育種工作中的迫切需求。筆者課題組已實現黃鱔全人工繁育技術的突破，已應用于規?；?，并開展了家系選育工作，為下一步黃鱔良種的選育奠定了基礎。

在黃鱔后續良種選育工作中，親子鑒定及系譜管理技術是避免其近交衰退的關鍵技術。傳統家系選育工作存在繁瑣及環境差異等問題，傳統標記手段也存在幼體標記困難及造成應激、損傷、脫落等問題。開發高效親子鑒定技術可為黃鱔良種選育和種質資源保護及利用提供技術支持。親子鑒定又稱親權鑒定，可以通過遺傳特征相互驗證親本和子代之間是否存在親緣關系。在育種生產中開展親子鑒定可有效避免近交導致的種質退化問題。微衛星序列 (Simple sequence repeats,SSR) 具有高度的多態性、穩定性、呈共顯性遺傳、數量豐富且遵循孟德爾遺傳定律的優點，在水生動物親子鑒定中應用廣泛。文萍等[10]使用2 組微衛星多重PCR 體系對黃喉擬水龜 (Mauremysmutica) 進行親子鑒定，在父本信息未知時，母本的鑒定準確率為87%；苗貴東等[11]通過2 組微衛星多重PCR 體系對大菱鲆(Scophthalmusmaximus) 7 個家系開展了親子鑒定，準確率達到98.26%；謝敏敏等[12]通過建立2 組微衛星多重PCR 體系，對黿 (Pelochelyscantorii)家系進行親子鑒定分析，得到10 個位點的雙親排除率為98%；Dong 等[13]為了評估中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis) 養殖群體親緣鑒定的可行性，使用5 個微衛星位點，獲得了92.9%的鑒定成功率；辛苗苗等[14]使用7 個微衛星位點對多倍體中華鱘 (Acipensersinensis) 進行親子鑒定分析，得到雙親累計排除率為99.99%；Yang 等[15]利用10 個微衛星位點對鱖 (Sinipercachuatsi) 5 個全同胞家系進行了親子鑒定，得到的實際鑒定率為95%，且隨機選擇了69 個后代進行雙盲試驗，結果表明95% 的子代可以正確聚類；Zhu 等[16]篩選出了14 個用于評價斑節對蝦 (Penaeusmonodon) 親子關系的微衛星標記，并用其中多態性最高的6 個微衛星標記獲得了99%的鑒定準確率。

目前，黃鱔已開發出較多的微衛星標記，如劉臻等[17]通過富集文庫法開發了20 個微衛星標記，設計了8 對4 堿基重復高度多態性的微衛星引物，分析了3 種不同性別表型黃鱔群體的遺傳多樣性；Li 等[18]使用富集文庫法分離了16 對微衛星引物，分析了兩個黃鱔自然群體的遺傳多樣性和群體結構；Zhang 等[19]通過RAD (Restriction-site associated DNA tags，簡化基因組) 測序在基因組中鑒定出了9 897 個微衛星，并篩選出28 對多態性引物。但上述研究開發的微衛星標記僅用于遺傳多樣性分析，目前尚未見利用微衛星多重PCR 體系對黃鱔進行親子鑒定的相關研究報道。本研究利用筆者課題組前期發表的高度多態性微衛星標記[20]和基于黃鱔基因組數據開發的新的微衛星標記[21]，結合繁育的黃鱔全同胞家系，建立了基于微衛星多重PCR 的親子鑒定技術，為后續黃鱔育種以及種質資源保護提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃鱔樣本取自中國水產科學研究院長江水產研究所窯灣基地。雌、雄親本按照1∶1 比例得到11 個全同胞家系，雌、雄親本完成繁殖后取背部肌肉于-80 ℃保存，每個家系在孵化出膜至30 日齡隨機選取10 尾于-80 ℃保存。隨機挑選4 個黃鱔家系子代各10 尾和隨機候選親本4 尾，同樣-80 ℃保存。

1.2 基因組DNA 的提取

基因組DNA 采用苯酚-氯仿法[22]提取，用1%(w) 瓊脂糖凝膠電泳以及分光光度計檢測DNA 濃度及完整性。將合格的DNA 用雙蒸水 (ddH2O) 稀釋至100 ng·μL-1，于-20 ℃保存。

1.3 多態性微衛星引物的篩選

黃鱔全基因組數據來源于中國科學院國家基因研究中心數據庫 (CRA003062)。使用MISA 對黃鱔全基因組序列中的完美型SSR 進行檢索[23]，檢索標準與課題組前期篩選微衛星的標準一致。挑取了148 個SSR 位點，同時提取SSR 位點前后200 bp的序列，使用Primer premier 3.0 軟件設計引物。隨機選取6 尾黃鱔的混合DNA 為模板，進行微衛星引物的擴增效果及初步的多態性驗證，共獲得35 對擴增效果理想的引物。另挑選課題組前期發表的具有高度多態性的15 對微衛星引物，共50 對微衛星引物，以參與繁殖的22 尾黃鱔親本DNA為模板進行篩選，選擇擴增等位基因數較多、出峰質量較好的位點。

1.4 多重PCR 體系的構建及優化

對篩選獲得的16 對微衛星引物進行熒光修飾(FAM、HEX、ROX、TAMRA) ，由武漢天一輝遠科技有限公司合成，以親本DNA 為模板進行多重PCR 構建。構建過程中避免產生引物二聚體、發卡結構和錯配等現象，優化模板DNA 濃度、退火溫度、延伸時間等反應條件。根據片段大小將引物分為兩組，兩組引物等比混合開展預實驗，根據出峰結果調整引物濃度，最終確定最佳的多重PCR 體系。

PCR 反應體系10 μL，包含2×PCR Mix 5 μL，10 pmol·μL-1上下游引物各0.5 μL，基因組DNA 1 μL 以及滅菌超純水3 μL。擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，62～53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共10 個循環，其中退火溫度每次循環下降1 ℃；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25 個循環；72 ℃延伸20 min。使用1% (w) 的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物的完整性，然后由ABI3730XL 測序儀進行毛細管電泳檢測 (由武漢天一輝遠生物科技有限公司完成)，使用GeneMarker[24]讀取各位點等位基因大小。

1.5 數據統計及分析

將整理的親本與子代基因型結果導入Cervus 3.0[25]進行等位基因頻率分析、模擬分析和親子鑒定分析。模擬分析設置模擬子代數為10 000 個，候選親本數為父母本各11 對，對100%的候選親本進行抽樣模擬分析，允許1%的分型錯誤，置信度為95%。在性別已知和未知的情況下，基于16 個微衛星位點模擬分析不同候選親本數情況下的鑒定率，設置模擬子代數目為10 000 個，候選親本數分別為20、50、100、150 和200 對，抽樣比例為100%，允許1% 的分型錯誤，置信度為95%。根據多態信息含量大小將16 個微衛星位點排序，分析微衛星位點數與鑒定率之間的關系。統計所有子代樣本在某一位點出現的所有基因型，單個樣本在該位點存在對應基因型則記為1，否則記為0，構建基因型0/1 矩陣，并根據該矩陣利用NTSYS軟件[26]對110 尾家系子代進行聚類分析。利用NTSYS 軟件對4 個家系共40 尾子代進行聚類分析，驗證微衛星多重PCR 體系的準確率。

其中單個位點的非親排除率 (NEP) 由Cervus 3.0 軟件計算得到，累積非親排除率 (CEP) 計算公式如下：

式中：RCEP為累積非親排除率；RNEP,i為第i個微衛星位點的NEP 值；n為微衛星位點排除概率的數目。CE-1P 對應用NE-1P 計算，CE-2P 對應用NE-2P 計算，CE-PP 對應用NE-PP 計算。

2 結果

2.1 微衛星的篩選與多重PCR 建立

從黃鱔基因組預測的148 個微衛星位點，篩選獲得了擴增效果較好的微衛星引物35 對。進而以30 尾親本為模板，從50 對微衛星引物中篩選得到16 對多態性高、擴增效果好的微衛星引物。

將篩選的16 對微衛星引物進行不同組合并優化反應程序、調整引物濃度比例，最終確定2 組多重PCR (表1)。2 組多重PCR 的擴增效率都較好，分型結果符合預期。A 組多重PCR 體系各位點如見圖1。

圖1 A 組多重 PCR 的等位基因Fig.1 Alleles of multiplex PCR of Group A

表1 黃鱔 2 組微衛星多重PCR 的引物信息Table 1 Primer information of two multiplex PCR sets of microsatellites in M.albus

2.2 親子鑒定分析

16 個微衛星位點在黃鱔22 尾親本和110 尾子代中的遺傳參數如表2 所示。等位基因數 (Na) 為3～9，平均等位基因數為5.562；觀測雜合度和期望雜合度分別為0.421～0.771 和0.382～0.797，平均觀測雜合度和期望雜合度分別為0.627 和0.619；多態信息含量 (PIC) 為0.347～0.766，平均多態信息含量為0.564，其中Ma71、Ma78、Mta021、Mta027和Mta033 表現為中度多態性，其余11 個位點均表現為高度多態性。16 個位點均未偏離Hardy-Weinberg 平衡。

表2 16 個微衛星位點的遺傳參數Table 2 Genetic parameters of 16 SSR loci

將16 個微衛星位點根據多態信息含量由大到小排序探究微衛星數量與鑒定率之間的關系。結果如圖2 所示，隨著微衛星位點數的增加，親子鑒定的模擬鑒定率和實際鑒定率逐漸上升。當位點數為8 時，親子鑒定的模擬鑒定率和實際鑒定率均達到95%。當位點數繼續增加，模擬鑒定率無限接近100%，實際鑒定率則保持在95%左右。實際親子鑒定結果顯示，110 尾子代中僅有6 尾子代的三聯LOD≤0，無法準確匹配到真實的父母本，運用16 個微衛星位點的實際鑒定成功率為95%。

圖2 微衛星位點數與鑒定率Fig.2 Number and identification rate of SSR loci

利用構建的2 組多重PCR 體系計算黃鱔11 個家系單個位點的排除概率和累計排除概率，結果見表2。NE-1P、NE-2P、NE-PP 分別為0.570～0.928、0.393～0.803、0.143～0.675，CE-1P、CE-2P、CE-PP 分別為0.999 999 99、0.999 999 91、0.999 964 76，模擬親本已知的情況準確率為99.96%，置信度為95%。說明在理想情況下，使用這16 個微衛星標記進行黃鱔的親子鑒定可以在置信度95%的情況下達到99.96%的準確率。

此外，分別開展了在候選親本性別已知和未知的情況下進行不同候選親本數 (20、50、100、150、200 對) 的模擬分析。結果如圖3 所示，當候選親本數為20 對，在候選親本性別已知或未知的情況下，父本、母本和父母本聯合都能夠得到99%以上的鑒定率。當候選親本數為50 對時，無論父母本性別是否已知，父母本聯合的鑒定率也都在95%左右，單親本的鑒定率也在93%左右。當候選親本數為100 對時，無論父母本性別是否已知，父母本聯合的鑒定率保持在95%以上，但單親本的鑒定率下降到了90%以下。當候選親本數為150 對時，在候選親本性別已知和未知的情況下，父母本聯合仍然能夠得到95% 以上的鑒定率。當候選親本數繼續增加至200 對時，鑒定率在父母本聯合且性別已知的情況下依然有較高的鑒定率 (94.88%)，而在性別未知的情況下，鑒定率明顯下降 (89.56%)。單親本的鑒定率在親本數為200 對時下降至80%左右。

圖3 黃鱔16 個微衛星標記基于不同親本數的模擬分析Fig.3 Simulation analysis of 16 pairs microsatellite markers of M.albus based on different candidate parent

2.3 家系聚類分析

NTSYS 聚類分析的結果如圖4 所示，結果表明11 個家系的子代僅有2 尾無法正確聚類，分別為個體1-07 和101-07，其余子代個體均可以正確聚類，鑒定準確率為98.18%。

圖4 110 個黃鱔家系聚類分析圖注：右側數字代表家系，其中1-07 和101-07 為聚類錯誤的子代編號。Fig.4 Cluster analysis diagram of 110 families of M.albusNote: The numbers on the right represent families,and 1-07 and 101-07 are clustered incorrectly.

2.4 群體遺傳多樣性分析

利用兩組多重PCR 體系對黃鱔11 個子代家系群體和全部候選親本群體獨立進行遺傳多樣性分析，結果見表3。11 個子代家系群體的平均等位基因數為0.489，平均觀測雜合度和期望雜合度分別為0.632 和0.489，平均多態信息含量為0.394。比較候選親本群體和11 個子代家系群體的遺傳多樣性，發現候選親本群體的平均等位基因數、觀測雜合度和多態信息含量均要高于11 個子代家系群體。

表3 黃鱔子代和親本群體的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversities of offsprings and parents of M.albus

2.5 親子鑒定的應用

利用另外4 個家系的子代和候選親本44 尾個體進行聚類分析。結果如圖5，表明僅有個體10-04 和23-08 無法正確聚類，子代聚類準確率為95%，并且所有4 個候選親本均能正確聚類，說明本實驗建立的微衛星多重PCR 體系可以用于黃鱔家系的親子鑒定。

圖5 親子鑒定應用聚類分析注：“-”前的數字代表家系、后面的數字代表子代標號，M 代表家系對應的母本，F 代表家系對應的父本，其中10-04 為聚類錯誤的子代編號。Fig.5 Cluster analysis of parentage test applicationNote: The number before "-" represents the family; the number after "-" represents the offspring label; M represents the female parent corresponding to the family; F represents the male parent corresponding to the family,and 10-04 was clustered incorrectly.

3 討論

3.1 微衛星多重PCR 體系

自20 世紀80 年代Chamberlain 等[27]成功建立多重PCR (Multiplex polymerase chain reaction,MPCR) 體系以來，以其高效、敏感、大幅降低成本、提高檢測效率的優勢，在基因分型、遺傳分析等領域得到廣泛應用[28-31]。建立多重PCR 反應體系，需要保證同種熒光標記引物的擴增產物不會重疊，以避免基因型誤讀，從而實現多重優勢。本實驗篩選獲得16 個微衛星位點的平均He、平均Ho和平均PIC 分別為0.627、0.619 和0.564。根據Botstein 的標準[32]，11 個位點為高度多態性位點，5 個位點為中度多態性位點，這一結果與在蘭州鲇(Siluruslanzhouensis)[33]和圓口銅魚 (Coreius guichenoti)[34]中用于親子鑒定的微衛星位點多態性水平相近，表明這16 個位點具有豐富的遺傳多樣性，能夠用于后續的親子鑒定。張毅等[35]提出影響多重PCR 的關鍵因素是體系中引物之間是否兼容以及引物濃度的比例。本實驗將16 對微衛星引物依據擴增產物的片段大小及初步實驗，在退火溫度確定的情況下根據電泳結果不斷地調整引物濃度的比例來保證每對引物的擴增效果，最終構建了2 組多重PCR 體系，包括A 組的十二重PCR 體系和B 組的四重PCR 體系。其中本實驗A 組十二重PCR 體系經過不斷調整最終確定了各引物濃度的比例，而B 組四重PCR 體系僅實驗一次就獲得了良好的擴增效果，說明當多重PCR 體系中引物數量多的時候，引物濃度的比例尤為重要。

3.2 微衛星標記在黃鱔親子鑒定中的應用

近年來，微衛星親子鑒定被廣泛應用于種質資源保護、新品種選育及種群遺傳管理等方面，尤其在品種選育工作中能避免近親交配并指導生產[36-38]。在微衛星親子鑒定中，主要根據累計排除概率(CE-PP) 判定。趙桐茂[39]研究表明，如果CE-PP<80%，則不能確定存在親子關系；如果95%

在親子鑒定中出現實際鑒定率低于模擬鑒定率的情形，原因可能是基因型誤讀及無效等位基因的存在[42]。根據O'reilly 等[43]的研究，在基因分型過程中存在2%～3%的分型錯誤；此外，二、三堿基重復的微衛星標記在讀取基因型大小時可能會因為堿基重復單元較短而出現基因型的誤讀，使得基因分型的結果存在一定誤差。本實驗中，實際鑒定率(95%) 略低于模擬鑒定率 (99.96%) ，篩選的16 個微衛星位點中有且僅有一個位點 (Ma85) 的無效等位基因頻率大于10%，這可能是造成實際鑒定率略低的原因。

3.3 群體的遺傳多樣性分析

群體的遺傳多樣性主要通過有效等位基因數、雜合度 (Ho/He) 和多態信息含量表示，遺傳參數越高，多態性越高，說明群體的遺傳多樣性越高。通過分析發現，各個位點的PIC 與NE-PP 大致呈反比關系，與韓葉等[44]對大麻哈魚 (Oncorhynchus keta) 的研究結果一致。比較各子代家系與親本群體之間的遺傳多樣性，發現親本群體的平均期望雜合度和平均PIC 均高于子代各群體，說明親本群體的遺傳多樣性高于各子代家系群體的遺傳多樣性，在各子代家系群體中，子代家系81 的雜合度最高，子代家系101 和子代家系77 次之。比較各子代家系群體之間的多態信息含量，發現子代家系101 的多態信息含量最高，子代家系81 和41 次之。綜合雜合度和多態信息含量的比較，得出子代家系81 和101 具有較高的遺傳多樣性，說明其具有較高的育種潛力，可以作為家系選育的基礎群體。11 個子代家系群體觀測雜合度為0.631，期望雜合度為0.618，多態信息含量為0.562，整體而言雜合度和多態信息含量均低于我國長江中下游湖北、安徽、江蘇、浙江4 省的野生黃鱔群體[45-46]和江西1個野生黃鱔群體，但高于天津3個野生黃鱔群體[47]，說明選育家系子代群體的遺傳多樣性相比野生群體有所下降。

4 結論

本研究篩選得到了16 個高度多態性的微衛星標記，建立了2 組可用于黃鱔親子鑒定的微衛星多重PCR 體系，在黃鱔110 尾子代及22 尾親本中達到了95%的鑒定率，研究結果有助于黃鱔的家系選育與管理，并可為其種質資源保護和良種選育提供理論依據和技術手段。