溫度、光照強度和鹽度對冬青葉馬尾藻生長和光合生理的影響

徐孟杰，李青楠，姚丹丹，鄒瀟瀟，黃惠琴，鮑時翔，宮春光，朱 軍，穆 丹

1.河北農業大學 海洋學院，河北 秦皇島 066003

2.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所/海南熱帶農業資源研究院/海南省熱帶農業資源保護與利用重點實驗室，海南?？?571101

3.佳木斯大學 生物與農業學院，黑龍江 佳木斯 154007

4.中國熱帶農業科學院海南省海洋生物功能性成分研究與利用重點實驗室，海南 ?？?571101

海藻場是一種以大型海藻群落為主的典型近岸海洋生態系統，其在維持海洋生物多樣性、降低海區富營養化、提高海洋碳匯等方面發揮著重要作用[1-2]。以褐藻門的馬尾藻 (Sargassum)、巨藻(Macrocystis) 等作為支撐的海藻場分布最為廣泛[3-4]。但隨著全球氣候變化、近海養殖和過度采收等原因，天然海藻場退化形勢嚴峻[5-7]。為促進海藻場的保育和恢復，日本、韓國等多個國家開展了海藻場內大型海藻多樣性及其生長和繁育特性等的研究[8-9]。

馬尾藻是海南島近岸海藻場的重要建群種，其中冬青葉馬尾藻 (S.ilicifolium) 作為在海南分布最為廣泛且生物量最大的馬尾藻之一[10-11]，在維持海藻場生態作用方面發揮著重要作用。在馬尾藻屬中，已有部分與藻場構建相關物種的生長特性、光合生理、營養需求等的研究報道。例如，欒青等[12]開展了不同溫度和光照條件對銅藻 (S.horneri) 的生長、光合色素和營養組分影響的研究，發現不同培養條件對生長率、色素積累和褐藻多酚等有顯著影響；張建偉等[13]報道了環境因子對瓦氏馬尾藻(S.vachellianum) 生長及光合作用的影響，獲得了其適宜生長的環境條件；韋瑩瑩等[14]研究了溫度對各個生長時期鼠尾藻 (S.thunbergii) 的生長特性、葉綠素含量、表觀光合速率和呼吸速率等生理指標的影響，結果表明不同生長時期的鼠尾藻具有不同的溫度適應性。然而，目前有關冬青葉馬尾藻基礎生物學特性的研究報道很少，僅見少量關于環境因子對其幼苗發育和繁育特性等方面的報道[15-16]。本文以冬青葉馬尾藻為研究對象，探究了溫度、光照強度和鹽度對其生長和光合生理的影響，為冬青葉馬尾藻的資源保護和海藻場修復提供了基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從海南省青葛港海藻場 (110°68'E—110°70'E、19°32'N—19°34'N) 采集藻體健康的冬青葉馬尾藻，將其及時帶回實驗室，置于滅菌海水中浸泡數小時，用毛刷去除附著在藻體上的多毛類、甲殼類等動物。在溫度 (20±1) ℃ 、光照強度40 μmol·m-2·s-1、鹽度32‰和光周期12L∶12D 的條件下暫養7 d，使冬青葉馬尾藻的生長狀態趨于同步化。然后用手術刀切除藻體的假根，選取長度約10 cm 的幼苗為試驗材料。

1.2 試驗方法

根據前期預試驗結果，設置溫度、光照和鹽度試驗，具體如下：

1) 溫度試驗：設置6 個溫度處理梯度 (10、14、18、22、26 和30 ℃)，每個處理3 個重復；其他培養條件為光照強度40 μmol·m-2·s-1，光周期12L∶12D，鹽度32‰。

2) 光照試驗：設置6 個光照強度梯度 (10、20、40、80，120，140 和200 μmol·m-2·s-1，每個處理3 個重復；其他培養條件為溫度22 ℃，光照周期12L∶12D，鹽度32‰。

3) 鹽度試驗：設置6 個鹽度梯度 (16‰、20‰、24‰、28‰、32‰、36‰ 和40‰)，每個處理3 個重復；其他培養條件為：溫度22 ℃，光照強度40 μmol·m-2·s-1，光周期12L∶12D。

每3 d 更換1 次海水，測定特定生長率 (Specific growth rate,SGR) 和光合色素含量等指標，試驗周期為25 d。

1.3 測定方法

1.3.1 特定生長率

每5 d 稱量一次鮮質量，計算SGR 以反映藻體鮮質量的變化。

式中：RSGR表示特定生長率 (%·d-1)；W0表示初始藻體的鮮質量 (g)；Wt表示最終藻體的鮮質量(g)；t0表示初始天數 (d)；t表示試驗時間 (d)。

1.3.2 最大光量子產量

用MINI-PAM 測定，樣品暗處理適應20 min后，首先提供0.3 μmol·m-2·s-1的測量光，測得最小熒光值 (F0) ，然后提供0.8 s 約4 000 μmol·m-2·s-1的飽和脈沖，測得最大熒光值 (Fm) 。最大光量子產量 (Fv/Fm) 的計算公式[17]為：

式中：QFv/Fm表示最大光量子產量；F0表示最小熒光值；Fm表示最大熒光值。

1.3.3 光合色素含量測定

取0.05 g 藻體剪碎，用2 mL 80% (體積分數)的丙酮溶液避光浸泡24 h，然后定容到10 mL。用756 PC 型紫外可見光分光光度計測定溶液在664、647、639 、630、510 和480 nm 處的吸光度值。

葉綠素a、葉綠素c和類胡蘿卜素的質量分數計算公式為：

式中：WChl-a、WChl-c和Wcar分別表示葉綠素a、葉綠素c和胡蘿卜素的質量分數 (mg·g-1)；A645表示645 nm 處的吸光度值，其他A值類同；V表示提取液體積 (mL) ；N表示比色前稀釋倍數；M代表所取藻體質量 (g) 。

1.4 數據分析

使用Excel 2007 軟件進行數據處理和繪圖，用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析，設顯著性水平為P<0.05。數據以“平均值±標準差 ()”表示。

2 結果

2.1 溫度、鹽度、光照對冬青葉馬尾藻生長的影響

由圖1 所示，隨著培養時間的延長，14～30 ℃下藻體鮮質量逐漸增加，其中22 ℃和26 ℃組的藻體生長最快，而30 ℃組培養15 d 后的藻體鮮質量增長緩慢，藻體開始軟化。10 ℃組藻體的鮮質量呈下降趨勢，培養15 d 后其葉片嚴重腐爛，主莖也開始變軟、斷裂。

圖1 不同溫度條件下冬青葉馬尾藻的鮮質量曲線Fig.1 Curves of fresh mass of S.ilicifolium at different temperatures

不同鹽度下藻體的鮮質量隨培養時間的延長而增加，其中20‰ 和24‰ 組藻體培養的前15 d 生長速度較快，15 d 后生長速度開始減慢 (圖2) 。鹽度為16‰ 時，藻體葉片硬化，易脫落；鹽度為36‰時，藻體葉片顏色變淡、變硬。

圖2 不同鹽度條件下冬青葉馬尾藻的鮮質量曲線Fig.2 Curves of fresh mass of S.ilicifolium at different salinities

不同光照強度下冬青葉馬尾藻鮮質量與培養時間呈正相關 (圖3) 。而在140 μmol·m-2·s-1下藻體培養15 d 后，生長速度減慢，葉片呈淡黃色；在200 μmol·m-2·s-1下，藻體幾乎停止生長，沒有新的側枝；在10 μmol·m-2·s-1下，藻體培養20 d后，出現掉葉現象，低光照情況下不利于冬青葉馬尾藻的生長。

圖3 不同光照條件下冬青葉馬尾藻的鮮質量曲線Fig.3 Curves of fresh mass of S.ilicifolium at different light conditions

在不同溫度梯度 (10、14、18、22、26 和30 ℃) 培養25 d 后，冬青葉馬尾藻的SGR 變化見圖4-a。隨著溫度的升高，其SGR 呈先升高后降低的趨勢。在6 個溫度梯度組中，SGR 在 22 ℃組達到最高 (4.60 %·d-1)，其次為 18 ℃組 (3.92 %·d-1)。藻體在 10 ℃組出現負增長 (-2.28 %·d-1)，并出現腐爛和變軟自溶現象，其SGR 與其他組差異顯著(P<0.05)。

圖4 不同溫度、鹽度和光照條件下培養 25 d 后冬青葉馬尾藻的特定生長率注：不同小寫字母表示處理間差異顯著 (P<0.05)；后圖同此。Fig.4 Specific growth rate of S.ilicifolium after 25-day cultivation at different temperatures,salinities and light intensitiesNote: Different lowercase letters represent significant differences between different treatments (P<0.05).The same case in the following figures.

在不同鹽度梯度 (16‰、20‰、24‰、28‰、32‰、36‰和40‰) 下培養25 d 后，冬青葉馬尾藻的SGR 變化見圖4-b。隨著鹽度的增加，SGR 呈先升高后降低的趨勢，鹽度為32‰時藻體生長最快，SGR 達到最高值[(2.012 ± 0.088)%·d-1]，與其他組差異顯著(P<0.05)。鹽度為40‰ 時，在培養后期藻體出現變軟和葉片腐爛的現象，SGR 降至(1.080 ± 0.082) %·d-1，與其他組差異顯著(P<0.05)。

在不同光照強度梯度 (10、20、40、80、120、140 和200 μmol·m-2·s-1) 培養25 d 后，冬青葉馬尾藻的SGR 變化見圖4-c。隨著光照強度的增大，SGR 呈現先升后降的趨勢。在光照強度為40 μmol·m-2·s-1時藻體生長最快，SGR 為 (5.800 ±0.895) %·d-1，且與其他組差異顯著 (P<0.05)。當光照強度從40 μmol·(m2·s)-1逐漸增加到200 μmol·(m2·s)-1時，SGR 呈下降趨勢，由 (5.800±0.895) %·d-1降至 (2.520±0.480) %·d-1。

2.2 溫度、鹽度、光照對冬青葉馬尾藻光合色素含量的影響

不同溫度下，冬青葉馬尾藻光合色素質量分數變化見圖5-a。其中，葉綠素a和葉綠素c表現出相似的變化趨勢：當培養溫度介于10～26 ℃時，兩種光合色素隨溫度的升高而增加，均在26 ℃時達到最高值，分別為 (0.347±0.033) 和 (0.192±0.038) mg·g-1，且與10～22 ℃組的差異顯著 (P<0.05) 。另外，類胡蘿卜素質量分數雖然也呈現隨溫度升高逐漸增加的趨勢，但各組之間差異不顯著(P>0.05) 。

圖5 不同溫度、鹽度和光照強度條件下培養 25 d 后冬青葉馬尾藻光合色素質量分數變化Fig.5 Changes of photosynthetic pigment mass fraction of S.ilicifolium after 25-day cultivation at different temperatures,salinities and light intensities

不同鹽度下，冬青葉馬尾藻光合色素的質量分數變化見圖5-b。隨著鹽度的增加，葉綠素a和葉綠素c均呈先升后降的趨勢，最高值均出現在鹽度36‰組，32‰組次之，且顯著高于其他組(P<0.05) 。當鹽度介于16‰～28‰時，各組之間3 種光合色素質量分數差異均不顯著 (P>0.05) 。

不同光照強度下，冬青葉馬尾藻光合色素質量分數變化見圖5-c。隨著光照強度的增加，葉綠素a和葉綠素c呈先升后降的趨勢，最高值均出現在光照強度40 μmol·m-2·s-1組，80 μmol·m-2·s-1組次之，且這兩組顯著高于其他組 (P<0.05) 。各組之間的類胡蘿卜素質量分數差異均不顯著 (P>0.05)。

2.3 溫度、鹽度、光照對冬青葉馬尾藻Fv/Fm 的影響

溫度對冬青葉馬尾藻Fv/Fm的影響如圖6-a 所示。隨著溫度的升高，Fv/Fm呈先升后降的趨勢，10 ℃時Fv/Fm最低 (0.518±0.061)，22 ℃時最高(0.757±0.024)，但各組之間差異不顯著 (P>0.05)。

圖6 不同溫度、鹽度和光照強度培養 25 d 后冬青葉馬尾藻的最大光量子產量 (Fv/Fm)Fig.6 Maximum quantum yield (Fv/Fm) of S.ilicifolium after 25-day cultivation at different temperatures,salinities and light intensities

鹽度對冬青葉馬尾藻Fv/Fm的影響較小 (圖6-b)，隨著鹽度的升高，其Fv/Fm呈先升后降的趨勢，但各組之間差異不顯著 (P>0.05)。

光照強度對冬青葉馬尾藻Fv/Fm的影響如圖6-c所示。光照強度介于10～120 μmol·m-2·s-1時，冬青葉馬尾藻的Fv/Fm差異不顯著 (P>0.05)，最高值出現在40 μmol·m-2·s-1(0.723±0.057)；當光照強度高于140 μmol·m-2·s-1時，Fv/Fm開始顯著下降(P<0.05)。

3 討論

3.1 溫度對冬青葉馬尾藻生長和光合作用的影響

海水溫度通過直接影響海藻的光合作用和呼吸作用間接影響藻體的生長和繁殖過程[18]。王永川等[19]發現，潮間帶藻類的分布長期受到地理、化學、生物和物理因素的影響。對于大型底棲藻類，許多學者認為溫度是最重要的影響因素之一。在本試驗條件下，冬青葉馬尾藻生長的適宜溫度為18～26 ℃，與海南島另一種常見馬尾藻——匍枝馬尾藻 (S.polycystum) 的適宜生長溫度 (15～25 ℃)和分布范圍相近[20]；因此，類似的溫度適應性，可能是它們分布范圍相似的主要原因。本研究發現在22 和26 ℃培養條件下，冬青葉馬尾藻生長最快，葉腋處生出分枝，藻體顏色鮮亮且葉綠素a、葉綠素c和類胡蘿卜素的含量較高；當溫度超過22 ℃時3 種光合色素含量均呈下降趨勢，對瓦氏馬尾藻[6]和孔石莼 (Ulvaperutsa)[21]的研究也得到類似結果，這可能與過高的溫度不利于藻體的葉綠素積累有關。在10 ℃條件下，冬青葉馬尾藻因藻體腐爛和變軟自溶等現象而出現負增長，這與楊彬等[22]和趙素芬等[23]的研究結果一致，說明10 ℃對冬青葉馬尾藻的生長造成了低溫脅迫；在高溫條件下 (30 ℃) 藻體鮮質量增長緩慢，藻體變軟且光合能力下降，這與銅藻受高溫脅迫的表現類似[24]，暗示溫度過高對藻體的脅迫可能對光系統II (PSII)造成了不可逆損傷。雖然低溫和高溫脅迫均能對冬青葉馬尾藻的生長狀態和生長速率產生影響，但是通過比較不同溫度培養條件下該藻光合色素及最大光量子產量等生理指標的變化，筆者認為冬青葉馬尾藻對低溫脅迫更加敏感，這與其主要生長在熱帶海域的生態分布特征相符；因而其可能對低溫的適應能力有限，相似的結論近期在對熱帶海草的低溫耐受實驗[25]中得到了印證。

3.2 鹽度對冬青葉馬尾藻生長和光合作用的影響

大型藻類生長與鹽度變化密切相關，鹽度可直接影響藻類的滲透壓、信息傳導等[26]。關于鹽度脅迫對其他大型藻類的生長及生理生化特性的影響已有報道[27]。本研究表明，隨著鹽度的增加，冬青葉馬尾藻的SGR 和光合色素含量均呈先升高后下降的趨勢，最大值出現在鹽度32‰ 組；當鹽度低于16‰ 時，藻體葉片硬化且易脫落；鹽度高于36‰ 時，藻體葉片出現褪色、變軟和腐爛等現象，這可能與低鹽或高鹽脅迫導致其細胞膜結構損傷和產生大量活性氧有關。本研究還顯示，隨著鹽度的增加，冬青葉馬尾藻的Fv/Fm未發生顯著性變化 (P>0.05) ，這與張玉榮等[24]報道的高鹽和低鹽脅迫不會導致銅藻幼苗的Fv/Fm發生顯著變化的結果相似，該現象可能與馬尾藻屬物種具有較強的離子傳遞系統有關[28]。隨著鹽度的上升，葉綠素a含量呈明顯的先升后降趨勢，表明過高的鹽度會阻斷藻體光合色素的合成，從而影響其光合作用過程；而各個試驗組的類胡蘿卜素含量均無規律性的變化，這與宋新丹等[29]的研究結果相似。不同種類的海藻具有不同的鹽度適應范圍，本研究表明冬青葉馬尾藻的適宜鹽度為16‰～36‰，而海黍子(S.muticum) 和懸疣馬尾藻 (S.filipendula) 的適宜鹽度分別為20‰～35‰[30]和15‰～35‰[31]。此外，也有研究顯示，同種海藻在不同地區的鹽度耐受范圍不同[32]，因此，海藻的鹽度適宜范圍可能與其生活環境密切相關。

3.3 光照強度對冬青葉馬尾藻生長和光合作用的影響

光照對于大型海藻的生長發育至關重要。本研究顯示冬青葉馬尾藻的適宜光照強度為2 0～120 μmol·m-2·s-1，最適宜光照強度為40 μmol·m-2·s-1，過低或過高的光照強度均不利于其生長。低光照強度組 (10 μmol·m-2·s-1) 藻體出現“掉葉”現象，高光照強度組 (140 和200 μmol·m-2·s-1) 藻體生長開始放緩，葉綠素a含量顯著降低，藻體葉片呈淡黃色，即出現“失綠”現象；當光照強度達到 200 μmol·m-2·s-1時，藻體出現變軟、腐爛等現象，幾乎停止生長。楊彬等[22]對莫氏馬尾藻的研究也得出相似結果，說明當光照強度高于馬尾藻的光飽和點時，可能會破壞光合色素合成，從而抑制藻類生長。

本研究結果顯示，在較低的光照強度下，冬青葉馬尾藻的最大光量子產量 (Fv/Fm) 隨光照強度的增加而升高，但當光照強度超過40 μmol·m-2·s-1時，其Fv/Fm呈明顯下降的趨勢，表明高光照強度對其光化學活性有明顯的抑制作用，這與逄少軍等[33]對羊棲菜 (Hizikiafusifarme) 的研究結果一致。但是，也有研究發現一些馬尾藻物種對高光強具有很好的適應性，例如海黍子 (S.muticum) 在200 μmol·m-2·s-1依然可以保持較高的特定生長率[34]，而銅藻的最適光強可高達300 μmol·m-2·s-1[12]，說明不同馬尾藻對光照強度的適應范圍可能存在較大差異。

綜上所述，溫度、鹽度和光照強度對冬青葉馬尾藻的生長和光合生理具有重要影響。冬青葉馬尾藻的適宜溫度為18～26 ℃，作為一種在熱帶地區廣泛分布的大型海藻，冬青葉馬尾藻對低溫脅迫更為敏感，這也是限制其分布的主要原因之一。冬青葉馬尾藻的鹽度適宜范圍為16‰～36‰，這與其生長環境的海水鹽度密切相關。冬青葉馬尾藻的光照強度適宜范圍為20～120 μmol·m-2·s-1，過低的光照強度會導致藻體出現“掉葉”現象，過高則會破壞光合色素合成，藻體出現“失綠”或變軟、腐爛等現象。因此，在對以冬青葉馬尾藻為主的海藻場進行保育和恢復的過程中，應當充分考慮溫度、鹽度和光照強度對其生長和空間分布的影響，以促進海藻場的有效保護與修復。