兩種不同方法制作犬心房顫動模型的安全性分析

麥麥提阿卜杜拉·麥麥提敏 楊徐 張玲 麥麥提艾力·麥麥提敏 曹桂秋 李耀東 孫華鑫 馬嵋 湯寶鵬

心房顫動(簡稱房顫)作為一種臨床上最常見的快速性心律失常,發病率隨著年齡的增加逐漸升高。一項基于全球人口研究的系統回顧性研究顯示,1997 年觀察到的每百萬人中新增房顫病例309例,2007 年觀察到的每百萬人中新增房顫病例為345 例,2017 年報告的每百萬人中新增房顫病例超過400 例,有明顯的增加趨勢[1],預測未來幾十年中房顫發病率會升高2～3 倍。目前治療房顫的方法有電轉復、藥物治療、射頻消融術、外科手術等,但都具有一定的局限性。通過對房顫動物模型的研究,可以加深對房顫病理生理的認識,從而有助于改進房顫的治療[2-4]。目前可用于制作房顫模型的動物有犬、兔、羊、馬、豬、鼠等,制作方法各不相同,安全性及有效性也各不相同[5-8]。探索出制作房顫動物模型的有效且安全的方法,不僅能減少動物的痛苦及成本,更有助于研究房顫形成的相關機制。本研究通過比較開胸植入電極和X 線透視下頸靜脈植入電極的方法制作心房快速刺激模型的安全性,為制作房顫動物模型提供數據和理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

12 只健康雄性比格犬,由新疆醫科大學動物實驗中心提供[普通級,許可證號:SYXK(新)2018-0002],體重平均(13±2)kg,犬齡均在1～2 歲。所有犬造模前均通過了由獸醫進行的精神狀況、軀體健康狀況評估。課題實驗設計、實驗方案及具體實施步驟已經新疆醫科大學第一附屬醫院動物倫理委員會審核批準(審批號:K202111-07)。實驗實施推進過程嚴格按照美國國立研究機構設立的實驗動物使用和護理指南進行。

1.2 實驗分組及處理方法

根據起搏器電極植入途徑,將全部犬只分為開胸組和介入組,每組6 只。術前12 h 禁飲食,麻醉前觀察精神、步態、聲音等狀態并稱重。手術當日肌注麻醉劑舒泰+速眠新注射液(0.05 mL/kg,1 ∶1)混合物進行基礎麻醉,通過觀察睫毛反射和舌頭牽拉阻力評估麻醉是否生效。麻醉成功后,操作區域剃毛。選擇前肢頭靜脈植入靜脈留置針開通靜脈通道,然后以3%戊巴比妥鈉溶液(20 mg/kg)靜脈維持麻醉,間斷輸入0.9%氯化鈉注射液、5%葡萄糖注射液(補充能量),根據睫毛反射動態追加3%戊巴比妥鈉注射液(10 mg/kg)維持麻醉。將電熱毯通電,使整個實驗過程中體溫穩定在37.5～38 ℃。進行氣管插管,將指夾式血氧探頭夾在犬舌上用于監測血氧飽和度,必要時采用呼吸機輔助呼吸。選擇股動脈和股靜脈進行穿刺并留置股動靜脈鞘。

在整個實驗過程中,使用Lead-7000 型多導電生理記錄儀(成都錦江公司產品)連續監測心電圖標準肢體導聯、腔內心電圖和動脈血壓。留置導尿管并連接尿袋,檢測尿量。

(1) 開胸組:將犬取右側臥位置于大動物手術臺,用碘酒、酒精消毒前胸及左側頸胸部。以左腋前線4—5 肋間隙為手術入口,繃緊皮膚,逐層切開皮膚、皮下組織,將開胸器調至最小化后置于手術切口中,撥開肺組織,撐開胸廓,充分顯露手術野,小心打開心包,充分顯露左心耳,采用荷包縫合方式將起搏電極縫合固定于左心耳底部,保證起搏電極與心耳部組織充分接觸,兩電極縫合點間距0.5 mm,將其余電極分別置于右側前胸及左側頸肩部。用多導電生理記錄儀描記體表基礎狀態心電圖,采用磁鐵開啟起搏器[購自恩識醫療科技(上海)有限公司,自帶4 根電極],觀察起搏器工作情況。如果起搏器工作狀態良好,則關閉起搏器。檢查心包、心臟表面及胸腔無出血后,在胸部皮下構建囊袋,將起搏器埋藏于已建立好的皮下囊袋內。術畢仔細觀察有無局部出血,關閉胸腔,抽取胸腔內積液、積氣,逐層縫合肌肉、皮下組織及皮膚,局部切口消毒,用無菌紗布包扎。見圖1A。

圖1 開胸組、介入組植入起搏器過程

(2) 介入組:將犬仰臥位置于大動物手術臺上,用碘酒、酒精消毒頸胸部皮膚,指腹確認頸靜脈位置,繃緊皮膚,逐層切開皮膚、皮下組織,分離頸靜脈,用縫合線結扎遠心端,用手術刀切開頸外靜脈,從切口插入起搏器電極(購自美敦力或圣猶達公司的心房電極),確認電極在血管真腔后,在X 線透視下,將起搏器電極經頸外靜脈送入右心房并固定,經測試確定電極阻抗、感知、起搏功能良好后,將起搏器電極與動物專用起搏器(購自哈爾濱理工大學)連接,用Lead-7000 多導電生理記錄儀描記體表基礎狀態心電圖,采用磁鐵開啟起搏器,觀察起搏器工作情況。如果起搏器工作狀態良好,則關閉起搏器。在頸部皮下構建囊袋,將起搏器埋藏于已建立好的皮下囊袋內。術畢仔細觀察有無局部出血,逐層縫合肌肉、皮下組織及皮膚,局部切口消毒,用無菌紗布包扎。見圖1B-D。

兩組術后均給予陸醒寧注射液催醒。待動物恢復自主呼吸后再拔出氣管插管,送回觀察室繼續觀察;待其意識完全恢復后,送返動物房繼續單籠飼養。術后在犬清醒狀態下使用鹽酸嗎啡注射液止痛,20 mg,8 h 一次,皮下注射,共2 次;頭孢唑啉鈉劑針1.5 g,一日兩次,勻速靜脈滴注,連續使用3 d 預防感染;牛奶、牛肉火腿腸、雞蛋等營養支持1 周;每日觀察精神、飲食、體溫及活動情況;常規換藥、拆線。待一般情況穩定后開啟起搏器予以連續起搏6 周,起搏頻率400 次/min。每日采用Powerleb體表監測儀監測體表心電圖,并保證起搏狀態為持續性起搏。

1.3 手術安全性評估

術后通過觀察傷口、監測體溫、檢測降鈣素原、檢測NT-proBNP 等,評估是否有皮下感染、囊袋感染、血性感染、感染性心內膜炎、心力衰竭(簡稱心衰)、休克、死亡等。

1.4 腔內電生理檢測

經股靜脈將10 級電極送至右心房,尾端連接Lead-7000 多導電生理儀。當腔內電生理圖呈現出大A 小V 波形,表示電極置入右心房成功。隨后需進行電極位置測試,當給予心房電極以1～2 V 電壓進行起搏時,均可見信號下傳,表示放置電極位置良好。關閉起搏器后,心電記錄中若心房波出現無序活動的“f”波,且持續5 s 以上,則認為房顫誘發成功。如房顫自行出現提示自發房顫,則記錄房顫持續時間;如果房顫發作后持續出現,不能自行終止,持續時間超過5 min,則按照5 min 進行計算,待其自行恢復竇性心律后再進行下一次的刺激誘發。如無自發性房顫,則采用Burst 刺激進行誘發:給予60 ms 的S1S1程序刺激,設定刺激電壓為8 V,連續刺激10 s。分別在基線狀態和6 周后檢測是否有房顫發作。

1.5 心臟超聲檢查

在造模前及造模結束后進行超聲心動圖檢查。檢查均由超聲醫學科的高年資醫師專人操作。檢測指標包括左心房內徑、左心室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic diameter,LVESD)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、右心房內徑、右心室內徑和射血分數。在相同的時間節點測量每個變量,重復3 次取平均值。

1.6 統計學分析

采用SPSS 22.0 進行統計分析,對符合正態分布的計量數據用表示,均數比較行t檢驗;計數資料用例數(%)表示,率的比較用χ2檢驗,以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

12 只犬中,開胸組有1 只術后第3 天死亡,死因考慮是感染性休克;介入組有1 只術后第7 天猝死,X 線檢查提示電極脫落至心室,考慮死因為電極脫位致惡性心律失常而發生猝死;其余10 只犬完成整個實驗,均能誘發房顫(圖2)。

圖2 兩組常規體表Ⅱ導聯心電圖和心腔內電生理圖顯示成功誘發房顫

2.1 超聲檢查結果

兩組起搏6 周后的心臟結構都有一定程度變化,兩組左心房內徑、LVESD、LVEDD、右心房內徑、右心室內徑均較起搏前明顯增大(P均＜0.05),但兩組射血分數起搏前后均無明顯變化。見表1-2。

表1 開胸組植入起搏器前后心臟超聲指標的變化 n=5,

表1 開胸組植入起搏器前后心臟超聲指標的變化 n=5,

表2 介入組X 線透視下頸外靜脈途徑植入起搏器前后心臟超聲指標的變化 n=5,

表2 介入組X 線透視下頸外靜脈途徑植入起搏器前后心臟超聲指標的變化 n=5,

2.2 兩組心衰發生率比較

開胸組3 只犬分別在快速心房起搏后3、12 和20 d 出現喘憋,雙肺可聞及濕啰音和散在哮鳴音,實驗室檢查提示降鈣素原正常,NT-proBNP 明顯升高,分別為8 973、9 743、9 224 pg/mL,考慮為急性左心衰竭。停止起搏后,給予利尿、甲基強的松龍、氨茶堿治療。3 d 后癥狀均明顯好轉,無喘氣,雙肺未聞及濕啰音和哮鳴音,復查NT-proBNP 恢復正常。

介入組1 只犬快速心房起搏后12 d 出現喘憋,雙肺可聞及濕啰音和散在哮鳴音,實驗室檢查提示降鈣素原正常,NT-proBNP 增高至7 483 pg/mL,考慮為急性左心衰竭。停止起搏后,給予利尿、甲基強的松龍、氨茶堿治療4 d,癥狀明顯好轉,無喘氣,雙肺未聞及濕啰音和哮鳴音,復查NT-proBNP 恢復正常。兩組心衰發生率比較,差異有統計學意義(χ2=18,P＜0.05)。

2.3 兩組感染發生率比較

開胸組4 只犬出現囊袋血腫,均出現在術后1 周內,分別為術后1、2、2、3 d 。股靜脈抽取血樣本,檢測降鈣素原濃度,均在正常范圍,給予每日2 次換藥、抽吸、靜脈滴注抗生素等處理后,2 只恢復正常,2 只進展為囊袋感染。發生囊袋感染的2 只犬囊袋有波動感,傷口可見膿性分泌物,繼續給予抗生素靜脈滴注,每12 h 1 次,同時在囊袋內注射抗生素。5 d 后2 只犬囊袋未見明顯血腫,傷口愈合尚可,但其中1 只出現發熱,監測降鈣素原明顯升高(4.15 ng/mL),考慮全身性感染。對這只發生全身性感染的犬繼續給予抗生素靜脈滴注,每12 h 1 次,換藥每日2 次。3 d 后無明顯發熱,傷口愈合好。

介入組2 只犬出現囊袋血腫,均出現在術后第2 天,從股靜脈抽取血樣本檢測降鈣素原濃度,結果顯示均正常。給予每天換藥2 次、抽吸等處理。經處理后,1 只恢復正常;1 只進展為囊袋感染,囊袋有波動感,傷口可見膿性分泌物,降鈣素原正常,繼續給予抗生素靜脈滴注,每12 h 1 次,同時在囊袋內注射抗生素,2 d 后囊袋裂開,可見起搏器及電極,降鈣素原濃度升高至6.85 ng/mL。對發生囊袋感染的犬通過全麻進行傷口切開清創術,并重新縫合,繼續給予每日2 次換藥、抽吸、靜脈滴注抗生素等處理,未再出現血腫、囊袋感染、全身感染,傷口逐漸愈合。兩組感染發生率比較,差異有統計學意義(χ2=18,P＜0.05)。

3 討論

房顫是最常見的臨床心律失常,根據發作時間分為陣發性、持續性和永久性房顫[9-12]。對房顫動物模型的深入研究,可以加深對房顫病理生理的認識,從而有助于改進房顫的治療。目前常用的房顫動物模型有:早期的在犬右心耳尖注射少量烏頭堿誘發房顫以及后期的采用刺激雙側頸部迷走神經干和乙酰膽堿灌流的方法誘發房顫;MORILLO 等[13]在犬右心耳放置起搏電極,以400 次/min 的頻率快速起搏犬心房;WIJFFELS等[14]在山羊心房外膜埋置電極片,以50 Hz 的頻率刺激左心房1 s,誘發出短陣房顫;在肺靜脈根部含有自主神經節的脂肪墊分別注射擬副交感神經的乙酰膽堿和碳酰膽堿誘發房顫[15];無菌性心包炎模型;心衰性房顫模型;低通氣動物模型;衰老和轉基因動物模型等[16]。

快速心房起搏模型制作簡單,容易誘發心房肌電重構。既往有研究認為,右心房高頻刺激為心房撲動,左心房高頻刺激多為房顫;但也有研究得出相反的結論,即右心房高頻刺激為房顫,左心房高頻刺激多為心房撲動。本研究中開胸組為左心房起搏,介入組為右心房起搏,兩組房顫誘發率無明顯差異,均能誘發房顫,我們認為房顫時兩心房可能沒有固定的激動模式,這與KONINGS 等[17]的研究結果一致。在本實驗的12 只犬中,開胸組中1 只犬術后第3 天死亡。此犬死亡前一天傷口充血,有淡黃色分泌物,皮溫較高,給予繼續靜脈滴注抗生素、換藥處理;發現此犬死亡時距上次觀察8 h,其四肢已僵硬,皮膚冰涼,傷口可見分泌物,考慮死亡時間較長,沒有進行尸檢,推測死因可能是感染性休克。介入組中1 只犬術后7 d 猝死,發現死亡時已距上次觀察2 h,X 線檢查提示電極脫落至右心室,考慮電極脫位導致右心室快速起搏,進一步誘發心室顫動等惡性心律失常,最終導致猝死。而電極脫位可能因為電極植入時間較短,電極頭端的纖維包繞尚未形成,電極不牢固,活動時發生電極脫位。

本研究中,心臟B 超提示,兩組均有心臟結構改變,這種結構的變化顯然有利于折返環的形成,導致房顫的發生和維持。兩組均有急性心衰發生,其中開胸組3 只,介入組1 只,給予對癥治療后均糾正;開胸組心衰發生率明顯高于介入組。手術應激、心房快速起搏、感染均會引起心衰,開胸組手術創傷較大、感染風險也大,可能更容易發生心衰。心衰和房顫會相互作用,心衰會誘發房顫,房顫也會誘發心衰,兩組的心衰發生率雖然有差異,但房顫誘發率無差異,兩組均能誘發房顫,而且給予對癥治療后心衰很快得到糾正,因此推測本研究中心衰的出現對房顫的誘發貢獻不大,但是增加了術后感染、猝死等風險。開胸組與介入組中均發生了感染,但開胸組感染發生率也明顯高于介入組。雖然整個手術嚴格按無菌原則進行,術后予以常規消毒換藥、營養支持,術中也盡量選擇不易舔或抓的部位制作囊袋,但術后仍不能完全避免犬舔或抓傷口,不能完全保證傷口一直保持無菌,導致兩組感染率均較高。開胸組可能是由于手術傷口較大,感染率明顯高于介入組。為了避免術后犬舔或抓傷口而使感染的發生率升高,實驗過程中使用了馬甲和犬脖套,但有些犬佩戴馬甲和犬脖套后變得更加煩躁,出現亂跳、以頭撞籠子邊緣的情況,總體效果不明顯;發現傷口有分泌物時,及時進行細菌培養,并選擇敏感抗生素,同時采用延長抗生素使用療程、增加換藥頻次等措施,可能有助于降低感染發生率。

總之,開胸植入電極與X 線透視下頸外靜脈植入電極,均能制作房顫模型,均能引起心臟結構的改變。開胸組開胸左心耳固定電極,電極植入更為穩定,但感染率、心衰發生率均高于介入組。介入組手術傷口小,但是需要使用數字減影血管造影機、鉛衣等設備,術中需要在X 線透視下操作,對實驗團隊的資質、操作熟練程度、搶救設備等要求較高。從單純考慮降低感染率和心衰發生率的角度而言,X 線透視下經頸靜脈植入電極的方法優于開胸植入電極制作房顫犬模型。但是在房顫研究中,還要考慮到房顫的電生理特征,因此在電生理特征的變化上是否有差異,需要進一步研究。