基于TRM70303發酵產物硫藤黃菌素的乳油制備

宋迎,何沐昕,張阿郎,劉蕊琪,王麗君,夏占峰

(塔里木大學生命科學與技術學院/新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地,新疆 阿拉爾 843300)

2022年新疆棉花種植面積約2.496 9×106hm2,產量5.391×106t,占全國的90.2%[1]。棉花已成為新疆農業經濟的支柱,而棉花黃萎病自傳入我國以來,發病率日益增加,每年造成棉區經濟損失1.5×109～2.0×109元。棉花黃萎病是危害棉花生產的主要病害之一,經調查,新茬地塊發病率較低,重茬地塊發病率較高;長勢強的棉田發病率較低,長勢弱的棉田發病率較高。根據歷年棉田生產經驗可知,黃萎病對棉花的產量和品質影響很大,一般減產10%～30%,發病率嚴重的地塊減產可達 80%以上,甚至絕收[2]。引起棉花黃萎病的大麗輪枝菌是一種土壤傳播的病原體,抵抗惡劣環境的能力很強,可以存活 10 a以上,因此,黃萎病歷來被視為棉花的“毒瘤”。對這類病害的可持續控制是植物保護領域的世界性難題,也是我國農業領域的重大戰略需求。

隨著國家“鄉村振興”戰略的落地生根,國家對農業的投入力度增大,《“十四五”全國種植業發展規劃》中提到,建設高品質棉花種植帶,實施化肥農藥綠色增效行動[3],推廣高效低風險生物農藥[4],集成推廣農業防治、生物防治等綠色防控模式,構建綠色種植制度[5]。目前常規選育出的棉花品種對棉花黃萎病的控制效果尚不理想,且尚無殺菌劑可高效防治棉花黃萎病。因此利用拮抗微生物及其產生的活性產物來抑制或消滅有害生物是生物防治的主要發展方向,具有對環境友好、選擇性強、不易產生抗藥性等優勢,發展前景廣闊。

二硫吡咯酮類(DTPs)化合物是一類結構獨特的天然抗生素,具有雜環戊二烯(4H-1,2-二硫-4,3-b-吡咯-5-酮)母核。硫藤黃菌素是DTPs 化合物最著名的代表,表現出廣譜的抗生素活性、強大的抗血管生成作用和抗癌細胞活性[6]。二硫吡咯酮類抗生素對多種微生物,包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌以及寄生蟲等都有很好的殺、滅活性,但由于其因溶解性較差,硫藤黃菌素及其衍生物目前還沒有作為農用和醫用抗生素商業使用。

本研究以塔里木盆地放線菌Streptomycessp.TRM70303分離的活性次生代謝產物硫藤黃菌素為研究原料,篩選溶劑與乳化劑的組合優化制備乳油,以期研制出一種對棉花黃萎病具有抑菌活性的生物源農藥[7]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥劑與試劑

原藥:硫藤黃菌素,從放線菌Streptomycessp.TRM70303發酵產物中分離提取。

溶劑:二甲基亞砜(DMSO)和無水乙醇(EA)均為分析純,天津鑫宇精細化工有限公司;甲醇(MT)、甲苯(TL)及二甲苯(XY)均為分析純,天津北聯精細化學品開發有限公司。

乳化劑:農乳500#、農乳600#、1601、1602、OP-21、BY130、El-20(邢臺鑫藍星科技有限公司);吐溫20、吐溫40、吐溫80(天津市致遠化學試劑有限公司)。

大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeACCC 36211),由新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地提供。

1.1.2 培養基

PDA培養基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂16 g,蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 硫藤黃菌素抑制大麗輪枝菌活性測定

將硫藤黃菌素設定5個質量濃度,采用菌絲生長速率法測定硫藤黃菌素對大麗輪枝菌皿內抑菌活性[8]。首先將不同質量的硫藤黃菌素(0.040 0 g、0.020 0 g、0.010 0 g、0.005 0 g、0.002 5 g)用1 mL的DMSO溶解,配制成濃度分別為40.0 mg/mL、20.0 mg/mL、10.0 mg/mL、5.0 mg/mL、2.5 mg/mL的硫藤黃菌素母液,分別將不同濃度的硫藤黃菌素母液與100 mL冷卻滅菌后至40～50 ℃的PDA培養基混合,充分混勻后制成含不同劑量硫藤黃菌素培養基(DMSO終濃度為0.4%),此時硫藤黃菌素的濃度分別為0.400 mg/mL、0.200 mg/mL、0.100 mg/mL、0.050 mg/mL、0.025 mg/mL,分別以不添加硫藤黃菌素而添加同等濃度的DMSO及空白PDA培養基作為對照,每個質量濃度需設3個重復。待培養基冷卻至室溫后,接種生長旺盛、活力一致,直徑為6 mm的供試大麗輪枝菌菌餅,于(28±1) ℃下培養。采用十字交叉法測量菌落直徑,計算出硫藤黃菌素在不同質量濃度下對大麗輪枝菌的生長抑制率和硫藤黃菌素對大麗輪枝菌的生長抑制率。

(1)

式(1)中,D0:對照組大麗輪枝菌生長直徑,mm;D1:處理組大麗輪枝菌生長直徑,mm;D2;供試大麗輪枝菌菌餅直徑,mm。

1.2.2 硫藤黃菌素乳油溶劑的選擇

取5個50 mL PA瓶,稱取1 g硫藤黃菌素,取5種有機溶劑各1 mL分別加入到5個PA瓶中,在室溫下輕微振蕩促進溶解。如果不能全部溶解,再次滴加溶劑后微熱溶解。如果始終無法全部溶解,繼續加入溶劑重復上述步驟,當溶劑加至300 mL時,如仍不能夠全部溶解,棄去,選擇另一種溶劑進行上述試驗[9]?？紤]溶解性與成本因素,篩選出最適試劑作為乳油溶劑。

1.2.3 硫藤黃菌素乳油分散性測定

將99.5 mL蒸餾水置于100 mL的量筒中,并用移液管滴入0.5 mL乳油,觀察其分散狀態。如能呈云霧狀自動分散,無可視粒子視為優;如呈絮狀下沉視為合格[10]。

1.2.4 硫藤黃菌素乳油乳化穩定性評價方法

參照GB/T 1603—2001中的方法進行測定:在250 mL燒杯中,加入100 mL 2～30 ℃標準硬水,用移液管吸取0.5 mL乳油樣品(稀釋200倍),在不斷攪拌的情況下緩緩加入標準硬水中,加完乳油后,繼續用2～3 r/s的速度攪拌30 s,立即將乳狀液移至清潔、干燥的100 mL量筒中,并將量筒置于恒溫水浴鍋中,在(30±2) ℃范圍內,靜置1 h,觀察乳狀液的分離情況,如在量筒中無浮油(膏)、沉淀和沉油析出,視為乳液穩定性合格[11]。

1.2.5 硫藤黃菌素乳油貯存穩定性測定

熱貯穩定性參照 GB/T 19136:(54±2) ℃貯存14 d,同時乳油外觀、乳液穩定性、乳化分散性等物理性質在貯存前后基本不變或變化不大,滿足各項指標要求;乳油的低溫穩定性測定參照GB/T 19137:(-20±2) ℃貯存7 d或14 d后進行觀察,不分層、無結晶為合格。

1.2.6 硫藤黃菌素乳油揮發性測定

取直徑11 cm的定性濾紙一張,用天平稱重后,用滴管在濾紙上均勻滴加1 mL乳油,使其全部濕透,加藥液量以濾紙下端無藥液滴下為宜。加藥后立即稱重,將濾紙懸掛在30 ℃室內,20 min后再次稱重。計算乳油揮發率,不超過30%為宜。

(2)

式(2)中,W0:農藥乳油揮發后的濾紙質量,g;W1:濾紙質量,g;W2:滴上農藥乳油后立即稱出的濾紙質量,g。

1.2.7 硫藤黃菌素乳油的抑菌活性測定

在96孔板每個孔中加入無菌PDA培養基100 μL。在A、B、C三排的第一孔加100 μL配好的硫藤黃菌素乳油(乳油初始濃度為1 024 μg/mL),然后對藥物進行二倍稀釋。即第一孔中加入藥液后用移液器充分吹打混勻,然后吸取100 μL加入第二孔再充分混勻,照此重復直至此排最后一孔,吸取100 μL棄去。在D、E、F三排的第一孔加100 μL配好的乙蒜素乳油(濃度為1 024 μg/mL),然后對藥物進行二倍稀釋[12]。此時每孔藥物濃度從左到右依次為512.00 μg/mL、256.00 μg/mL、128.00 μg/mL、64.00 μg/mL、32.00 μg/mL、16.00 μg/mL、8.00 μg/mL、4.00 μg/mL、2.00 μg/mL、1.00 μg/mL、0.50 μg/mL、0.25 μg/mL。并在每一孔中加入稀釋好的大麗輪枝菌菌液100 μL(約含1×107CFU/mL)[13]。這樣就形成測定一個藥物MIC值的三次重復(A、B、C三排)。此時每孔藥物濃度從左到右依次為256.000 μg/mL、128.000 μg/mL、64.000 μg/mL、32.000 μg/mL、16.000 μg/mL、8.000 μg/mL、4.000 μg/mL、2.000 μg/mL、1.000 μg/mL、0.500 μg/mL、0.250 μg/mL、0.125 μg/mL。在同一塊96孔板上的G排做陰性對照(僅加空白培養基,不加菌液),在H排做陽性對照(加菌液,不加藥液),將96孔板放入28 ℃培養箱中培養4 d。

2 結果與分析

2.1 硫藤黃菌素對大麗輪枝菌的拮抗效果

不同濃度的硫藤黃菌素抑制大麗輪枝菌活性測定結果如表1所示,通過硫藤黃菌素對大麗輪枝菌的抑菌活性試驗得出,在相同質量的培養基中,加入硫藤黃菌素濃度越大對大麗輪枝菌的抑菌活性越顯著[14]。且DMSO對大麗輪枝菌的抑菌效果并不顯著。

表1 硫藤黃菌素抑制大麗輪枝菌活性測定結果

由表1分析可知,未添加硫藤黃菌素的DMSO的抑菌率為1.7%,且與硫藤黃菌素乳油的抑菌結果并無顯著性差異,說明DMSO對大麗輪枝菌并無明顯活性,其余添加不同濃度的硫藤黃菌素對大麗輪枝菌的抑菌作用都具有顯著性差異,所以硫藤黃菌素乳油對大麗輪枝菌的抑菌作用主要來自于硫藤黃菌素。

2.2 硫藤黃菌素乳油的制備

2.2.1 溶劑的篩選

制備硫藤黃菌素乳油中溶劑的篩選需注意2個指標,即所篩選得到的溶劑加入硫藤黃菌素是否穩定和硫藤黃菌素是否能夠在溶劑中充分溶解[15]。

不同溶劑對硫藤黃菌素的溶解性如表2所示。經檢測,DMSO對硫藤黃菌素的溶解性最好,TL、XY、MT、EA對硫藤黃菌素的溶解性較差,不適合作為其溶劑。根據該試驗結果,選取溶解性最好的DMSO作為制備乳油的最佳溶劑,用來溶解原藥硫藤黃菌素。

表2 硫藤黃菌素在5種不同溶劑中的溶解性測試結果

2.2.2 不同種乳化劑對硫藤黃菌素乳油的影響

在室溫下,選取農乳500#、農乳600#、1601、1602、OP-21、BY130、El-20、吐溫20、吐溫40、吐溫80共10種不同乳化劑與溶解性最好的溶劑進行乳油的乳化分散性與穩定性測試。通過觀察制備的乳油樣品的外觀以及其滴入標準硬水中的乳化情況來判斷所制備乳油的乳化分散性以及穩定性。其中硫藤黃菌素乳油按照原藥1.0 g/mL、乳化劑0.8 g/mL、1.2 g/mL、1.5 g/mL,溶劑DMSO補足至1 mL的配方來進行配制。

以硫藤黃菌素作為原藥來配制乳油,在含有硫藤黃菌素的溶劑中分別加入不同質量的10種乳化劑制得的乳油基本符合乳油一般性能,乳油外觀均呈現半透明狀態(圖1)。

利用農乳500#制備的乳油分散性較強,其余9種乳化劑制備出的乳油分散性較差,即在滴入水中未能呈云霧狀分散(圖2)。10種乳化劑制得的乳油穩定性均為合格(圖3)。將其倒入平皿中,28 ℃下靜置1 h能保持乳液穩定(圖4)。靜置24 h后仍為透明,未見上層浮油和底部沉淀(圖5)。1號(農乳500#)從乳油外觀、乳化分散性及穩定性方面都完全符合乳油的要求。在1號乳油中添加1.2 g/mL和1.5 g/mL農乳500#能使乳油達到最優效果,如表3所示。

圖2 不同種乳油分散性效果

圖3 不同種乳油攪拌后穩定性效果

圖4 不同種乳油靜置1 h后狀態

圖5 不同種乳油靜置24 h后狀態

表3 乳油乳化分散性及穩定性測試結果

2.2.3 熱貯穩定性及低溫穩定性結果分析

通過對乳化分散性和穩定性測試為“優”的乳油樣品進行熱貯穩定性和低溫穩定性試驗,熱貯乳油無結晶(圖6a);在標準硬水中呈云霧狀分散(圖6e);乳油在水中攪拌后呈鵝黃色半透明液體(圖6g);室溫下放置24 h后上無浮油下無沉淀(圖6c),所有指標均為合格,冷貯乳油恢復室溫后無結晶(圖6b);在標準硬水中呈云霧狀分散(圖6f);乳油在水中攪拌后呈鵝黃色半透明液體狀(圖6h);室溫下放置24 h后上無浮油下無沉淀(圖6d),所有指標均為合格,達到了制作乳油的一般標準。

a:乳油熱貯14 d形態;b:乳油冷貯14 d恢復室溫后形態;c:熱貯乳油放置24 h后狀態;d:冷貯乳油放置24 h后狀態;e:熱貯后乳油分散性;f:冷貯后乳油分散性;g:熱貯乳油攪拌后狀態;h:冷貯乳油攪拌后狀態。

2.2.4 硫藤黃菌素乳油揮發性試驗結果評價

通過硫藤黃菌素乳油揮發性試驗,測得硫藤黃菌素乳油揮發率為1.8%,符合乳油揮發性標準,硫藤黃菌素乳油揮發性測試結果如表4所示。

表4 硫藤黃菌素乳油揮發性測試結果

2.2.5 硫藤黃菌素乳油對大麗輪枝菌最小抑菌活性

硫藤黃菌素乳油的抑菌活性測定結果(圖7),可得硫藤黃菌素最小抑菌濃度為2.000 μg/mL,乙蒜素乳油的最小抑菌濃度為8.000 μg/mL,說明硫藤黃菌素乳油與市面上的化學合成乳油乙蒜素對比,對大麗輪枝菌具有較好的抑菌活性。

圖7 硫藤黃菌素乳油對大麗輪枝菌抑菌活性(MIC)測試

3 討論

為了便于保存和使用活性藥物成分,通常需要加工成合適的劑型,如粉劑、乳油、膏劑等。目前農用藥物的發展方向為高效、安全、多功能,盡量少用有機溶劑以節約成本和降低毒性[16]。硫藤黃菌素原藥水溶性不好,DMSO對其具有較好的溶解性,DMSO毒性相對較小,在醫藥工業中可以直接用作某些藥物的原料及載體,本研究采用DMSO作為原藥的溶劑具有較好的安全性。

合成殺菌劑一直是植物病原真菌的主要防治手段。然而,它們會對人類、動物和環境造成危害,并在植物病原真菌中產生抗性。在過去的幾十年中,使用微生物作為植物病原真菌的生物防治劑已成為合成殺菌劑的替代方法。從陸地、海洋、濕地等環境中分離的放線菌已被用于植物病原真菌的生物防治。目前需要尋找不同分離來源新的放線菌次級代謝產物。然而,關于那些作為農業生物防治劑與其他環境隔離的物質的信息較少。因此,本研究通過分離出的具有抗真菌活性的放線菌,得出其次級代謝產物,將其制備成生物制劑。以期對植物病害具有防治作用。盡管放線菌具有作為植物病原真菌生物防治劑的潛力,但對來自海洋、鹽堿地和濕地環境的放線菌的研究很少,這些放線菌作為生物防治劑的潛力與來自陸地環境的分離株具有同等或更大的潛力。

在后續的研究中,可以采用結構修飾方法提高硫藤黃菌素的水溶性,例如糖基化修飾方法可提高天然化合物的溶解性[17],也可以采用向非核心結構區域引入羧基或氨基等極性基團的方法提高溶解性[18]。

4 結論

硫藤黃菌素對大麗輪枝菌表現出顯著的抑菌活性。通過比較不同乳化劑、溶劑、熱貯穩定性及低溫穩定性對硫藤黃菌素制備乳油制劑的影響,最終篩選出硫藤黃菌素原藥最適溶劑為DMSO,最適乳化劑為農乳500#(1.2 g/mL),確定了基于原藥硫藤黃菌素制備乳油的最佳配方。硫藤黃菌素乳油最佳配方為硫藤黃菌素10%(1.0 g/mL),農乳500#12%(1.2 g/mL),DMSO補足至100%。