基于腸黏膜形態學的唾液乳桿菌拮抗大腸桿菌研究

譚鼎,李平,陳榮,郭雪峰,車麗妍,田冰,李濤

(塔里木大學動物科學與技術學院,新疆 阿拉爾 843300)

大腸桿菌疾病(colibacillosis)發病率高、傳染性強,抗生素的濫用導致大腸桿菌耐藥性逐漸增強,易引起規模性發病,危害公共安全。目前,暫無針對性疫苗,防控難度極大。這些問題在“限抗”轉型背景下難以得到及時有效地解決,對養殖業的健康發展造成了極大威脅[1]。乳酸菌是定植在腸道內的有益菌,通過調節腸道內微生態平衡來調控腸道的生理結構、維護腸道屏障完整性,促進營養物質的消化與吸收,抑制有害菌生長,通常被用于預防和治療腸道感染疾病和抗生素依賴性腹瀉[2-3]。

現有研究表明,植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌皆對大腸桿菌有較好的拮抗作用,可緩減并修復因大腸桿菌感染而造成的腸黏膜損傷[4],但目前關于唾液乳桿菌體內、體外抑菌能力的研究尚少。本試驗旨在分離鑒定出一種能抑制大腸桿菌的雞源唾液乳桿菌,通過體外試驗評價唾液乳桿菌對大腸桿菌的抑菌作用,同時構建大腸桿菌感染模型,并對感染模型組灌服雞源唾液乳桿菌進行體內驗證,通過組織形態學HE染色觀察唾液乳桿菌對腸黏膜的保護作用,為大腸桿菌感染性疾病的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和實驗動物

新疆黑雞購自圖木舒克市冠翔畜牧養殖服務中心;大腸桿菌標準菌株(ATCC25922)由塔里木大學陳偉教授課題組惠贈;5周齡SPF級小鼠(雌雄各半)購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要試劑

MRS肉湯(MRS Broth)、MRS瓊脂和LB肉湯培養基均購自青島海博有限公司;DNA Marker DL 2 000、EasyTaq Mix酶和細菌全基因組DNA提取試劑盒均購自北京全式金生物科技有限公司;革蘭氏染色試劑盒、核酸染色劑和無菌生理鹽水均購自Solarbio公司。

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺(SW-CJ-2FD)購自上海博訊實業有限公司;凝膠成像系統(721BR08598)、梯度PCR儀(C1000)、電泳儀(042BR18884)均購自Bio-Rad公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的分離鑒定

在超凈工作臺上將黑雞唾液拭子置于盛有5 mL MRS肉湯的試管中,37 ℃振蕩培養24 h進行增菌,無菌條件下劃線于含0.8%CaCO3的改良MRS固體培養基上,挑取有溶鈣圈的單菌落進行革蘭染色并鏡檢觀察。

使用細菌全基因組DNA試劑盒提取乳桿菌的DNA,參照文獻[5]設計細菌16srRNA基因通用引物27 F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492 R:5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′,目的片段大小為1 500 bp,由蘇州金唯智生物科技有限公司合成;擴增體系為25 μL:滅菌雙蒸水8.5 μL、EasyTaq Mix 12.5 μL、上游引物和下游引物各1 μL、DNA模板2 μL;PCR擴增程序為:預變性95 ℃ 300 s,變性94 ℃ 30 s,退火54 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 60 s,循環35次;終延伸72 ℃ 10 min,陽性擴增產物由蘇州金唯智生物科技有限公司測序,所獲序列在GenBank數據庫中進行同源性比對分析,根據比對結果鑒定細菌種類并構建系統發育進化樹。

1.2.2 唾液乳桿菌體外抑菌能力測定

將大腸桿菌標準株(ATCC25922)菌種接種于LB肉湯培養基中,在37 ℃條件下培養,取200 μL菌液涂布于MRS培養基平板,每個平板放置5個牛津杯,在牛津杯中加入200 μL的唾液乳桿菌菌液,對照組加入200 μL無菌生理鹽水,將平板置于37 ℃條件下培養24 h。用游標卡尺測量抑菌圈直徑的最大值與最小值,取平均值為抑菌圈直徑。

1.2.3 唾液乳桿菌體內抑菌能力檢測

1.2.3.1 唾液乳桿菌稀釋液的制備

將雞源唾液乳桿菌分離株和大腸桿菌標準菌株(ATCC25922)分別接種于MRS和LB液體培養基中,37 ℃培養24 h后,取1.5 mL菌液于離心管中,8 000 rpm離心1 min,棄上清,菌體用無菌生理鹽水重懸并稀釋至1.5×108CFU/mL備用。

1.2.3.2 唾液乳桿菌對小鼠腸黏膜保護作用檢測

5周齡小鼠經過7 d的適應性飼養后,隨機分為4組,每組8只;空白對照組灌胃無菌生理鹽水200 μL/(只·天),連續21 d;炎性對照組灌胃大腸桿菌菌液200 μL/(只·天),連續7 d;唾液乳桿菌組灌胃雞源唾液乳桿菌菌液200 μL/(只·天),連續21 d;拮抗組先灌胃雞源性唾液乳桿菌菌液200 μL/(只·天),14 d之后,繼續灌胃大腸桿菌菌液200 μL/(只·天),連續7 d。試驗期間,小鼠自由飲水。

當炎性對照組飲食量減少,眼瞼分泌物增多,動作遲緩,反應遲鈍,臀部及肛門周圍有明顯污跡時,進行樣品采集。小鼠禁食12 h(正常飲水),對各試驗組進行空腹稱重,并取適量新鮮腸內容物保存于無菌離心管中。

參照文獻[6]設計tuf基因特異性引物,F:5′-TTATCTGAATACGACTTCCCTG-3′,R:5′-GTTGTCTTAACAATGTCATCCTT-3′,目的片段大小為296 bp,由上海生工有限公司合成;擴增體系為25 μL:滅菌雙蒸水8.5 μL、EasyTaq Mix 12.5 μL、上游引物和下游引物各1 μL、DNA模板2 μL;PCR擴增程序為預變性95 ℃ 300 s,變性94 ℃ 30 s,退火53 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 45 s,循環35次;終延伸72 ℃ 10 min;上述引物與體系用于腸道內容物中唾液乳桿菌的檢測。

將小鼠安樂死,取2 cm小腸組織保存在固定液中,制作切片HE染色并用顯微鏡觀察,對絨毛高度和隱窩深度進行測量。

1.2.4 數據統計分析

采用CaseViewer軟件進行數據分析,通過LSD法進行多重比較,P<0.01為差異極顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 分離株形態學鑒定結果

將樣品純培養后,單個菌落形態完整,微微凸起,表面光滑,呈乳白色,有溶鈣環(圖1A);將挑選的細菌涂片染色,菌體革蘭氏染色后為藍紫色桿狀,兩端鈍圓(圖1B)。

A:分離株菌落形態; B:分離株革蘭氏染色結果(10×100)。

2.2 分離株PCR擴增結果

以分離株DNA為模板,以細菌16srRNA基因通用引物進行PCR擴增,取5 μL PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在1 500 bp左右出現明顯條帶(圖2),與預期大小相符;經測序后與GenBank數據庫比對分析,與唾液乳桿菌5547株(MT463556.1)同源性為100%,表明分離株為唾液乳桿菌。選取與分離株同源性高的唾液乳桿菌16srRNA序列,運用MEGA7.0軟件采用鄰接法構建系統發育進化樹,結果顯示分離菌株的16srRNA基因序列與Ligilactobacillussalivarius2875(MT611 837.1)株遺傳進化相距最近,置信度為100%(圖3),說明二者在進化上親緣關系非常近。

M:DL-2 000 Marker;1:陰性對照;2:16s rRNA基因擴增產物。

圖3 分離株基于16s rRNA基因序列的系統發育進化樹

2.3 唾液乳桿菌體外抑菌能力測定結果

如表1、圖4所示,體外抑菌試驗結果表明,雞源唾液乳桿菌對大腸桿菌具有明顯的生長抑制作用,抑菌圈平均直徑為17.59 mm。

表1 唾液乳桿菌抑制大腸桿菌抑菌圈直徑

1:生理鹽水抑制大腸桿菌抑菌圈;2～5:唾液乳桿菌抑制大腸桿菌抑菌圈。

2.4 小鼠腸道內唾液乳桿菌檢測結果

以各組小鼠糞便中細菌DNA為模板,用tuf基因特異性引物進行PCR擴增并進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,唾液乳桿菌組在296 bp左右出現目的條帶,對照組無特異性條帶(圖5),表明雞源性唾液乳桿菌可以適應宿主的自然選擇并發揮其益生作用。

M:DL-2 000 Marker;1:唾液乳桿菌組;2:拮抗組;3:炎性對照組;4:空白對照組。

2.5 小鼠腸腔組織切片結果

小鼠腸黏膜組織切片結果顯示,與空白對照組、炎性對照組和拮抗組相比,唾液乳桿菌組腸絨毛細長、排列整齊、連續性和完整性較好,腸腔最小(圖6),表明唾液乳桿菌對小鼠腸絨毛具有伸長和保護作用。

圖6 各組小腸組織切片圖(HE 20×)

利用CaseViewer軟件測量絨毛高度和隱窩深度,結果顯示與空白對照組和炎性對照組相比,唾液乳桿菌組腸絨毛高度最高,絨隱比最高(P<0.01);與炎性對照組相比,拮抗組腸絨毛高度和絨隱比極顯著高于炎性對照組(P<0.01)(圖7A、圖7B);組織切片分析結果顯示唾液乳桿菌組杯狀細胞數目多且排列整齊、隱窩深度最淺、絨隱比最大;炎性對照組腸絨毛嚴重破損,杯狀細胞排列混亂、隱窩深度增大;拮抗組顯著優于炎性對照組(圖7C)。表明雞源唾液乳桿菌可以增加小鼠腸道絨隱比,并且可以緩減、修復大腸桿菌對腸黏膜的損傷,進而拮抗其感染。

A:絨毛高度、隱窩深度數據;B:絨隱比數據;C:小腸組織切片(HE 100×),矩形表示絨毛高度,三角形表示隱窩深度,圓形表示杯狀細胞區域。

3 討論

唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)屬于乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)乳桿菌屬(Lactobacillus),是一種革蘭氏陽性菌,它存在于人類和畜禽的共生菌群中[7]。唾液乳桿菌的代謝產物中有過氧化氫、抑菌素、有機酸和短鏈脂肪酸等,可抑制或殺滅細菌[8]。本研究從新疆黑雞唾液中分離鑒定出唾液乳桿菌,通過牛津杯法發現該株唾液乳桿菌對大腸桿菌生長有顯著的抑制作用,這與王黎明等[9]研究結果一致,表明新疆黑雞源唾液乳桿菌對大腸桿菌的生長具有體外抑制作用。

腸道微生物體系在維持動物體健康方面有重要的作用,腸道菌群的結構和組成反映了微生物和宿主水平的自然選擇[10]。小鼠腸道主要微生物菌群為Bacteroidetes和Firmicutes等[11-13]。本研究結果顯示試驗組小鼠腸道內容物有雞源性唾液乳桿菌,而對照組幾乎沒有,表明雞源性唾液乳桿菌適應宿主的自然選擇并發揮其益生作用。

腸黏膜由上皮細胞層(柱狀上皮細胞、杯狀細胞和內分泌細胞等)、固有層和黏膜肌層組成。上皮細胞層和固有層向管腔突出形成腸絨毛,上皮細胞層向黏膜下層凹陷形成腸隱窩。腸黏膜是支持水、養分和離子轉運的一種選擇性組織膜,可作為腸道微生物與基礎免疫系統之間的屏障。乳酸菌是定植在腸道內的有益菌,憑借其多樣性和動態平衡性維持腸道健康、調控腸道生理結構、維護腸黏膜完整性,促進營養物質的消化與吸收、有益于宿主的生長和發育[14-15]。WU H Q等[16]研究發現,乳酸菌具有促進腸上皮細胞再生、修復其病理性損傷和維持內環境穩定的作用,可形成黏膜屏障、抑制病原微生物的定植。邵青玲等[17]研究表明,在飼料中添加多糖后,隱窩深度變淺,細胞成熟率和吸收功能增強,腸黏膜修復能力增強,絨毛高度與隱窩深度比值(絨隱比)大,小腸消化能力強。谷巍等[18]研究發現,乳酸菌通過增加腸道絨隱比增強小鼠免疫力,降低小鼠腹瀉率。本研究結果表明雞源性唾液乳桿菌可以促進小鼠腸絨毛的生長、抑制腸隱窩的深度、增加絨隱比;炎性對照組的腸絨毛損傷嚴重,腸腔變大,隱窩加深;而拮抗組對此有明顯改善作用,緩減并修復了大腸桿菌對小鼠腸道黏膜的損傷,保護腸道健康。

4 結論

綜上所述,從新疆黑雞唾液中分離的唾液乳桿菌對大腸桿菌具有良好的體外抑制作用。對大腸桿菌感染的小鼠腸黏膜完整性和連續性具有很好的保護與修復作用,具有拮抗大腸桿菌感染的能力。