基于TGF-β1/Smad3信號通路探討lncRNA H19對慢性心力衰竭大鼠的影響

王凌燕，曹國軍，梅洋，張彬，周詩晶

湖北六七二中西醫結合骨科醫院，湖北 武漢 430079

慢性心力衰竭是一種常見的心臟疾病，往往會造成患者心功能受損，導致心肌纖維化［1］。心肌纖維化是心力衰竭的重要標志之一［2］。慢性心力衰竭發病原因多種多樣，可受電解質紊亂、貧血癥狀、心律失常等多種因素誘發［3］。目前該疾病主要通過藥物緩解或外科手術進行治療，但外科手術較為昂貴，藥物治療效果不一。近年來，心力衰竭患者數量逐步增多，開發具有針對性的治療藥物成為當前研究的重點［4］。有研究顯示，微小RNA（micro RNA，miRNA）可參與包括調控心臟內穩態和病理結構重塑在內的多種生理活動［5］。在心肌損傷引發的心力衰竭過程中，miRNA-23a高表達，加速心肌細胞凋亡，加劇心力衰竭［6］；miRNA-133a則可以促進心肌組織纖維化，進一步抑制心臟功能恢復［7］；miRNA-200a在心力衰竭患者體內高表達，很可能在疾病進展中發揮重要作用［8］。

長鏈非編碼RNA（long non-conding RNA，lncRNA）是一種長度較長、不參與編碼蛋白質的RNA，可在多個層面調控生理活動，被證實參與影響多種心臟功能［9］。lncRNA H19作為常見的lncRNA，在多種心血管疾病中發揮重要作用，可減少促炎因子含量，緩解炎癥反應，是治療心臟相關疾病的重要靶點之一［10］。lncRNA H19可抑制miRNA-200a表達，在肺癌疾病中發揮重要作用［11］。本研究以心力衰竭大鼠為實驗對象，探究lncRNA H19是否通過調控miRNA-200a參與影響慢性心力衰竭大鼠心功能和心肌纖維化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇清潔級成年健康雄性SD大鼠60只，體質量（230±10）g，由河南環宇康禾生物科技有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（豫）2020-0004。大鼠自由飲水、進食，飼養室溫度23～25 ℃，照明以12 h/12 h明暗交替進行。本實驗研究方案經湖北六七二中西醫結合骨科醫院實驗動物倫理委員會審批通過（審批號：XZ20221019）。

1.2 主要實驗試劑與儀器

lncRNA H19質粒、lncRNA H19陰性對照、miRNA-200a質粒均由吉瑪生物科技有限公司參與設計并合成；Lipofectamine 2000轉染試劑（產品批號：11668030）購于ThermoFisher公司；Masson染色試劑盒（產品批號：JA1001）購于佳維斯（武漢）生物醫藥有限公司；心臟彩色多普勒超聲儀（江蘇大為醫療有限公司，型號：DW-T6）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（產品批號：ab9485）、轉化生長因子β1蛋白（transforming growth factor-β1，TGF-β1）抗體（產品批號：ab215715）、Smad同源物3（Smad3）抗體（產品批號：ab40854）購于英國Abcam公司；熒光定量PCR儀（美國ABI公司，型號：7500）；凝膠成像系統［生工生物工程（上海）股份有限公司，型號：HE-120］。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物模型制備和分組 采用隨機數字表法將60只SD大鼠分為假手術組和模型組，分別為12只和48只。假手術組、模型組根據體質量（0.3 mL/100 g）注射1%戊巴比妥鈉麻醉，固定于操作臺上，腹部朝上，常規備皮。手術刀剖開胸腔，暴露心臟部位。于肺動脈和左心耳處進針穿線，深度1.5 mm。假手術組穿線后不結扎，其余4組結扎后觀察到心室前壁發白，心臟跳動明顯變緩即可，縫合傷口后，消毒處理。20 d后檢測模型組大鼠心功能，左心室心臟射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）＜50.00%即造模成功。造模成功的模型組大鼠按隨機數字表法分為心力衰竭組、lncRNA H19過表達組（過表達組）、lncRNA H19陰性對照組（陰性對照組）和lncRNA H19過表達＋miRNA-200a過表達組（聯合過表達組），每組12只。

1.3.2 干預方法 陰性對照組大鼠尾部通過靜脈注射給予lncRNA H19陰性對照質粒5 mL/（kg·d）；過表達組大鼠尾部通過靜脈注射給予lncRNA H19質粒5 mL/（kg·d）；聯合過表達組大鼠尾部通過靜脈注射給予lncRNA H19質粒5 mL/（kg·d）和miRNA-200a質粒2 mL/（kg·d）；心力衰竭組、假手術組大鼠尾部靜脈注射等劑量的生理鹽水。分別于分組后第1、4、7、10、13、16天進行注射，1次/d。

1.4 觀察指標

1.4.1 大鼠心功能指標 末次注射2 d后，麻醉、固定各組大鼠，采用心臟彩色多普勒超聲儀檢測大鼠心功能指標，主要指標如下：LVEF、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左心室收縮末期內徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）、左心室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）。

1.4.2 心肌組織纖維化情況觀察 心功能評估后，迅速處死各組大鼠，剖開胸腔暴露心臟，解剖獲取心肌組織，部分剪碎后，液氮處理研磨至粉，凍存備用。剩余組織置于4%多聚甲醛中固定，24 h后常規脫水透明，制作石蠟切片。按照Masson染色試劑盒說明書方法進行常規染色。在Masson染色切片中，心肌細胞被染成紅色，而膠原纖維被染成藍色。每個樣品選擇3個視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析每個顯微視野中膠原纖維染成藍色的區域面積占總面積的百分比，即膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF）。

CVF＝心肌膠原纖維面積/所測視野面積×100%

1.4.3 心肌組織lncRNA H19、miRNA-200a轉錄水平檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測心肌組織lncRNA H19、miRNA-200a轉錄水平。取出凍存備用的心肌組織粉末少許，按照TRIzol法提取RNA，檢測RNA濃度，反轉錄至cDNA，上機檢測lncRNA H19、miRNA-200a的轉錄水平。引物序列通過軟件Primer 3.0設計，由北京擎科生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 lncRNA H19和miRNA-200a引物序列Table 1 lncRNA H19 and miRNA-200a primer sequence

1.4.4 心肌組織TGF-β1、Smad3蛋白表達水平檢測 采用Western blot法檢測心肌組織TGF-β1、Smad3蛋白表達水平。取出凍存備用的心肌組織粉末少許，加入少量蛋白裂解液，充分振蕩混勻，加入蛋白提取液少許，充分震蕩后靜置片刻，4 ℃8 000 r/min離心5 min，取上層清液干燥片刻后，加入上樣緩沖液，混合加熱變性，加入凝膠板孔道中，電泳跑膠后轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（GAPDH抗體、TGF-β1抗體、Smad3抗體，1∶1 500），4 ℃孵育過夜。棄封閉液，TBST反復清洗3次。加入二抗（1∶1 000），常溫孵育40 min，TBST緩沖液反復清洗3次。將發光液倒于膜上，浸泡片刻，吸水紙吸凈多余液體，置于Syngene光密度掃描系統上，進行條帶灰度分析。

1.5 統計學方法

采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析。計量資料服從正態分布采用（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 5組心功能指標比較

與假手術組比較，其余4組LVEDD、LVESD均明顯升高，LVFS、LVEF均明顯降低（P＜0.05）；與心力衰竭組、陰性對照組比較，過表達組LVEDD、LVESD均明顯降低，LVFS、LVEF均明顯升高（P＜0.05）；與過表達組比較，聯合過表達組LVEDD、LVESD均明顯升高，LVFS、LVEF均明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 5組心功能指標比較（）Table 2 Comparison of cardiac function indicators in five groups （）

表2 5組心功能指標比較（）Table 2 Comparison of cardiac function indicators in five groups （）

注：與假手術組比較，1） P＜0.05；與心力衰竭組比較，2） P＜0.05；與陰性對照組比較，3） P＜0.05；與過表達組比較，4） P＜0.05。Note: Compared with the sham surgery group, 1) P＜0.05; compared with the heart failure group, 2) P＜0.05; compared with the negative control group, 3) P＜0.05; compared with the overexpression group, 4) P＜0.05.

LVEF/%75.52±2.62 35.63±3.561）34.79±3.251）65.25±2.381）2）3）53.63±2.631）2）3）4）組 別假手術組心力衰竭組陰性對照組過表達組聯合過表達組n 12 12 12 12 12 LVEDD/mm 3.52±0.26 6.92±0.521）6.86±0.261）4.58±0.481）2）3）5.67±0.381）2）3）4）LVESD/mm 3.29±0.37 6.35±0.681）6.62±0.721）4.37±0.521）2）3）5.32±0.231）2）3）4）LVFS/%49.63±2.63 19.63±3.261）18.83±2.631）40.52±2.621）2）3）32.52±2.361）2）3）4）

2.2 5組心肌組織病理學變化比較

假手術組大鼠心肌組織僅有少量膠原分布，組織細胞排列緊密無明顯縫隙；與假手術組比較，心力衰竭組大鼠心肌組織出現大量增生的膠原，細胞排列不均勻，CVF明顯升高（P＜0.05）；與心力衰竭組、陰性對照組比較，過表達組大鼠心肌組織膠原增生明顯緩解，細胞間整齊分布，CVF明顯降低（P＜0.05）；與過表達組比較，聯合過表達組大鼠心肌組織仍有大量膠原分布，細胞間間隙擴大，CVF明顯升高（P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 5組大鼠心肌組織病理變化（×400）Figure 1 Pathological changes of myocardial tissue in five groups （×400）

表3 5組心肌組織CVF比較 （）Table 3 Comparison of CVF of myocardial tissue in five groups （）

表3 5組心肌組織CVF比較 （）Table 3 Comparison of CVF of myocardial tissue in five groups （）

注：與假手術組比較，1） P＜0.05；與心力衰竭組比較，2） P＜0.05；與陰性對照組比較，3） P＜0.05；與過表達組比較，4） P＜0.05。Note: Compared with the sham surgery group, 1) P＜0.05; compared with the heart failure group, 2) P＜0.05; compared with the negative control group, 3) P＜0.05; compared with the overexpression group, 4) P＜0.05.

組 別假手術組心力衰竭組陰性對照組過表達組聯合過表達組n 12 12 12 12 12 CVF/%5.25±0.62 36.63±3.741）37.73±3.631）14.52±1.631）2）3）23.32±1.741）2）3）4）

2.3 5組心肌組織lncRNA H19、miRNA-200a轉錄水平比較

與假手術組比較，其余4組大鼠心肌組織lncRNA H19轉錄水平明顯降低，miRNA-200a轉錄水平明顯升高（P＜0.05）；與心力衰竭組、陰性對照組比較，過表達組和聯合過表達組lncRNA H19轉錄水平明顯升高，miRNA-200a轉錄水平明顯降低（P＜0.05）；與過表達組比較，聯合過表達組大鼠心肌組織miRNA-200a轉錄水平明顯升高（P＜0.05），lncRNA H19轉錄水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 5組心肌組織lncRNA H19、miRNA-200a轉錄水平比較（）Table 4 Comparison of lncRNA H19 and miRNA-200a transcription level of myocardial tissue in five groups （）

表4 5組心肌組織lncRNA H19、miRNA-200a轉錄水平比較（）Table 4 Comparison of lncRNA H19 and miRNA-200a transcription level of myocardial tissue in five groups （）

注：與假手術組比較，1） P＜0.05；與心力衰竭組比較，2） P＜0.05；與陰性對照組比較，3） P＜0.05；與過表達組比較，4） P＜0.05。Note: Compared with the sham surgery group, 1) P＜0.05; compared with the heart failure group, 2) P＜0.05; compared with the negative control group, 3) P＜0.05; compared with the overexpression group, 4) P＜0.05.

n組 別假手術組心力衰竭組陰性對照組過表達組聯合過表達組12 12 12 12 12 miRNA-200a 1.07±0.09 2.36±0.211）2.32±0.231）1.33±0.151）2）3）1.75±0.141）2）3）4）lncRNA H19 1.06±0.07 0.21±0.031）0.23±0.051）0.79±0.081）2）3）0.74±0.051）2）3）

2.4 5組心肌組織TGF-β1、Smad3蛋白表達水平比較

與假手術組比較，其余4組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3蛋白表達水平均明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與心力衰竭組、陰性對照組比較，過表達組、聯合過表達組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3蛋白表達水平均明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與過表達組比較，聯合過表達組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3蛋白表達水平均明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表5、圖2。

圖2 5組TGF-β1、Smad3蛋白條帶圖Figure 2 Protein band figure of TGF-β1 and Smad3 in five groups

表5 5組心肌組織TGF-β1、Smad3蛋白表達水平比較（）Table 5 Comparison of TGF-β1 and Smad3 protein expression level of myocardial tissue in five groups （）

表5 5組心肌組織TGF-β1、Smad3蛋白表達水平比較（）Table 5 Comparison of TGF-β1 and Smad3 protein expression level of myocardial tissue in five groups （）

注：與假手術組比較，1） P＜0.05；與心力衰竭組比較，2） P＜0.05；與陰性對照組比較，3） P＜0.05；與過表達組比較，4） P＜0.05。Note: Compared with the sham surgery group, 1) P＜0.05; compared with the heart failure group, 2) P＜0.05; compared with the negative control group, 3) P＜0.05; compared with the overexpression group, 4) P＜0.05.

組 別假手術組心力衰竭組陰性對照組過表達組聯合過表達組Smad3/GAPDH 0.41±0.11 2.23±0.321）2.31±0.261）1.22±0.211）2）3）1.75±0.161）2）3）4）n 12 12 12 12 12 TGF-β1/GAPDH 0.37±0.12 1.68±0.221）1.72±0.181）0.76±0.191）2）3）1.17±0.201）2）3）4）

3 討 論

3.1 lncRNA H19過表達可降低心臟損傷程度，改善心臟功能

心肌纖維化是慢性心力衰竭的主要病理基礎，心肌組織中膠原纖維的過度沉積可導致心功能障礙，甚至出現心力衰竭［12-13］。心功能和心肌纖維化程度是判斷心力衰竭疾病程度的重要指標［14］。CVF是評估心肌纖維化情況的重要指標［15］。本研究心力衰竭大鼠模型心肌組織出現大量膠原增生，細胞間排列松散，CVF明顯升高，出現明顯的心肌纖維化病變。本研究結果顯示，與心力衰竭組、陰性對照組比較，過表達組LVEDD、LVESD均明顯降低，LVFS、LVEF均明顯升高；與過表達組比較，聯合過表達組LVEDD、LVESD均明顯升高，LVFS、LVEF均明顯降低；與心力衰竭組、陰性對照組比較，過表達組大鼠心肌組織膠原增生明顯緩解，細胞間整齊分布，CVF明顯降低，提示lncRNA H19過表達后可減緩心肌組織內膠原增生，抑制心肌纖維化，減輕心肌損傷程度，從而改善心肌功能。因此，本研究推測lncRNA H19可調控多個靶基因的表達，在慢性心力衰竭疾病發生、發展進程中發揮重要作用［16］。與馬成龍等［17］和呼靜飛［18］研究結果相似。

3.2 lncRNA H19過表達改善心力衰竭可能與調控TGF-β1/Smad3信號通路、抑制miRNA-200a表達有關

本研究結果顯示，與心力衰竭組、陰性對照組比較，過表達組、聯合過表達組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3蛋白表達水平和miRNA-200a轉錄水平明顯降低，lncRNA H19轉錄水平明顯升高；與過表達組比較，聯合過表達組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3蛋白表達水平和miRNA-200a轉錄水平明顯升高，提示lncRNA H19過表達改善心力衰竭可能與調控TGF-β1/Smad3信號通路、抑制miRNA-200a表達有關?？赡芘c以下因素有關：① TGF-β1/Smad3信號通路在調控心肌纖維化、改善心肌功能中發揮重要作用。TGF-β1/Smad3信號通路與心肌纖維化密切相關，TGF-β1是組織纖維化的基礎，TGF-β1的高表達可促進膠原合成，減緩細胞外基質的降解［19］。TGF-β1可進一步上調Smad3表達，啟動纖維化相關因子表達，調控纖維化過程［20］。本研究lncRNA H19過表達可降低慢性心力衰竭大鼠心肌組織中TGF-β1/Smad3信號通路相關蛋白的表達，進一步證實lncRNA H19對心肌纖維化的抑制作用。② lncRNA H19改善心力衰竭可能與調控miRNA-200a有關。有研究顯示，miRNA可調節心力衰竭相關基因的表達，在心力衰竭中發揮重要作用［21］。miRNA-129、miRNA-212、miRNA-200a高表達可引發心力衰竭，造成心肌細胞過度肥大，引發左心室重塑，導致心臟功能障礙。有研究證實，miRNA-200a是lncRNA H19的靶基因［11］。本研究lncRNA H19過表達，慢性心力衰竭大鼠心肌組織miRNA-200a明顯降低。因此，推測lncRNA H19可能通過調控miRNA-200a，從而改善心力衰竭。為進一步驗證這種假設，本研究在lncRNA H19過表達的同時上調miRNA-200a表達，結果發現，上調miRNA-200a可減弱lncRNA H19過表達對慢性心力衰竭大鼠心功能和心肌纖維化的緩解作用，進一步證實lncRNA H19可能通過調控miRNA-200a，影響心力衰竭進展情況。

4 小 結

lncRNA H19過表達可減輕心肌纖維化和心臟損傷程度，改善心功能，可能與調控TGF-β1/Smad3信號通路、抑制miRNA-200a表達有關。