尾巨桉EugNAC007基因的克隆與功能分析

何沙娥，歐陽林男，楊嘉麒，鄭嘉琪，陳少雄

尾巨桉基因的克隆與功能分析

何沙娥，歐陽林男，楊嘉麒，鄭嘉琪，陳少雄*

（中國林業科學研究院速生樹木研究所，廣東 湛江 524022）

為挖掘桉樹木材形成重要NAC轉錄因子，以尾巨桉DH32-29的轉錄組測序數據為基礎，克隆了一個桉樹NAC基因，并對其功能進行了初步研究。序列分析表明：編碼序列全長1 711 bp，預測編碼蛋白含569個氨基酸，分子量為64.32 KD，定位于細胞核。EugNAC007蛋白在N端具有一個典型的NAC結構域。系統進化分析表明EugNAC007蛋白與擬南芥中調控細胞分裂的AtNTM1親緣關系較近。實時熒光定量PCR結果顯示在木質部中優勢表達。在楊樹中過表達該基因抑制了植株株高生長。推測可能通過調控細胞分裂的形式參與木材形成過程，但具體作用途徑和機制待進步一研究。該研究為深入挖掘桉樹木材形成相關重要NAC轉錄因子提供參考。

桉樹；NAC轉錄因子；基因克??；基因功能

木材（次生木質部）是十分重要的可再生資源。轉錄因子在木材形成過程中發揮重要調控作用，鑒定和揭示木材形成相關關鍵轉錄因子具有重要意義。NAC轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子，其命名取自矮牽牛（）轉錄因子NAM（NO APICAL MERISTEM）和擬南芥（）轉錄因子ATAF1（ARABIDOPSIS TRANSCRIPTION ACTIVATOR FACTOR 1）、ATAF2以及CUC2（CUP-SHAPED COTYLEDON 2）的首寫字母，其N-末端含有一個高度保守的NAC結構域，約150 ～ 160個氨基酸殘基，C-末端含有高度多樣性的轉錄激活功能域[1-2]。NAC轉錄因子在調控植物生長發育以及植物次生生長等過程中發揮著重要的生物學功能。

迄今已經克隆了多個木材形成相關的NAC轉錄因子基因，它們廣泛參與了形成層細胞分裂、木質部細胞分化及次生壁合成等木材形成相關事件的發生。YANG等[3]發現，擬南芥NAC轉錄因子XVP（PRECOCIOUS XYLEM DIFFERENTIATION AND ALTERED VASCULAR PATTERNING）控制木質部細胞分化和形成層細胞分裂的平衡。由韌皮部產生的短肽分子TDIF（TRACHEARY ELEMENT DIFFERENTIATION INHIBITORY FACTOR）轉移到形成層區域后與受體PXY（PHLOEM INTERCALATED WITH XYLEM）結合，上調下游轉錄因子（）基因的表達水平，促進形成層細胞分裂[4]，而XVP能與TDIF共受體BAK1（BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1- ASSOCIATED KINASE1）結合，抑制TDIF-PXY信號輸出，使基因表達水平降低，減少形成層細胞分裂，同時上調次生壁合成NAC轉錄因子（）的表達水平，促進木質部形成[3]。

目前認為木質部細胞次生壁合成調控網絡在維管植物中相對保守[5]。在這個調控網絡中，次生壁合成NAC（Secondary wall-associated NAC, SWN）轉錄因子是整個調控網絡的頂層開關元件。以CHEN等[6]報道的毛果楊（）細胞壁合成轉錄調控網絡為例，包含了4個層級，由18個轉錄因子和27個細胞壁成分合成基因組成，木質部發育相關NAC轉錄因子（Wood-associated NAC transcription factor, WND）（）位于調控網絡最上層，是該調控網絡的主控開關，、、和位于第三層級，其中可直接調控下游的木質素單體合成基因。其他樹種中木質部發育相關NAC轉錄因子如桉樹（spp.）中的云杉（）中的-也已被鑒定[5,7]。雖然多數報道顯示木質部形成轉錄調控在不同物種中表現保守，但仍存在差別。如巨桉（）在木材形成過程中作為正調控因子參與木質素的合成，而其在擬南芥中的同源基因則是負調控葉片衰老，且并未參與木質部發育調控[8]。

桉樹生長迅速，是紙漿、造紙、膠合板、生物質能源及其他木質纖維素原材料的主要來源，為我國木材資源供給做出了重要貢獻[9]。HUSSEY等[10]對巨桉（）基因組分析獲得了189個Cs，組織表達分析表明、、、和可能參與了木質化過程，但是這些成員并非已報道的擬南芥木質化過程相關基因（如、、、及）的同源基因，說明桉樹可能存在一些與擬南芥中功能不同的木材形成相關NAC轉錄因子成員。為獲得更多重要的桉樹木材形成相關NAC轉錄因子基因，本課題組通過對不同種植密度下尾巨桉（×）的轉錄組數據分析，發現一個NAC轉錄因子基因的表達水平在主莖生長量顯著增加的木質部中明顯升高。本研究克隆了該基因，并通過生物信息學分析、組織表達及轉基因開展基因功能研究，以期為深入挖掘桉樹木材形成相關重要NAC轉錄因子提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

本試驗所用植物材料為盆栽3月齡尾巨桉DH32-29無性系苗，平均直徑6.84 mm（于主莖基部10 cm處測量），平均株高65.72 mm。分別取頂端、第一節間至第七節間的木質部，迅速置于液氮凍存。每個樣本由5個植株混樣組成。使用EASYspin/EASYspin Plus植物RNA提取試劑盒提取RNA（北京愛博森生物科技有限公司）；采用反轉錄試劑盒TRUEscript RT MasterMix（北京愛博森生物科技有限公司）進行反轉錄獲得cDNA，進行后續試驗。

1.2 基因克隆與載體構建

根據三代測序數據獲得的轉錄本序列，設計基因特異引物（表1），利用Q5高保真DNA聚合酶（New England Biolabs，M0491）從尾巨桉DH32-29無性系木質部cDNA中擴增目標基因序列。PCR擴增反應體系的總體積為50 μL，其中滅菌水18.5 μL，5 × Q5反應緩沖液10 μL，5 × Q5 High GC Enhancer 10 μL，Q5 超保真DNA聚合酶0.5 μL，正、反向引物各2.5 μL（10 mM），dNTPs（10 mM）1 μL，cDNA模板5 μL。PCR擴增反應程序為98 ℃預變性30 s，98 ℃變性10 s，65 ℃復性15 s，72 ℃延伸2 min，30個循環，72 ℃延伸10 min。

表1 引物信息表

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后純化回收（天根DNA純化膠回收試劑盒DP214）。使用Hieff Clone Plus One Step Cloning Kit（上海翊圣生物科技有限公司）通過無縫克隆的方法將純化后的PCR產物克隆進由Nco1和Pml1消化的pCAMBIA1305.1載體中，得到35S∶∶Gene的表達載體。陽性細菌克隆提取質粒進行測序確認。

1.3 基因序列分析

使用Ex-pasy protparam（https://web.expasy.org/ protparam/）在線分析編碼蛋白的氨基酸數目、理化性質。通過NCBI CDD分析蛋白保守結構域（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）。通過Cell-PLoc網站（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/ bioinf/plant-multi/）分析蛋白亞細胞定位。從https://www.arabidopsis.org/下載擬南芥基因和蛋白序列，從http://www.phytozome.net/poplar release 3.1下載毛果楊基因和蛋白序列。利用MEGA 6.06軟件的Clustal W工具對3個物種的蛋白序列進行比對分析，選擇鄰近結合法（Neighbor-joining method）構建系統進化樹，校驗參數Bootstrap為1 000。

1.4 組織表達分析

以克隆的基因序列為模板設計基因特異引物，以不同節間的木質部cDNA為模板，通過基因特異性引物和內參基因（）（表1）進行實時熒光定量PCR，檢測目標基因在木材形成組織中的表達情況。熒光定量檢測所用試劑盒為2 × SybrGreen qPCR Mix熒光定量試劑盒（愛博森生物公司）。反應體系和運行程序按照試劑盒說明書操作。每個組織樣品設置3個生物學重復和3次技術重復。用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

1.5 84k楊遺傳轉化與分析

質粒經測序確認后進行84k楊樹的遺傳轉化，轉化流程主要參照AN等[11]和ZHOU等[12]的方法，使用潮霉素（Hygromycin）按正常流程篩選。轉化基本過程如下：從莖尖往下取4周無菌苗的第3 ～ 5片葉作為農桿菌侵染的外植體，用解剖刀沿中脈切3 ～ 4個傷口，預培養2 d。侵染前1 d，準備農桿菌，培養過夜。在侵染當天，當農桿菌菌液的OD600達到0.5左右時，侵染葉外植體，之后在黑暗中共培養3 d。將外植體移至芽再生培養基上進行篩選和芽再生后直接移至生根培養基獲得轉基因苗。分別提取轉基因苗和野生型負對照植株的基因組DNA，利用載體的潮霉素抗性基因引物（表1）擴增鑒定陽性轉基因苗。將轉基因苗和野生型負對照植株移栽至花盆中進行培養，統一水肥管理，觀察植株生長情況。

2 結果與分析

2.1 EugNAC007基因克隆與序列分析

對尾巨桉DH32-29三代轉錄組測序分析，發現一個NAC轉錄因子基因MIX-PB_transcript_70069（長度 1 974 bp）的表達量在主莖生長量顯著增大的木質部樣本中顯著升高[12]。根據其序列設計引物，以尾巨桉DH32-29主莖木質部cDNA為模板，擴增目的基因編碼區，獲得長度約2 000 bp的單一條帶（圖1A）。經克隆測序，獲得長度為1 711 bp的編碼序列。序列分析預測其編碼一個含569個氨基酸殘基的蛋白，在N-末端第29位氨基酸至156位氨基酸含有一個保守的NAC結構域，包含5個亞結構域（圖1B）；蛋白預測相對分子量為64.32 KD，等電點pI為5.09，屬酸性蛋白；亞細胞定位分析顯示該蛋白定位于細胞核。

A：從尾巨桉DH32-29主莖木質部中擴增的EugNAC007瓊脂糖電泳檢測；M，全式金Trans2K Plus DNA Marker（條帶自上到下：5 Kb，3 Kb，2 Kb，1 Kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）；B：EugNAC007編碼的氨基酸序列；下劃線部分表示NAC結構域，粗體字部分代表5個亞結構域。A, Agarose gel electrophoresis of EugNAC007 gene amplified from stem xylem of E. urophylla × E. grandis DH32-29; M, Trans2K Plus DNA Marker (the fragments size from top to bottom are 5 Kb, 3 Kb, 2 Kb, 1 Kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp); B: Amino acid sequence of EugNAC007; Underline indicates the NAC domain, bold indicates the five subdomains.

HUSSEY等[10]系統分析了巨桉NAC轉錄因子家族，獲得了189個巨桉NAC成員，并將之與擬南芥中105個NAC成員、楊樹中163個NAC成員等做了進化分析。為明確本研究所獲得的尾巨桉NAC轉錄因子基因與巨桉、擬南芥、楊樹NAC成員之間的關系，課題組前期將MIX-PB_transcript_70069蛋白序列與上述3個物種的NAC成員構建了系統進化樹，發現MIX-PB_transcript_70069與擬南芥ANAC003（XVP，AT1G02220.1）、ANAC005（AT1G02250.1）、ANAC068（AtNTM1，AT4G01540.1）等成員在同一個分枝[13]，這些成員已被證實參與形成層細胞分裂或木質部發育調控[3, 14-15]。本研究選取該分枝部分成員進一步簡化了系統關系樹（圖2），結果顯示：MIX-PB_transcript_70069與巨桉EgrNAC007（Eucgr.G01047）的親緣關系最近，與擬南芥AtNTM1以及楊樹3個NAC轉錄因子的關系較近。其中，擬南芥AtNTM1的功能已知，為調控細胞分裂[14]。本研究將獲得的命名為。

2.2 EugNAC007基因組織表達分析

轉錄組數據顯示，在主莖生長量大的植株木質部中，的表達量也顯著上調。為了進一步明確在不同發育程度木質部中的表達變化，本研究以葉片為參照，通過實時熒光定量方法對該基因在不同莖節中的表達水平進行分析。結果顯示該基因在不同發育程度木質部中的表達水平顯著高于葉片。比較不同莖節中的基因表達量，發現該基因在第三節間中的表達水平最高，其次是第七節間，但是各節間的表達水平差異不顯著。

圖2 尾巨桉EugNAC007（MIX-PB_transcript_70069）與其他物種NAC轉錄因子的系統進化關系

圖3 尾巨桉EugNAC007在不同節間木質部和葉片中的表達水平

2.3 轉基因植株鑒定與分析

為了證明基因參與木材形成過程的調控，本研究構建了過量表達載體并遺傳轉化84K楊，利用載體的潮霉素抗性基因引物擴增鑒定陽性轉基因植株。結果顯示，在12個轉基因株系中，11個株系擴增出目的片段，野生型植株（WT）無擴增帶（圖4）。對野生型和過表達植株進行盆栽培養，保持生長條件一致并觀察生長情況，發現過表達植株的株高明顯低于野生型的，表明過表達影響了植株正常生長（圖5）。

M，全式金Trans2K Plus DNA Marker（條帶自上到下：5 Kb，3 Kb，2 Kb，1 Kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）；WT，野生型植株。M，Trans2K Plus DNA Marker (the fragments size from top to bottom are 5 Kb, 3 Kb, 2 Kb, 1 Kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp); WT, wild type.

WT：野生型植株；OE：EugNAC007過表達植株。WT, wild type; OE, EugNAC007 overexpression plants.

3 討論與結論

NAC轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子大家族，廣泛參與植物生長發育多方面的調控。木材形成是植株正常生長以及生物量積累的重要生物學過程，一些NAC轉錄因子在木材形成過程中發揮了重要的調控作用[16-19]。研究表明，擬南芥中含有105個NAC成員，楊樹中含有163個NAC成員[10]，它們中一些成員在形成層細胞分裂、木質部細胞分化、次生壁加厚等木材形成相關生物學過程中發揮了關鍵調控作用[16]。在擬南芥中，NAC轉錄因子SND1是次生壁合成的關鍵調控因子，雙突變體植株不能直立生長；而在擬南芥中表達在楊樹中的同源基因以及桉樹中的同源均能夠恢復互補雙突變體纖維的垂莖表型（Pendent Stem），并且激活次生壁合成基因的表達[16]。巨桉中含有189個NAC成員，但它們在木材形成中的功能得到驗證的極少。SUN等[8]發現在擬南芥中過表達巨桉基因后植株的木質素含量和木質部面積均增加，木質素合成基因的表達水平也升高，說明作為正調控因子參與了木材形成過程中木質素的合成，但在擬南芥中的同源基因為，其功能是負調控葉片衰老。由此可見，發揮了與其擬南芥同源基因不同的功能。為了獲得更多的參與桉樹木材形成的NAC轉錄因子，本研究從尾巨桉中克隆了一個NAC轉錄因子，其編碼蛋白N端含有一個保守的NAC結構域，包含5個亞結構域。系統進化分析顯示與EugNAC007親緣關系較近的巨桉、楊樹中的成員的功能尚不明確，但與之關系較近的擬南芥的功能已知，其功能為調控細胞分裂[14]。因此，本研究推測可能參與調控木材形成過程中細胞分裂過程，但需要進一步驗證。

木本植物的生長包括初生生長（縱向生長）和次生生長（徑向生長）兩個部分。初生生長來源于頂端分生組織（Shoot Apical Meristem, SAM）和原形成層，促使根與枝條增長，次生生長則使植株周長增加，形成木材（次生木質部）。植株主莖從頂端到基部反應了植株由初生生長向次生生長的轉變。為了驗證該基因在木材形成中發揮功能，本研究檢測了在主莖不同節間的木質部中的表達變化。以葉片為參照，該基因在不同發育程度木質部中的表達水平顯著升高，表明該基因主要在木材形成組織中發揮功能。比較不同節間的基因表達水平，發現該基因在第三節間的表達水平最高，但是各節間的表達水平差異不顯著。在第三節間表達水平最高的原因可能是由于該節間處于由初生生長向次生生長轉變的過程，但需要進一步通過解剖結構觀察驗證。

為了明確基因表達對植株生長的影響，本研究構建了基因過表達的84K楊轉基因遺傳材料。發現過表達后轉基因植株的生長受到影響，主要表現為植株株高顯著低于野生型，這可能是由于過表達后擾亂了植株細胞的正常分裂，使植株生長受限。本研究暫未發現植株直徑生長受到明顯影響，這可能是由于觀察時間較短，植株在次生生長上的差異尚不顯著。綜上所述，本研究獲得了一個桉樹轉錄因子基因，其表達水平對植株株高生長產生了一定影響，可能通過調控細胞分裂的形式參與木材形成過程，但具體作用途徑和機制待進步一研究。

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Cloning and Preliminary Functional Analysis of theGene in×

HE Shae, OUYANG Linnan, YANG Jiaqi, ZHENG Jiaqi, CHEN Shaoxiong*

(Research Institute of Fast-growing Trees, Chinese Academy of Forestry, Zhanjiang 524022, Guangdong, China)

To identify key NAC transcription factors involved in wood formation, a NAC transcription factor geneof the clone DH32-29 of×was cloned based on RNA sequencing data and its function analyzed. The coding DNA sequence length of thegene was found to be 1 711 bp and encodes an acidic protein with 569 amino acid residuesofmolecular weight of 64.32 KD. The EugNAC007 protein contained a typical NAC domain at the N terminus and shared relatively high homology with theNAC with TRANSMEMBRANE MOTIF1 (AtNTM1) that regulates cell division. The results of RT-qPCR showed thatwas predominantly expressed in xylem tissues. Overexpression ofin poplar suppressed growth of tree height. These results indicated that themay participate in the processes of wood formation through the regulation of cell division, but the regulation mechanism is still unclear. This study advanced deep excavation of NAC transcription factors involved in wood formation processes in.

; NAC transcription factor; gene cloning; gene function

10.13987/j.cnki.askj.2023.04.001

Q785

A

廣東省基礎與應用基礎研究基金聯合基金（2020A1515110931）；中國林業科學研究院基本科研業務費專項（CAFYBB2021MA010）

何沙娥（1983— ），女，博士，主要從事林木遺傳改良研究。E-mail: cerchese@caf.ac.cn

陳少雄（1965— ），男，博士，研究員，主要從事人工林定向培育技術研究。E-mail: sxchen01@163.com