食品微生物檢驗中流式細胞術的研究進展

高惠敏，顏春榮，徐春祥，方 昕

食品微生物檢驗中流式細胞術的研究進展

高惠敏，顏春榮，徐春祥，方 昕*

（江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇 南京 210008）

食品微生物是影響食品安全的重要因素之一。采用新型快速檢測方法及時發現食品安全隱患、迅速采取相應措施，有助于提高食品安全監管效率，確保食品安全。流式細胞術可用于食品微生物區分死活、計數、種群鑒定等多參數定性和定量分析，為解決平板檢測方法時效性不足、難以區分死活、無法檢測非培養性微生物等問題提供了新思路。筆者就流式細胞術在食品微生物檢測領域的研究和應用做了概括總結，詳細介紹了流式法檢測的試驗流程、關鍵影響因素和研究進展，并對該方法在應用中存在的問題做了探討和分析，以期為流式法在食品微生物檢測領域的廣泛應用提供參考，確保食品安全。

流式細胞術；食品微生物；快檢；監測

食品微生物污染一直是食品安全監測的重點方向。國家標準中對食品微生物的檢測過程主要包括微生物的培養、分離和生化鑒定等。傳統的檢測方法費時費力，難以應用于要求快檢的場景[1]。同時，該方法也不能快速檢出不可常規培養的微生物，存在一定程度的漏檢。為了防止病原微生物的傳播，滿足食品安全監管需要，對食品微生物新型快速檢測方法的需求日益迫切。流式細胞術（flow cytometry，FCM）是一種同時通過散射光和熒光檢測進行單細胞分析的技術，可用于食品微生物區分死活、計數、種群鑒定、分選等多參數定性和定量分析，且分選后的微生物能直接用于單細胞培養和生化鑒定[2]。對于解決方法時效性不足、難以區分死活、無法檢測非培養性微生物等問題，提供了新手段。

流式細胞術起源于19世紀30年代。1934年，Moldaven最早使用流式細胞術光電法進行細胞計數。1940年，Davey等[3]將流式細胞術成功用于空氣中細菌孢子的檢測。1973年，BD公司（Becton，Dickinson and Company）研發并生產了世界上第一臺商用流式細胞儀。之后隨著光學技術進步、熒光染料的發展等，流式細胞術廣泛應用于臨床醫學研究和疾病的診斷檢測中[4-6]。相對于在醫學檢測研究中的重要地位，流式細胞術在食品安全檢測領域的應用還不夠成熟。筆者就流式細胞術在食品微生物檢測中的應用現狀進行歸納分析、厘清研究思路，以期為該技術在食品安全檢測領域的廣泛應用提供參考。

1 流式細胞術微生物檢測原理和關鍵影響因素

理論上，流式細胞術可以分析任何懸浮單顆粒物質的理化性質[7]。流式細胞儀主要包括以下部分：液流系統、光源系統、檢測系統、計算與分析系統[2]。流式細胞儀通常以激光作為發光源。經過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產生散射光和激發熒光。散射光信號分為前向散射（Forward scattering，FSC）和側向散射（side scattering SSC），FSC反映細胞或微粒體積的大小，SSC反映細胞或微粒內部結構的復雜程度。熒光信號強度代表細胞表面抗原的濃度或細胞內物質（如核酸）的濃度。這些光學信號被光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）接收并轉換為電信號輸入到分析系統中（圖1）。不同類型的細胞直徑、豐度、結構、性質不同，它們產生的熒光信號和散射光信號也不同。因此通過流式細胞儀結合特定的熒光標記可以實現對不同類型細胞的分析和分類[1,8-9]。

A：液流系統；B：光源系統；C：檢測和計算、分析系統

1.1 食品樣品制備

樣品基質直接影響流式細胞術對微生物的檢測結果。傳統食品微生物檢測無論是液體樣品還是固體樣品，多采用均質、混勻后稀釋處理，隨即進行平板培養等后續檢測[10-11]。樣品處理簡單，但后續培養和鑒定耗時較長且檢測通量受限。流式細胞術可以對微生物實現快速、多參數的精確測量，但對樣品處理的要求較高。樣品懸液在進入流動室前，需經過均質、過濾、離心等處理過程。根據食品基質的復雜程度和熒光標記原理的不同，有些還需進行酶解、微生物預富集等處理。經處理后的樣品懸液一方面避免了流式細胞儀噴嘴堵塞，另一方面可以降低樣品基質引起的背景干擾。

流式細胞術較早用于液體基質食品微生物檢測，如對生乳中菌落總數的檢測、發酵乳中乳酸菌的檢測及發酵酒中酵母的實時監測等。葡萄酒中的碎屑、水樣中的藻類和礦物質等具有高背景自發熒光，牛奶中的蛋白質膠束可能與所使用的熒光生物試劑非特異性結合，以上基質中的干擾物都會影響最終測定，造成結果的假陽性或假陰性。過濾器過濾可有效降低樣品中大顆粒干擾。Maukonen等[12]將益生菌飲料依次過40 μm和20 μm過濾器過濾并懸浮在PBS緩沖液中，用以避免食品基質顆粒引起的檢測偏差。De Bellis等[13]在驗證一款適用于酒中酒香酵母監測的流式細胞快速檢測試劑盒中發現，樣品經PBS稀釋后過30 μm過濾器且經過多次離心懸浮，可有效去除樣品中的碎屑干擾，提高熒光標記的抗體結合率[13]。牛乳樣品的前處理關鍵點是消除蛋白質、體細胞和脂肪的干擾[14]。使用蛋白酶（蛋白酶K、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、savinase酶等）降解大分子蛋白，用Triton X-100裂解牛乳中的體細胞，通過離心完成脂肪的分離[15]。使用該方法對牛乳中大腸桿菌O157﹕H7進行流式定量檢測，檢測范圍在104～108CFU/mL，與平板計數方法基本一致，但檢測時間縮短至1 h內[16]。果汁中的果肉顆?？赡芎泻怂岱肿?，通過核酸染色的方法無法將果肉顆粒與細菌區分，造成流式檢測結果不準確。He等[17]在樣品前處理階段使用纖維素酶水解植物細胞壁中的纖維素，再通過多次洗滌去除植物殘留的細胞和碎屑片，實現了果汁樣品中細菌的較高回收率[17]。茉莉綠茶飲料中含有大量的鎂離子等許多礦物質，干擾PicoGreen熒光染料對DNA的染色。Yu等[18]在茉莉綠茶中加入1.0 mmol/L二價離子螯合劑EDTA，用于阻斷鎂離子對PicoGreen染色的干擾。結果表明，經EDTA處理后，PicoGreen染色結合FCM分析適用于茉莉綠茶飲料中細菌總數檢測[18]。

相較于液體基質食品微生物檢測，通過流式細胞術對固體基質中微生物的檢測技術還不夠成熟，這主要是因為難以排除固體基質中較高含量蛋白、碳水化合物等物質的干擾。固體樣品中的碳水化合物、膳食纖維、蛋白等物質會引起特異性吸附干擾檢測[19]。肉類和乳制品中的脂肪、高蛋白顆粒會干擾抗體識別結合。水果、蔬菜經均質處理后，可能會釋放干擾檢測的酶或抗菌成分。另外，生食樣品中的原生菌群會干擾特定食源性致病菌的檢測[20-21]。除液體樣品中常用的均質、過濾和離心等分離手段外，采用一定的富集方式增加待測微生物濃度，可以提高流式細胞術分析法的檢測靈敏度、降低檢測下限[22]。研究者在乳粉中致病菌的流式細胞術檢測中，優化了樣品的富集時間。結果發現，將樣品在相應培養基中分別預培養5 h和6 h后再加入蛋白酶K和Triton X-100處理樣品，可以保證流式細胞儀檢測到所有待檢樣品中單個活的沙門氏菌或金黃色葡萄球菌細胞[23-24]。樣品預富集在熒光原位雜交-流式細胞術（Fluorescence in situ hybridization-Flow cytometry FISH-FCM）檢測肉及肉制品中致病菌研究中尤其重要。預富集可以增加細胞內核糖體的豐度，提高熒光探針與靶rRNA的特異性結合。研究者分別在60份來源不同的豬肉香腸中添加107CFU/mL腸道沙門氏菌（），用于比較預富集和直接檢測之間的靈敏度差異。結果發現，在預富集的新鮮樣品和加標樣品中，傳統平板培養和FISH兩種方法的檢測靈敏度都高于非富集樣品[25]。使用兩步法對生肉和熟蝦中的單增李斯特菌進行預富集（24 h+18 h），PNA-FISH（peptide nucleic acid fluorescence-FISH，肽核酸-FISH）法對食品中單增李斯特菌的檢測限可降低到0.5?CFU/25?g[26]。以上預富集方法可為FISH-FCM快速定量檢測肉中的致病菌提供技術參考。預富集也可以提高免疫熒光標記-FCM法在牛肉碎、生菜、草莓、菠菜等食品中致病菌特異性檢測的靈敏度[22,27-28]。另外，磁分離技術也可用于捕獲和富集食品中低豐度致病菌[29]。但是該方法無法排除死菌的干擾，同時對磁珠的特異性和質量穩定性要求較高，目前還未大范圍使用。

綜上所述，針對液體基質食品中微生物的檢測多通過均質、酶解、過濾和離心即可實現定性或者定量分析（表1），而針對固體基質微生物尤其是致病菌的檢測則需要經過預富集手段才能完成，這一方面是由于固體基質復雜成分對微生物的吸附和干擾較大，另一方面根據監測經驗，樣品中致病菌的量一般低于102CFU/mL，而目前市場上多數流式細胞儀在103CFU/mL以上具有更準確的檢測結果。

表1 液體基質食品中常用樣品前處理方法

1.2 熒光標記選擇

與真核生物細胞相比，細菌等微生物的體積較小，其散射光難以與其他物質的顆粒區分。因此，通過流式細胞儀的檢測依賴于與細胞結合的熒光染料，用于從背景中識別真正的目標物。根據熒光底物的不同，適用于流式檢測法的熒光染料主要包括：結合核酸的染料，如SYTO系列、PI、PicoGreen等；標記抗體蛋白的染料，如FITC、PE、納米半導體顆粒量子點等[30]。不同的熒光染料具有不同的激發波長和發射波長。流式細胞儀通常會配備多個激光器，如488 nm、633 nm和405 nm等。多激光器可實現多熒光通道分析，減少自發熒光干擾、減少熒光信號之間的補償，提高檢測靈敏度。食品微生物流式檢測法中常用的熒光標記及特點見表2。

表2 食品微生物流式檢測中常用的熒光染料信息[30]

熒光標記的選擇與研究目的相關，如使用PI或7-AAD單染即可實現牛乳中細菌總數的快速檢測[14-15]。7-AAD發射光譜比PI窄，更適用于多色熒光分析。為了進一步排除非生物干擾，提高檢測靈敏度。目前常使用雙染法用于活菌計數、細胞活性監測、細胞膜完整性監測等研究。鄭亦舟等[31]使用核酸染料SYTO 24和PI雙染法建立了發酵乳飲料中的保加利亞乳桿菌活性監測方法。熒光素類染料cFDA相對于SYTO染色更穩定、被標記后的熒光持續時間更長。姜凱等[32]利用cFDA和PI染料的細胞膜透性不同，建立了基于cFDA染色法的流式細胞術快速檢測乳酸菌方法。流式細胞術中食源性致病菌的特異性檢測多通過結合分子生物學（熒光原位雜交或核酸適配體）或免疫學技術實現。熒光原位雜交基于熒光標記的寡核苷酸探針識別細菌特異的16S rRNA，結合流式細胞術對細菌進行定量檢測。核酸適配體具有特殊的三維結構能夠特異性結合靶物質，是一類從寡核苷酸文庫中篩選出的單鏈核酸小分子。用于寡核苷酸標記的染料通常包括羅丹明類（羧基四甲基羅丹明（TAMRA）、四甲基羅丹明-5-異硫氰酸（TRITC）等）、Texas red、菁染料Cy3和Cy5等[33-34]。新一代熒光標記還包括Alexa Fluor（Alexa488、Alexa Fluor 568、Alexa647等）染料和量子點（納米晶體顆粒）[35-36]。熒光素類染料FITC則廣泛用于抗體蛋白的標記，FAM、TET更側重于核酸探針的標記[37]。

另外，流式細胞術熒光標記的選擇還需考慮儀器配置的光源波長、染料的亮度與靶標表達量的匹配、染料光譜重疊和樣本自發熒光等多重因素。

1.3 儀器主要參數設置

流式細胞儀參數的設置也是影響流式檢測結果的重要方面[38]。在流式檢測樣品上機時，首先要調節每個通道的電壓。電壓調節準確既可以放大信號，又能區分信號強弱不同的細胞。通常使用空白管細胞調節電壓，即FSC和SSC的電壓。通過調節FSC/SSC電壓，使待檢細胞清晰聚集于流式圖的中央或者靠近中央的位置。如目標細胞體積較小，則適當提高電壓值，使目標細胞與碎片在流式圖中能夠完全分離；如目標細胞體積較大，則適當降低電壓值，使所有的目標細胞群完整顯示于流式圖中。有些微生物（如酵母細胞）散射光強度較大，無法通過調節FSC電壓完全聚集于流式圖中，則需要增加衰減片，降低熒光強度，避免散點圖中目標細胞“壓邊”現象導致的測量誤差。另外還要調節每個熒光通道的電壓，每個熒光的單染管分別上機調節，使陽性細胞群和陰性細胞群盡可能的分離。當使用兩種或兩種以上熒光標記時，由于某些熒光染料存在較寬的發射光譜，通過檢測器檢測時即使已經選擇了合適的濾光片，不同熒光染料間仍可能存在發射光譜的重疊。因此在使用多熒光標記時還應注意調節各熒光通道的補償。補償值的大小受儀器型號、染料性質和微生物種類的影響。

多數流式細胞儀用于檢測真核細胞，而細菌大小是細胞的千分之一或更小，更易受到雜質干擾，因此閾值（threshold）的設置對食品微生物的準確檢測尤為重要。合理的閾值可以避免基質背景、細胞碎片和電子噪音的干擾。閾值太低，背景或者細胞碎片干擾太大；閾值太高，則會造成目標微生物部分丟失、檢測不完全。流式細胞儀對微生物的檢測主要通過設定FSC/SSC閾值實現目標菌的分群。閾值可以根據陰性對照管來調節。閾值的設置是一個經驗數值，需根據實際實驗情況調節。

圈門（gate）是流式數據分析的第一步，即在流式圖中確定一個范圍，通過逐級圈門對感興趣的細胞進行單參數或多參數分析，獲得門內細胞的百分比等參數。門的設定形狀任意，常見的是根據閾值設門、散射光設門和熒光設門等。設門是主觀行為，應盡量考慮到以下因素以減少主觀判斷帶來的誤差：（a）排除細胞碎片，（b）選擇合適的熒光陰性對照，（c）排除死細胞。

由于食品微生物非常小，普遍在0.1 mm以下，難以與樣品基質和細胞碎片等干擾區分，因此與細胞檢測相比，通過流式細胞儀的微生物檢測對儀器參數的設置要求更高。在對微生物定性或定量檢測前，需仔細調節儀器電壓、閾值和熒光補償等參數，確保結果的一致性和準確性。

2 流式細胞術在食品安全領域的應用

流式細胞術在微生物分析中有著廣泛應用，范圍可從單細胞分析擴展到群落水平分析[39]。在食品微生物檢測中，流式細胞術既能在一定濃度范圍內替代平板培養法，對微生物進行快速數量測定、活性檢測、特異性檢測等，還可對活菌和死菌進行區分，對生長緩慢和活的非可培養狀態微生物進行定量檢測。

2.1 實時監控食品質量

基于流式細胞術的微生物計數和生存能力分析有助于快速檢測食品微生物污染，加快食品生產過程中的質量評估以及對貨架期食品進行品質監控。該技術已在發酵食品、乳制品等領域使用[12-13,40]，用于指導實施質量控制。布魯塞爾德克酵母（）能對酒的風味產生影響，在釀酒生產中扮演著重要角色。Branco等[41]設計了1種新型的DNA-FISH探針，借助流式細胞儀對葡萄酒微生物以及葡萄酒環境中的布魯塞爾德克酵母進行快速特異性檢測和鑒定。該方法有助于生產者在葡萄酒變質前識別布魯塞爾德克酵母、控制酒的風味，防止葡萄酒行業遭受經濟損失[41]?；诹魇郊毎g的計數和細胞活力測定還能為益生菌產品的開發和質量評價提供有效的技術工具[42-43]。Chiron等[43]結合多克隆抗體，建立了基于流式細胞術的5種益生菌菌株的特異性定量檢測方法，該方法可在極短的時間內（<2 h）對益生菌菌株進行定量分析。與經典平板培養技術相比，該方法不僅縮短了檢驗時間，還能對密切相關的菌株進行詳細區分，提高了檢驗效率和分辨率。

2.2 特異性定量檢測食源性病原微生物

食源性病原體每年在全球范圍內導致數百萬人感染，并造成相當大的經濟損失。目前經典的平板培養技術仍是檢測食品中細菌病原體的金標準，但這些方法耗時且不能快速提供有關食品污染的信息，不足以滿足食品安全防控快速篩查需求。流式細胞術具有速度快、精度高、準確性好等優點適合食品中致病菌的快速檢測[21-29,44]。Shepelyakovskaya等[45]開發了1種基于流式細胞術的葡萄球菌腸毒素快速檢測方法。該方法使用磁珠可以同時捕獲3種葡萄球菌腸毒素并進行多重檢測，可用于同時檢測和定量分析各種肉類和奶類產品以及煎蛋中的毒素。Xue等[46]通過設計靶向16S rRNA序列的熒光標記寡核苷酸探針，建立了1種改進的基于快速流式細胞術的大腸桿菌檢測方法。該方法可在2 h內同時檢測20多批樣品，并能在大量沙門氏菌干擾的情況下，檢測到30～40個/mL大腸桿菌細胞，具有較高的靈敏度和特異性。目前該方法已被Wiley實驗室指南（Current Protocols）收錄，用于指導食品中大腸桿菌的快速檢測。

2.3 識別活的但不可培養（VBNC）微生物

流式細胞術還能克服微生物學研究的一大障礙，即分析活的但不可培養（viable but non-culturable，VBNC）微生物。食品加工過程的環境壓力，如溫度變化、pH值或營養素缺乏，會誘導細胞進入VBNC狀態。處于VBNC狀態的微生物通常具有新陳代謝活性，且具有致病性和毒性。VBNC狀態的微生物在一定條件下可復蘇并能再次培養，存在潛在的食品安全風險[47-48]。傳統的基于培養的微生物分析可能導致對產品微生物狀態的低估或誤判。使用流式細胞術對微生物VBNC狀態的快速、實時監測可為制訂、跟蹤和改進食品安全質量控制提供數據支持[49]。結合優化的染色方案，流式細胞術已成功用于監測細菌的生理狀態，包括對不同狀態下的細菌（活的不可培養、活的可培養、死細菌）進行分別計數和比例統計，該方法可快速、準確、無偏見評估生物體對環境壓力的響應[50-51]。Yu等[18]通過使用高靈敏度流式細胞儀（HSFCM）進一步降低了雜質顆粒的背景信號，在30 min內即完成了對桶裝飲用水和茉莉綠茶飲料中VBNC細菌、活細菌和死細菌的區分和定量分析。因此，在VBNC細菌的鑒別和定量上，流式細胞術能節省大量時間，較其他實驗手段具有明顯優勢，值得在食品安全領域的研究中采用。

3 結 語

綜上所述，流式細胞術克服了平板法檢測周期長、檢測復雜等缺點，同時能對微生物的活性進行鑒定，對于食品樣品質量評估、微生物污染監測等都具有重要意義。但目前流式細胞術對食品微生物的檢測還存在局限性，建立快速、便捷、可靠的流式檢測方法建議從以下兩方面進行優化：（1）建立不同基質食品樣品前處理標準操作流程，降低食品基質對微生物的吸附及背景干擾；（2）開發微生物富集技術和用于特異性病原微生物標記的探針，進一步提高流式法對食源性致病菌的檢測靈敏度。微生物富集技術如Pathatrix微生物富集純化系統、用于食源性病原體傳感的生物親和性納米探針[52]等新興技術的快速發展將為可靠流式方法的建立提供助力。

通過流式細胞術對微生物的檢測大大縮短了檢測時間、提高了檢測效率，為微生物快檢提供了有效技術手段。但由于食品樣品基質復雜，以及流式細胞術對微生物的檢測多與分子生物學、免疫學等技術結合，在我國流式細胞術并未常規用于分析和監測液體和固體食品的微生物污染。但流式細胞術具有的檢測速度快、可同時進行多參數定性和定量分析等優點，使其已成為食品微生物檢測領域最有前途的工具，優化和推廣該技術將為主動發現食品安全風險、有效預防和控制食品安全問題提供有力技術保障。

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Research Progress of Flow Cytometry in Food Microbiology Detection

GAO Huimin, YAN Chunrong, XU Chunxiang, FANG Xin*

（Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210008, China）

Food microorganisms are one of the important factors affecting food safety. The adoption of new rapid detection methods to promptly identify food safety hazards and then to take corresponding measures can help improve the efficiency of food safety supervision and ensure food safety. Flow cytometry can be used for multi-parameter qualitative and quantitative analyses of food microorganisms, such as distinguishing between the dead and alive, counting, and population identification. It provides a new approach to solve the problems of insufficient timeliness, difficulty in distinguishing between the dead and alive, and inability to detect non cultured microorganisms in the plate detection methods. This article provides a summary of the research and application of flow cytometry in the field of food microbiology detection. It also provides a detailed introduction to the experimental process, key influencing factors, and research progress of flow cytometry detection. Besides, it explores and analyzes the problems existing in the application of this method, in order to provide strategies for the widespread application of flow cytometry in the field of food microbiology detection, so as to ensure food safety.

flow cytometry; food microorganism; rapid detection; monitoring

10.3969/j.issn.2095-3704.2023.04.80

TS207.4

A

2095-3704（2023）04-0549-08

2023-11-02

2023-11-16

江蘇省市場監督管理局科技計劃項目（KJ21125094）

高惠敏（1985—），女，高級工程師，博士，主要從事食品安全方面的研究，ghmghm2003@163.com；*通信作者：方昕，高級工程師，碩士，nancy1924@163.com。

高惠敏, 顏春榮, 徐春祥, 等.食品微生物檢驗中流式細胞術的研究進展[J]. 生物災害科學, 2023, 46(4): 549-556.