馬唐生防真菌MA4的分離鑒定及其生物學特性

舒 攀，左 瑤，李建勇，蔡海林*，劉 敏*

馬唐生防真菌MA4的分離鑒定及其生物學特性

舒 攀1，左 瑤1，李建勇2，蔡海林2*，劉 敏1*

（1. 湖南農業大學 植物保護學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南省煙草公司長沙市公司，湖南 長沙 410011）

【目的】篩選防治馬唐（）的生防真菌，挖掘其應用于雜草生物防治的潛力?！痉椒ā坎捎媒M織分離法，從自然發病的馬唐植株中分離出對馬唐具有較強致病力的生防菌株，通過形態學觀察、、、基因序列同源性比對及其系統進化分析確定其分類地位；利用單因素試驗研究其生物學特性及整株生物測定法測定馬唐生防真菌對幾種常見雜草的侵染效果及對常見作物的安全性?！窘Y果】分離得到的馬唐生防真菌MA4被鑒定為藤倉鐮刀菌（）；最適合MA4生長的培養基為PDA和PSA；最適合MA4生長和產孢的培養條件為：溫度28～30 ℃，pH值6.0～8.0，黑暗培養；MA4對馬唐鮮重防效較好，達到91.4%，對看麥娘、狗尾草和鉆形紫菀的鮮重抑制率分別為63.8%、80.6%、69.4%；MA4對雙子葉作物相對安全?！窘Y論】藤倉鐮刀菌MA4菌株對馬唐等禾本科雜草防治效果較好，對雙子葉作物較安全，具有開發成生物除草劑的巨大潛力。

馬唐；藤倉鐮刀菌；生物防治；生物學特性

【研究意義】馬唐（）是一種主要為害玉米、豆類、棉花、花生等秋熟旱地作物的惡性雜草，嚴重影響作物的產量?；瘜W防治是目前防治馬唐的主要手段[1]，而隨著化學除草劑的長期使用，也帶來了諸如環境污染、農產品農藥殘留、雜草抗藥性上升等負面影響。相對于化學除草劑，微生物除草劑具有環境友好、對作物安全性高、雜草不容易產生抗性等特點[2]，因此研究和開發微生物除草劑具有廣闊的前景?！厩叭搜芯窟M展】植物致病微生物理論上來講都有開發成為生物除草劑的潛力，但在實際研究與應用中，真菌被研究更多。目前已經有報道多種真菌具有被開發成為生物除草劑的潛力，如鐮刀菌屬（）、尾孢霉屬（）、莖點霉屬（）、交鏈孢菌屬（）等[3]。羅文芳等[4]從自然發病番茄列當上分離得到了一株列當生防真菌交鏈格孢（）JTF001；吳兆圓等[5]報道了一株防除馬唐的鏈格孢菌（）；張亞鑫等[6]分離得到了對稗屬雜草具有強致病力的新月彎孢（）、尖角突臍蠕孢（）等10株生防菌株；鐘加日等[7]分離得到了一株稗草生防菌新月彎孢菌（）NX2A；李健等[8-9]報道了用于防除稗草的露濕漆斑菌（）和防除馬唐的厚垣孢鐮刀菌（）；俞雯雯等[10]報道了一株具有雜草生防潛力的嘴突凸臍蠕孢菌（）；陸俞萍等[11]發現木賊鐮刀菌（）、再育鐮刀菌（）、狗尾草平臍蠕孢（）、間型彎孢（）和新月彎孢（）5種病原菌具有開發成防除茶園雜草生物除草劑的較好潛力；王偉等[12]從土壤中分離得到一株球孢白僵菌（），其對野燕麥具有較好生物活性。也有研究人員報道細菌可以用于雜草生物防治。Yang等[13]從海水中得到一株黏質沙雷氏菌（），發現其對馬唐有較好的活性；李鑫等[14]進一步測定了黏質沙雷氏菌菌株對玉米田雜草的活性，發現其對玉米田雜草反枝莧、馬唐、苘麻、牽牛、稗草、虎尾草均有一定的防除作用，對反枝莧和馬唐效果最佳?！颈狙芯壳腥朦c】馬唐對常用化學除草劑抗藥性水平急劇上升，因此開發環境友好的非化學除草劑方法，可為馬唐的科學防控提供新的選擇與參考?！緮M解決的關鍵問題】本試驗擬以田間自然發病的馬唐植株為研究對象，采用組織分離法分離得到一株馬唐生防真菌MA4，通過形態學觀察、基因、微管蛋白基因和翻譯延伸基因分析確定其分類地位，并研究其生物學特性，可為微生物除草劑的挖掘與應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物：馬唐病葉采集自湖南農業大學耘園教學科研基地；馬唐、牛筋草等雜草種子均為本實驗室采集并保存；水稻、玉米等作物種子均購自隆平高科種業有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水定容至1 000 mL；馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PSA）：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL；燕麥瓊脂（OA）培養基：燕麥片30 g，蒸餾水定容至1 000 mL；馬唐汁液培養基（CAJ）：馬唐汁液200 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL；水瓊脂培養基（WA）：瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 馬唐生防真菌的分離與鑒定

1.2.1 馬唐生防菌的分離與純化 用無菌水將自然發病的馬唐葉片漂洗干凈，沿病健交界處剪成小塊，將組織小塊置于5%次氯酸鈉溶液和70%乙醇溶液中分別進行表面消毒60 s和30 s，表面消毒后的馬唐葉片組織用無菌蒸餾水漂洗3～4次以徹底清除組織表面殘留的消毒劑，隨后將馬唐葉片組織塊置于滅菌的培養皿內，于超凈工作臺內吹干。將吹干后的馬唐葉片組織置于滅菌的PDA平板上，置于28 ℃恒溫培養箱內培養，待長出真菌菌落后用滅菌的接種針挑取菌絲至新的PDA平板內，產孢后挑取單孢子進行純化得到純培養菌株，命名為MA4。將MA4回接至表面消毒的健康馬唐葉片，觀察發病狀況，并從馬唐葉片病健交界處再次分離病原菌，以驗證柯赫氏法則。

1.2.2 形態學鑒定 將菌株MA4在PDA平板上培養7 d，期間觀察并記錄其菌落形態。同時用無菌水將培養基表面的分生孢子洗下，制成分生孢子懸浮液，顯微鏡下觀察菌株 MA4的分生孢子形態；對照魏景超[15]編著的《真菌鑒定手冊》對菌株MA4進行形態學鑒定。

1.2.3 分子生物學鑒定 采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取MA4菌株基因組DNA，采用通用引物ITS4/ITS5，Bt2a/Bt2b和EF728F/EF986R分別對MA4菌株基因、微管蛋白基因（）及翻譯延伸因子基因（）進行PCR擴增，PCR擴增產物經回收后將其送往上海生物工程有限公司進行測序。將測序所得序列登陸NCBI（national center for biotechnology information），通過GenBank中BLAST功能基因序列比對，根據比對結果選取合適序列，利用MEGA 7.0軟件分別構建系統發育樹。結合形態學鑒定和分子鑒定結果，確定MA4菌株的分類地位。

1.3 馬唐生防菌的生物學特性

1.3.1 培養基對MA4生長的影響 用PDA培養基活化保存的菌株5 d后，在菌落的邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，接種到各種供試培養基上，9 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，并用無菌水洗脫分生孢子，稀釋后用血球計數板計數。

1.3.2 溫度對MA4生長的影響 以PDA培養基為基礎培養基，接菌后將溫度條件設置為15，20，25，30，35 ℃，測定溫度條件對菌株生長的影響，接菌9 d后，測定菌落直徑及分生孢子數量。

1.3.3 pH值對MA4生長的影響 將PDA培養基滅菌后調制成不同pH值，設置的pH值為4，5，6，7，8，9，10，參照1.3.1的方法，25 ℃黑暗條件下培養9 d后，測定菌落直徑和分生孢子數量。

1.3.4 光照對MA4生長的影響 以PDA培養基為基礎培養基，接菌后光照條件設置為0 h/24 h，8 h/16 h，12 h/12 h，16 h/8 h，24 h/0 h共5個處理，測定光照條件對菌株生長的影響，接菌9 d后，測定菌落直徑及分生孢子數量。

1.3.5 對常見雜草的抑制效果 將MA4接種于PDA平板培養基，25 ℃、黑暗培養9 d后，收集孢子并配制成濃度為2.0×108個／mL的孢子懸浮液（含0.03%的吐溫80）。將孢子懸浮液噴施3～4葉期稗草、馬唐和狗尾草等雜草植株上，28 ℃、黑暗保濕培養2 d后，持續光照培養，觀察菌株的致病特性。以噴施0.03%吐溫80的植株為對照，每個處理設置3次重復。14 d后測定雜草發病率，并計算MA4對不同雜草的鮮重抑制率。

發病率=（生防菌侵染雜草數/供試雜草總數）/供試雜草總數×100%（1）

鮮重抑制率=（對照組雜草鮮重-處理組雜草鮮重）/對照組雜草鮮重×100%（2）

1.3.6 對常見作物的安全性測定 將MA4菌株接種至新鮮PDA平板培養9 d，用無菌水清洗并收集分生孢子，將濃度為2.0×108個/mL的MA4分生孢子懸浮液分別噴施于3～4葉期的水稻、玉米、大豆等作物植株上。接種14 d后記錄不同作物發病程度，并測定MA4分生孢子懸浮液對不同作物的鮮重抑制率。參考李永龍等[16]的方法，按以下標準記載發病程度：NS表示無癥狀（一直無病斑，植株正常生長）；LS表示有輕微反應（初期葉片分布零星斑點，14 d后鮮重不受抑制）；MS表示中等感?。ㄈ~面出現較多病斑，14 d后鮮重受到抑制）；SS表示嚴重感?。ㄈ~片病斑連成一體，14 d后鮮重受到嚴重抑制）。

1.4 數據分析處理

利用SPSS統計軟件分析不同處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 馬唐生防真菌的分離與鑒定

馬唐生防菌MA4菌株在PDA平板上形成白色絮狀菌落，菌絲緊密，菌落邊緣規則。在培養初期形成橢圓形小型分生孢子，培養后期形成鐮刀型大型分生孢子（圖1）。根據形態學特征，將MA4菌株初步鑒定為鐮刀菌。

圖1 MA4菌落及分生孢子形態

將擴增得到的MA4菌株、、基因序列提交到NCBI數據庫（序列號分別為MN088607，MN096557，MN096556），BLAST比對結果顯示，MA4菌株、、基因序列與來自藤倉鐮刀菌的基因序列MK192049、基因序列LT575105及基因序列KM514487的同源性分別為100%、100%、99%?；?、、基因序列構建的系統發育樹（圖2，圖3，圖4）均顯示，MA4菌株與藤倉鐮刀菌處于同一分支。結合形態學及分子生物學結果，將馬唐生防菌MA4最終鑒定為藤倉鐮刀菌（）。

圖2 基于ITS基因構建的MA4系統發育樹

圖3 基于微管蛋白基因（β-Tubulin）構建的MA4系統發育樹

圖4 基于翻譯延伸因子基因（EF-1α）構建的MA4系統發育樹

2.2 培養基對MA4菌株生長的影響

菌株MA4在不同培養基上的生長情況如表1所示。由表1可知，MA4菌株在PDA培養基上長勢較好，生長速度較快，培養9 d后菌落直徑達到7.6 cm，在PSA培養基上的長勢和生長速度次之，但與PDA培養基相比差異不顯著；MA4產孢量方面，也以PDA培養基產孢效果最佳。

表1 不同培養基對MA4菌株生長的影響

2.3 溫度對MA4菌株生長的影響

培養溫度對菌株MA4生長的影響如表2所示。在PDA培養基上，MA4菌株在25，28，30 ℃條件下的菌落生長速度和產孢量均沒有顯著差異；當溫度低于25 ℃或高于30 ℃時，菌落生長速度和產孢量均顯著下降。

表2 溫度對MA4菌株生長的影響

2.4 培養基pH對MA4菌株生長的影響

培養基pH對菌株MA4生長的影響如表3所示。在PDA培養基上，MA4菌株在培養基pH=7條件下的菌落生長速度和產孢量最高，但和pH=6及pH=8處理間沒有顯著差異；當培養基pH超過6～8區間時，菌落生長速度和產孢量均受到顯著抑制，說明最適合MA4菌株生長和產孢的pH為6～8。

表3 培養基pH對MA4菌株生長的影響

2.5 光照時間對MA4菌株生長的影響

光照時間對菌株MA4生長的影響如表4所示。在PDA培養基上，光照時間長短對MA4菌株菌落生長速度沒有顯著影響，但對MA4產孢量影響較大，MA4菌株在黑暗條件下產孢效果最好，隨著光照時間的延長，MA4產孢受到明顯抑制。

表4 光照時間對MA4菌株生長的影響

2.6 致病廣譜性測定

致病廣譜性試驗結果表明：禾本科雜草中，MA4分生孢子液對馬唐的生防效果最佳，對馬唐的鮮重防效達到91.4%；對狗尾草防效次之，為80.6%；闊葉雜草中，MA4分生孢子液對鉆形紫菀鮮重防效69.4%，對小飛蓬、鐵莧菜、酢漿草生長幾乎沒有影響。

表5 菌株MA4孢子液對不同雜草的抑制效果

2.7 作物安全性測定

作物安全性測定結果表明，MA4分生孢子液對水稻和玉米的鮮重抑制率分別為39.7%和28.6%，表現為中等感??；對辣椒、番茄等雙子葉作物幾乎無影響。

表6 菌株MA4孢子液對不同作物的安全性

3 討 論

利用雜草致病微生物開發專一性強、對非靶標植物安全、環境兼容性好、安全性高的微生物除草劑，或利用雜草致病微生物的活性代謝產物開發微生物源除草劑，是當前雜草綠色防控技術體系的重要發展方向，符合可持續農業的發展要求。鐮刀菌是一類世界性分布的真菌，可侵染多種植物，引起莖腐、根腐、葉斑在內的多種病害[17]。由于鐮刀菌對營養要求不高，易于培養，發酵培養過長中易于形成大量分生孢子，因而被廣泛地應用于雜草的生物防治[18]。

鐮刀菌的鑒定非常復雜，傳統的單一序列同源性分析鑒定該屬真菌存在一定難度，一些相較于基因變異速率更快的保守基因片段（如、基因等）有助于精確鑒定鐮刀菌[19]。李祥等[20]從患病甘草根部分離得到雜草致病菌株GD-0221，通過形態學特征及序列分析將其鑒定為尖孢鐮刀菌（）。王亞嬌等[21]從感病彎管列當分離得到一株生防真菌，結合形態學特征及翻譯延長因子基因序列同源性分析，將其鑒定為尖孢鐮刀菌（），該菌同時兼具良好的促生作用。Daniel等[22]從感病雜草分離得到具有除草活性的鐮刀菌株，通過基因及翻譯延長因子基因序列同源性分析將其鑒定為藤倉鐮刀菌（）。本研究中綜合利用、、等3個基因片段的同源性分析及系統進化分析，將馬唐生防菌MA4最終鑒定為藤倉鐮刀菌（），結果可靠性較高。

雜草生防菌雖然具備了被開發為雜草生防制劑的潛力，但其能否被開發為微生物除草劑登記產品還受諸多因素限制，如營養條件、環境因素等。王亞嬌等[23]通過單因素試驗和正交設計試驗發現，列當生防菌層出鐮刀菌Br-1在最優培養條件下產孢量得到大幅提升，顯著提高了生防效果。楊瑩等[24]通過中心組合設計優化了出芽短梗霉菌（）PA-2菌株的發酵條件，發現優化后的培養和發酵條件可有效提高PA-2菌株的產孢量，降低發酵成本。本研究結果顯示，優化的培養條件可以顯著提升馬唐生防真菌MA4的產孢量。

生防菌株致病力和安全性是制約生物除草劑開發最關鍵的兩大因素。本研究分離得到的馬唐生防菌菌株藤倉鐮刀菌MA4對包括馬唐在內的幾種農田禾本科雜草有廣譜的除草效果，對禾本科作物有明顯的侵染現象，而對闊葉作物表現相對安全，因此MA4菌株有被開發成闊葉作物田防除禾本科雜草生物除草劑的潛力。

在后續的生防試驗中可通過生物除草劑制劑的制備以提高其生防效果穩定性，將其與低劑量禾本科雜草除草劑進行菌藥混合施用擴大其殺草譜，進一步挖掘其生防潛力，在保障環境友好的基礎上兼顧更高的防效。

[1] 杜浩, 劉學敏, 周勁松, 等. 馬唐的綜合防控研究進展[J]. 安徽農業科學, 2022, 50(8): 26-28.

[2] 李健, 李美, 高興祥, 等. 微生物除草劑研究進展與展望[J]. 山東農業科學, 2016, 48(10): 149-151.

[3] 陳世國, 強勝. 生物除草劑研究與開發的現狀及未來的發展趨勢[J]. 中國生物防治學報, 2015, 31(5): 770-779.

[4] 羅文芳, 何偉, 孫曉軍,等. 瓜列當致病真菌的鑒定及其發酵產物活性研究[J]. 植物保護, 2022, 48(3): 165-171.

[5] 吳兆圓, 任夢瑤, 張志剛, 等.NBERC＿H56菌株對馬唐的除草活性及其次級代謝產物的分離鑒定[J]. 湖北農業科學, 2021, 60(24): 98-100.

[6] 張亞鑫, 肖婉, 張崢, 等. 稻田稗屬雜草致病菌的分離與鑒定[J]. 中國生物防治學報, 2021, 37(6): 1276-1287.

[7] 鐘加日, 劉璐, 曾穎, 等. 稗草生防菌NX2A的鑒定、安全性及對稗草的致病條件[J]. 南方農業學報, 2022, 53(2): 469-476.

[8] 李健, 李美, 高興祥, 等. 稗草生防菌BC-1的分離及生物學特性研究[J]. 草業學報, 2016, 25(8): 164-171.

[9] 李健, 李美, 高興祥, 等. 馬唐生防真菌ZC201301的篩選及其致病力測定[J]. 山東農業科學, 2015, 47(6): 93-96.

[10] 俞雯雯, 袁炳欽, 馮汝晴, 等. 嘴突凸臍蠕孢菌作為微生物除草劑的潛力研究[J]. 南京農業大學學報, 2020, 43(4): 613-620.

[11] 陸俞萍, 肖婉, 房婉萍, 等. 幾種茶園雜草生防菌的分離鑒定[J]. 中國生物防治學報, 2021, 37(3): 564-574.

[12] 王偉, 程亮, 朱海霞, 等. 球孢白僵菌（）NO6的分離、鑒定與除草活性[J]. 西北農業學報, 2019, 28(2): 297-304.

[13] YANG J, WANG W, YANG P, et al. Isolation and identification ofHa1 and herbicidal activity of Ha1‘pesta’granular formulation[J]. Journal of integrative agriculture, 2015, 14(7): 1348-1355.

[14] 李鑫, 喬欣, 楊娟, 等. 黏質沙雷氏菌Ha1對玉米田雜草的室內除草活性測定[J]. 植物保護, 2021, 47(1): 292-296.

[15] 魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海: 上?？茖W技術出版社, 1979.

[16] 李永龍, 程亮, 朱海霞, 等. 出芽短梗霉菌菌株PA-2的除草活性及對作物的安全性[J]. 中國生物防治學報, 2014, 30(2): 232-238.

[17] 謝安娜, 徐浩飛, 張志林, 等. 致病鐮刀菌的研究進展[J]. 湖北工程學院學報, 2020, 40(6): 37-41.

[18] 李新, 謝明, 譚萬忠, 等. 雜草生防真菌的研究進展[J]. 中國生物防治, 2009, 25(1): 83-88.

[19] 王世偉, 王卿惠, 李小鵬, 等. 鐮刀菌分子鑒定與重要應用的研究進展[J]. 微生物學通報, 2018, 45(4): 907-919.

[20] 李祥, 朱海霞. 雜草致病菌株GD-0221的分離、鑒定與除草潛力[J]. 浙江農業學報, 2022, 34(9): 1967-1975.

[21] 王亞嬌, 紀莉景, 栗秋生, 等. 多功能列當生防鐮刀菌的篩選及種類鑒定[J]. 中國生物防治學報, 2016, 32(6): 788-793.

[22] DANIEL J J, ZABOT G L, TRES M V, et al.: a novel source of metabolites with herbicidal activity[J]. Biocatalysis & agricultural biotechnology, 2018, 14: 314-320.

[23] 王亞嬌, 紀莉景, 栗秋生, 等. 列當生防菌層出鐮刀菌Br-1發酵條件的優化及田間防治效果[J]. 中國生物防治學報, 2017, 33(5): 692-698.

[24] 楊瑩, 莊新亞, 程亮, 等. 出芽短梗霉菌PA-2發酵培養基及發酵條件優化[J]. 南方農業學報, 2019, 50(9): 1998-2008.

Isolation, Identification and Biological Characteristics of the Biocontrol Fungi MA4 for

SHU Pan1, ZUO Yao1, LI Jianyong2, CAI Hailin2*, LIU Min1*

（1. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Changsha Branch of Hunan Provincial Tobacco Company, Changsha 410011, China）

To screen biocontrol fungi ofand explore the potential of its application in weed biological control.The biocontrol strains with strong pathogenicity towere isolated from naturally diseased plants by tissue isolation method, and their taxonomic status was determined by morphological observation, sequence homology comparison and phylogenetic analysis of,andgene. Biological characteristics of the biocontrol fungi was determined by single factor test. Infection effect on several common weeds and safety to common crops were also determined by whole plant bioassay.The isolatedbiocontrol fungi named MA4 was identified as. The most suitable media for MA4 growth were PDA and PSA.The most suitable culture conditions for MA4 growth and spore production were temperature of 28-30 °C, pH of 6.0-8.0 and dark culture.MA4 had good control effect on, the fresh weight control effect was 91.4%, and the fresh weight inhibition rates of,andwere 63.8%, 80.6% and 69.4%, respectively.MA4 is relatively safe to dicotyledonous crops.MA4 strain has good control effect on grasses such asand is safe to dicot crops, and it has great potential to be developed into a biological herbicide.

;; biological control; biological characteristics

10.3969/j.issn.2095-3704.2023.04.63

S476.1

A

2095-3704（2023）04-0418-07

2023-10-07

2023-10-22

舒攀（1998—），男，碩士生，主要從事雜草生物防治技術研究，1378314479@qq.com；*通信作者：劉敏，講師，博士，liumin8637@hunan.edu.cn；蔡海林，高級農藝師，博士，hailincai@126.com。

舒攀, 左瑤, 李建勇, 等. 馬唐生防真菌MA4的分離鑒定及其生物學特性[J]. 生物災害科學, 2023, 46(4): 418-424.