槲寄生多糖提取工藝優化及抗氧化活性研究

蔣大珍，馬佰誠，楊 皎，羅進城，孫雪薇，李佳琳

（佳木斯大學公共衛生學院，黑龍江佳木斯 154007）

槲寄生（Viscum coloratum）作為我國傳統中藥，歷史悠久，2020 年版《中華人民共和國藥典》收載并明確槲寄生為桑寄生科植物槲寄生，以冬季至次春采割，除去粗莖，切段，干燥，或蒸后干燥入藥，功能主治去風濕、補肝腎、安胎元、用于風濕痹痛[1]。研究表明，槲寄生含有的多糖具有細胞免疫和體液免疫作用，能增強小鼠巨噬細胞TNF-α、IL-1 的分泌[2-3]。目前，植物多糖的提取方法包括熱水浸提、酸提取、堿提取、醇提取[4]、酶輔助提取、超聲輔助提取、微波輔助提取和超臨界萃取等多種方法。熱水浸提比較耗時，酸、堿提取容易破壞多糖結構，本試驗在熱水浸提、乙醇沉淀法基礎上輔以超聲波，進行了單因素及響應面工藝優化試驗的研究，以期減少提取時間、提高提取效率，尋求最優提取工藝條件，并初步探究槲寄生的抗氧化活性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

槲寄生莖、葉于2022 年12 月采摘自黑龍江省佳木斯市樺川縣橫頭山鎮申家店村（130.652 9°N，46.602 23°E）。2，2-聯苯基-1-苦基肼基購自上海麥克林生化科技有限公司，2，2′-聯氮基雙二銨鹽購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，VC 購自天津市凱通化學試劑有限公司，所用試劑均為國產分析純，所用三蒸水為實驗室自制。

試驗所用儀器為RE-201D 旋轉蒸發儀（鄭州生化儀器有限公司）、SHZ-D（Ⅲ）循環水式多用真空泵（鄭州生化儀器有限公司）、KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、YB-FD-1 冷凍干燥機（上海億倍實業有限公司）、中藥粉碎機（長沙步源制藥機械設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 槲寄生的預處理

將槲寄生莖、葉剪成小段洗凈，70 ℃烘箱烘干，粉碎，過篩（0.45 mm）后得到槲寄生粉末，將粉末浸泡于95%乙醇24 h，除去脂類雜質，抽濾，濾渣烘干后作為提取原料。

1.2.2 槲寄生多糖的提取

稱取2 g 槲寄生粉末，每組3 份，按照一定料液比加入蒸餾水浸泡2 h 后放入超聲數控清洗機中，設置一定溫度、時間、功率進行槲寄生多糖提取，抽濾取濾液，減壓濃縮到10 mL，加入4 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜，4 500 r/min 離心10 min 收集沉淀，冷凍干燥2 d 得到槲寄生粗多糖[5-6]。

式中，W 表示槲寄生多糖得率（%）；m 表示干燥所得槲寄生多糖質量（g）；M 表示槲寄生粉末質量（g）。

1.2.3 單因素試驗

通過觀察多糖得率，探究不同因素（料液比、超聲溫度、超聲時間、超聲功率）對槲寄生多糖得率的影響，設計單因素試驗。稱取2 g 槲寄生多糖粉末，固定料液比［1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL）］、超聲溫度（40、50、60、70、80 ℃）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）、超聲功率（0、200、300、400、500 W），其余操作同1.2.2。

1.2.4 響應面試驗

基于單因素試驗的結果，以多糖得率作為響應變量，選擇料液比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率4 個因素作為自變量，使用Design-Expert 13 統計學軟件，進行4 因素3 水平試驗設計，具體試驗因素及水平見表1。

表1 響應面法試驗設計因素水平Table 1 Designed factor level of the response surface method

1.2.5 槲寄生粗多糖的分離

將提取工藝優化后所得槲寄生粗多糖用蒸餾水復溶，按照1∶5 的比例加入Sevage 試劑（正丁醇∶氯仿=1∶4），置于分液漏斗中，振蕩，去掉中間層變性蛋白和下層有機溶劑，重復多次，取上層多糖溶液，離心，取上清液濃縮至一定體積后裝入透析袋（截留3 500 Da）流水透析48 h，濃縮，所得多糖溶液加入無水乙醇至80%，4 ℃醇沉淀12 h，收集醇沉淀結果，分別用乙醚、丙酮潤洗3 次，冷凍干燥后得到初步除鹽、除蛋白的槲寄生粗多糖。

1.3 槲寄生多糖抗氧化活性測定

精確稱取上述方法制備的干燥至恒重的槲寄生多糖粉末200 mg，蒸餾水溶解，定容至100 mL 容量瓶，配制成質量濃度為2 mg/mL 的槲寄生多糖溶液，準備7 支試管，分別稀釋成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL 的槲寄生多糖溶液備用。陽性對照VC 溶液同上配制。

1.3.1 DPPH 自由基清除率測定

取上述不同濃度樣品溶液各2 mL，加入2 mL DPPH 醇（0.2 mmol/L）溶液，室溫避光反應30 min。以無水乙醇為空白對照，VC 溶液為陽性對照，重復測定3 次。DPPH 自由基清除率[7-9]計算公式如下

式中，A0為2 mL 無水乙醇+2 mL DPPH 醇溶液的吸光度；A1為2 mL 樣品溶液+2 mL DPPH 醇溶液的吸光度；A2為2 mL 樣品溶液+2 mL 無水乙醇的吸光度。

1.3.2 ABTS 自由基清除率測定

配制7.4 mmol/L ABTS 溶液，2.6 mmol/L 過硫酸鉀溶液，等體積1∶1 混合，定容至100 mL，避光，室溫，反應12 h，得到ABTS 儲備液，用無水乙醇稀釋至A734nm=0.70±0.02，得到ABTS 工作液。取0.1 mL不同濃度槲寄生多糖溶液和陽性對照VC 溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL）加入3.9 mL ABTS工作液進行反應，常溫避光反應10 min，在A734nm下測定混合溶液的吸光值A1，用無水乙醇代替ABTS工作液測定其吸光值，記為A2，等體積無水乙醇重復以上操作，記為A0，ABTS 自由基清除率計算公式[10]如下

1.3.3 三價鐵離子總還原力測定

吸取1 mL pH 值為6.6 的磷酸鹽緩沖液，加入1 mL 0.03 mol/L 的鐵氰化鉀，加入不同濃度槲寄生多糖溶液和陽性對照VC 溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL），50 ℃水浴20 min，加入1 mL 0.6 mol/L 三氯乙酸混勻，隨后加入2 mL 0.006 mol/L 的氯化鐵溶液，4 500 r/min 離10 min，取上清液于A700nm處測量吸光值，對照組取2 mL水代替氯化鐵溶液，空白組取1 mL 水代替樣品溶液[11]。重復3 次。

1.4 數據處理

采用Excel 2019 軟件分析數據、Design Expert 13 軟件進行響應面試驗設計及結果分析Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素對槲寄生多糖得率的影響

由圖1 可知，料液比為1∶20～1∶50（g∶mL）時，槲寄生多糖得率呈先上升后緩慢下降的趨勢，料液比為1∶30（g∶mL）多糖得率最高，為3.85%；之后緩慢降低，1∶50（g∶mL）時多糖得率下降為3.36%，其原因可能是隨著提取溶劑體積的增加，多糖與溶劑面積增加，多糖浸出率也隨之增加；但料液比過高，也同時增加了其他物質的溶出，抑制了多糖的浸出[12-13]。

圖1 料液比對槲寄生多糖得率的影響Figure 1 Effect of solid-liquid ratio on the yield of mistletoe polysaccharide

由圖2 可知，當超聲溫度為40 ℃時，多糖得率僅為2.28%，當超聲溫度達70 ℃時，多糖得率為5.59%，但當超聲溫度達80 ℃時，多糖得率反而降低，這是由于過高的溫度可能引起多糖氧化分解，使多糖得率降低[14]。

圖2 超聲溫度對槲寄生多糖得率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic temperature on the yield of mistletoe polysaccharide

由圖3 可知，當超聲時間為10 min 時，多糖得率為7.34%，超聲時間為20 min 時，多糖得率達到頂峰，為8.60%，但超聲時間為30 min 時，多糖得率開始急劇下降，僅為3.42%，這可能是因為長時間超聲對多糖結構造成破壞，影響多糖的溶出[15]。

圖3 超聲時間對槲寄生多糖得率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic time on the yield of mistletoe polysaccharide

由圖4 可知，當超聲功率達到300 W 時，多糖得率最高，為5.86%，隨著超聲功率的增加，多糖得率開始持續下降，其原因可能是與在較大功率的超聲作用下，糖苷鍵發生斷裂有關[16]。因此，選擇最優值附近進行響應面試驗。

圖4 超聲功率對槲寄生多糖得率的影響Figure 4 Effect of ultrasonic power on the yield of mistletoe polysaccharide

2.2 響應面法優化結果

基于響應面數據分析，以料液比（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）、超聲功率（D）作為獨立自變量，以槲寄生多糖得率作為因變量，得到以下二次項回歸方程

Y=8.300 00+0.055 80A-0.062 58B-0.032 50AD+0.095 75BC+0.095 00BD+0.020 00CD-0.049 74A2-1.100 00B2-1.110 00C2-0.964 90D2

2.2.1 方差分析結果

由表2 可知，多元函數方程模型的F 值為1.16，P 值小于0.000 1，表明回歸模型具有統計學差異，而失擬項的P 值為0.698 7，大于0.05，表示模型在統計學上不顯著，因此方程是可靠的；該方程的決定系數R2為0.954 9，說明其數據擬合性好，可以用來代替試驗數據，描述變量與響應值之間的關系。校正系數R2Adj為0.909 8，表明模型能解釋槲寄生多糖得率的90.98%變化，而變異系數為4.930 0%，遠低于10%，這表明非試驗因素對結果影響較小。根據各項F 值所知，各單因素對多糖得率的影響程度最大的是超聲溫度（C），其次是超聲時間（B）、超聲功率（D），最后是料液比（A）。其中，BC、A2、B2、C2、D2對多糖得率的影響極顯著（P<0.01），而其余項對指標影響不顯著（P>0.05）。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Regression model analysis of variance

2.2.2 各因素二次項交互作用分析

由圖5 可知，在回歸模型方差分析結果基礎上，創建響應面圖及等高線圖，以分析選定的各因素對槲寄生多糖得率的影響。響應面圖和等高線圖可以清晰地展示交互作用對響應值的影響程度。當響應面曲面更為陡峭，等高線更為密集時，說明影響程度更顯著。此外，如果等高線圖更接近橢圓形，表示兩個因素之間的交互作用更強；而如果等高線圖趨近圓形，則可以幾乎忽略兩個變量之間的交互作用[17-18]。由圖5 可知，表示超聲時間和超聲溫度對槲寄生多糖得率的交互作用，當超聲時間較短時，隨著超聲溫度的增加，槲寄生多糖得率減少；然而，當超聲時間較長時，隨著超聲溫度的增加，槲寄生多糖得率增加。響應曲面的傾斜度高且坡度陡峭，表明超聲時間和超聲溫度之間的交互作用呈極顯著差異（P<0.01），這與表2 結果一致。由圖6 可知，超聲溫度和超聲功率的交互作用接近于圓形，表明兩者之間的交互作用幾乎可以忽略。

圖6 超聲溫度與超聲功率的交互作用對槲寄生多糖得率的影響Figure 6 The effect of interaction between ultrasonic temperature and ultrasonic power on the yield of mistletoe polysaccharid

2.2.3 驗證試驗

根據響應面試驗回歸方程模型確定了最佳工藝參數：料液比1∶29.36（g∶mL）、超聲時間14.58 min、超聲溫度64.48 ℃、超聲功率271.09 W，在該條件下理論得率為8.74%，根據實際操作及試驗條件，將其修正為料液比1∶29、超聲時間15 min、超聲溫度64 ℃、超聲功率300 W，在該條件下進行3 次重復試驗，求取平均值，槲寄生多糖得率為8.17%，理論值與實際得率僅差0.57%，說明該工藝優化條件穩定合理。

2.3 槲寄生多糖的抗氧化活性試驗結果分析

2.3.1 槲寄生多糖對DPPH 自由基清除能力

由圖7 可知，槲寄生多糖對DPPH 自由基具有明顯的清除效果，此外，隨著槲寄生多糖質量濃度的增加，其對DPPH 自由基的清除能力也逐漸增強，呈現出明顯的濃度-效應關系，當質量濃度為2 mg/mL時，VC 溶液的清除率已達到95.90%，槲寄生多糖清除率也達到（79.07±0.60）%，其IC50為0.612 mg/mL，表明槲寄生多糖具有較好的抗氧化活性。

圖7 槲寄生多糖對DPPH 自由基清除能力Figure 7 Scavenging ability of DPPH free radicals by mistletoe polysaccharides

2.3.2 槲寄生多糖對ABTS 自由基清除能力

由圖8 可知，在0.2～2.0 mg/mL 濃度范圍內，隨著槲寄生多糖質量濃度的增加，其對ABTS 自由基的清除率也增加。當濃度達到2.0 mg/mL 時，其對ABTS 自由基清除率為（51.38±0.29）%，IC50為2.611 mg/mL。由此可知，槲寄生多糖對ABTS 自由基的清除率與其對DPPH 自由基的清除率能力相比相對較弱。

圖8 槲寄生多糖對ABTS 自由基清除能力Figure 8 Scavenging ability of ABTS free radicals by mistletoe polysaccharides

2.3.3 槲寄生多糖對三價鐵離子總還原力

鐵離子總還原力主要基于氧化還原反應，反應過程中，多糖溶液中的活性成分將三價鐵離子還原成二價鐵離子，吸光度值越大，表明其總還原力越強，相應地，表明該多糖抗氧化能力越好[19]。由圖9 可知，槲寄生多糖總還原力弱于VC 溶液，但隨著質量濃度的增加，其總還原力呈上升趨勢，當濃度為2.0 mg/mL 時，其總還原力為（0.33±0.05），表明槲寄生多糖具有一定的還原能力。

圖9 槲寄生多糖對三價鐵離子總還原力Figure 9 Total reducing power of mistletoe polysaccharide on trivalent iron ions

綜上所述，槲寄生多糖對DPPH 自由基、ABTS自由基均有清除作用，對三價鐵離子具有還原作用，但槲寄生多糖對ABTS 自由基的清除率弱于對DPPH 自由基的清除率。

3 討論與結論

與傳統煎煮法相比，超聲輔助提取可以破壞細胞壁和細胞膜，釋放多糖等成分，多糖提取時間顯著縮短，雜質少，超聲過程中產生熱效應，增加了有效成分的溶解[20]。本試驗發現，當溫度升高時，分子的平均動能增加，分子之間的碰撞頻率和能量也會增加，因此反應速率會加快；同時溫度還可以影響反應的平衡常數，即反應物和生成物之間的比例，反應溫度升高會使反應的平衡常數向生成物方向移動，因此，促進多糖的生成。在本試驗中，只有超聲溫度和超聲時間之間的交互作用對槲寄生多糖的得率有極顯著差異（P<0.01），其他因素之間的交互作用對多糖得率無顯著影響（P>0.05）。料液比與各因素之間的交互作用均不顯著（P>0.05），這可能與試驗前浸泡2 h 有關；超聲功率本身對試驗結果影響顯著（P<0.05），但與超聲溫度之間的交互作用對試驗結果影響微小，這可能是由于參數設置的局限性所致。除上述原因外，還可能是與試驗未考慮到其他的控制變量或其他試驗因素的影響，今后可以進行更大范圍的試驗，更全面地研究兩個因素之間的交互作用。

本試驗以槲寄生莖、葉粉末為提取原料，通過采取超聲輔助的水提取和醇沉淀方法，經過單因素試驗和響應面法的優化，確定了最佳的槲寄生多糖提取工藝條件：料液比1∶29（g∶mL）、超聲時間15 min、超聲溫度64 ℃、超聲功率300 W，此條件下槲寄生多糖得率為8.17%，與預測值接近，該方法與熱水浸提法相比，縮短了提取時間，能夠為槲寄生多糖的量產提供參考。通過初步抗氧化活性分析，2 mg/mL 的槲寄生多糖對DPPH 自由基、ABTS 自由基清除率分別為79.07%和51.38%，IC50分別為0.612、2.611 mg/mL；對三價鐵離子總還原力為0.33，表現出較好的抗氧化活性，是一種天然的抗氧化劑，可以為槲寄生多糖的開發利用提供參考依據。未來可以進一步優化超聲參數，深入研究槲寄生多糖的生物活性。