西藏山羊與柴達木山羊精液品質分析研究

李玉玲,馬元梅,王 偉,李明亮,張博皓,張 楠,趙春川

(青海省畜禽資源遺傳保護利用中心,青海 西寧 810016)

精液品質檢查的主要的目的在于判定精液品質的優劣,同時為精液稀釋冷凍保存提供依據。

種公羊精液品質的優劣能夠直接影響到母羊的受胎率、羔羊的生產性能以及羊場的效益,影響種公羊精液品質的因素有很多,如營養、年齡、季節等,有關這方面的報道已有很多,但還沒有對西藏山羊和柴達木山羊精液品質差異的研究。本文以青海省畜禽遺傳資源保護利用中心科研基地飼養的西藏山羊和柴達木山羊的精液品質記錄為資料,分析研究其差異,以最大限度地提高種公羊的利用率,為地方畜禽遺傳資源保護提供依據。

1 材料與方法

1.1主要儀器設備、器械 電子天平、生物相差顯微鏡(日本OLYMPUS TL4)、顯示屏、恒溫加熱板、精子密度儀(卡蘇公司)、程控冷凍儀(法國卡蘇公司)、細管凍精支架、梅香牌恒溫水浴鍋、恒溫箱、冰箱、剪刀和卡蘇公司0.25 mL的微型細管等。

1.2主要試劑 檸檬酸鈉、蒸餾水、姬姆薩染液、磷酸二氫鈉、甲醛、甲醇、甘油、雙蒸餾水、卵黃、果糖等。

1.3試驗動物與飼養管理 選擇兩個品種年齡相當的成年公羊各15只,共計30只進行試驗。試驗羊均來自青海省畜禽遺傳資源保護利用中心科研基地飼養的西藏山羊和柴達木山羊,均為舍飼,健康且無疾病。

1.4采精方法 采精前清潔種公羊體表,清理雜毛,清洗包皮。每周采精2～3次,每次根據試驗羊只的體質狀況連續排精兩回(間隔時間為15～20 min)。采用真臺羊假陰道法采精,采精室用具用酒精進行清潔、消毒,將假陰道溫度調節到36℃～39℃,對氣壓、潤滑劑進行調試,直至正常。

1.5稀釋液和冷凍液配制

Ⅰ稀釋液:用電子天平準確稱量蔗糖3.7 g、檸檬酸鈉3.7 g、果糖0.5 g等,試劑先用雙蒸水將其溶解,經過濾和消毒后為基礎液備用。待冷卻后(室溫)將基礎液的85 mL放于三角燒瓶中,加入卵黃15 mL,用磁力攪拌器充分攪拌均勻,之后每100 mL該溶液中加入5～10萬IU的青鏈霉素。

Ⅱ冷凍液:取88 mL稀釋液Ⅰ和12 mL甘油放于容器中,搖5 min使其充分混合。

1.6精液的稀釋與平衡 精液采集后,將鏡檢合格的精液立即用Ⅰ液按稀釋總量一半的比例進行等溫稀釋,待降溫后將水浴狀態下儲精杯置于5℃的冰箱內平衡3 h。在經過第一次稀釋平衡的精液中再加入含冷凍保護劑的等溫Ⅱ液至稀釋總量,然后放入5℃的冰箱內繼續平衡1 h。

1.7細管凍精的制作 按《山羊精液冷凍保存技術操作規程》進行分裝,水平排放在細管架上放入程控冷凍儀,冷凍7～8 min后投入液氮中。

1.8鏡檢及凍精保存 從制作好的細管凍精中隨機抽取1～3支,在40℃～44℃溫水中解凍13～15 s,然后在顯微鏡下觀察解凍后的活力,活力檢測在0.3以上便可收集保存,否則棄去不用。將制作好的細管凍精裝入凍精袋,標注公羊的品種、凍精數量、精液活力以及生產日期等信息后便可裝入液氮罐長期保存。

1.9精液品質檢查

1.9.1鮮精品質檢查 鮮精采集后,先用10 μL 移液搶取出5 μL于載玻片上,蓋上蓋玻片,放入38℃恒溫相差顯微鏡下觀察其活力,再用電子天平稱重法計算出采精量,最后用法國卡蘇公司密度儀測定精子密度。

1.9.2凍精品質檢查 將同一批次的細管凍精置于38℃溫度下,用同一時間水浴方法進行解凍,檢查凍后活力。

1.9.3精子畸形率和精子頂體完整率檢查 在400倍光學顯微鏡下檢查精子畸形率,在1 000倍顯微鏡下觀察精子頂體。對精子畸形率和精子頂體完整率進行檢查時,每個抹片至少觀察200以上精子(分左右兩個區),取兩片的均值。根據精子頂體的外形和損傷情況,將精子頂體分為4種類型,即:Ⅰ正常:頂體形態完好,有明顯的頂脊,頂體部分呈均勻一致的紫色,核環部分呈規則的月牙形。Ⅱ頂體輕微膨脹:頂脊消失,頂體外援不規則;頂體部分的染色深淺不一。Ⅲ嚴重膨脹:頂體嚴重膨脹后,其邊緣出現皺褶,有明顯的條紋或者膨大呈冠狀。Ⅳ頂體脫落:頂體部分脫落(頂體形成缺口并脫離或翻轉)或頂體完全脫落。Ⅰ為正常完好精子,后三種均屬頂體損壞精子。試驗重復3批次以上。

精子畸形率(%)=畸形精子數/精子總數×100%

精子頂體完整率(%)=頂體完整精子數/總精子數×100%

1.10精液品質指標 精液量、精子密度、精子活力、精子畸形率以及精子頂體完整率。

1.11冷凍精液標準

冷凍精液符合GB20557-2006《山羊冷凍精液》中的要求,即每支細管凍精凍精劑量值≥0.18 mL;活力≥35%;直線前進運動精子數≥1.5×107個;精子畸形率≤20%;頂體完整率≥40%;細菌數≤800個。

1.12數據統計分析

數據結果用平均數±標準差(Mean±SE)表示,再用SPSS17.0統計軟件對試驗數據進行處理和分析,以P<0.05作為差異顯著性判斷的標準。

2 結果與分析

2.1西藏山羊和柴達木山羊的鮮精品質指標

由表1可知,西藏山羊精液量平均為1.17 mL,柴達木山羊精液量平均為1.65 mL,柴達木山羊精液量高于西藏山羊,二者差異不顯著(P>0.05);西藏山羊平均精子活力為69%,柴達木山羊平均精子活力為70.33%,柴達木山羊精子活力高于西藏山羊,二者差異極顯著(P<0.01);西藏山羊平均精子密度為2.763×1010個/mL,柴達木山羊平均精子密度為2.915×1010個/mL,柴達木山羊精子密度高于西藏山羊,二者差異不顯著(P>0.05);西藏山羊平均精子畸形率為9.23%,柴達木山羊平均精子畸形為7.08%,柴達木山羊精子畸形率高于西藏山羊,二者差異不顯著(P>0.05);西藏山羊平均精子頂體完整率為87.03%,柴達木山羊平均精子頂體完整率為91.47%,柴達木山羊精子頂體完整率高于西藏山羊,二者差異不顯著(P>0.05)。精液顏色均為乳白色。

表1 西藏山羊和柴達木山羊的鮮精品質指標

2.2西藏山羊和柴達木山羊的凍精品質指標

由表2可知,西藏山羊平均精子活力為35.54%,柴達木山羊平均精子活力為37.18%,柴達木山羊凍精精子活力高于西藏山羊,二者差異顯著(P<0.05);西藏山羊平均精子畸形率為13.65%,柴達木山羊平均精子畸形率為11.15%,柴達木山羊凍精精子畸形率高于西藏山羊,二者差異不顯著(P>0.05);西藏山羊平均精子頂體完整率為82.73%,柴達木山羊平均精子頂體完整率為84.92%,柴達木山羊凍精精子頂體完整率高于西藏山羊,二者差異不顯著(P>0.05)。

表2 西藏山羊和柴達木山羊凍精品質指標

3 結論與討論

3.1影響種公羊精液品質不同的因素很多,如品種、個體大小、飼養管理水平、采精頻率、日照和季節等。許多研究表明,在同樣的飼養管理條件下,公羊的品種不同,其生產的精液品質也不同,有的甚至差異很大。同一品種內,不同個體之間精液品質也會存在很大的差異。本研究發現,在飼養條件相同、健康狀況良好的情況下,西藏山羊精液品質次于柴達木山羊。初步判斷可能是由于二者遺傳基因不同所致,具體原因還需進一步研究。

3.2凍精解凍和精液冷凍同樣重要。對冷凍保存的精液,只有用適宜的解凍方法,才能保證其復蘇良好,要避免因操作不當而影響凍精質量的評定[3]。只有解凍后活力≥35%,才能保證精液有受胎能力。本試驗中兩個山羊品種的精子在解凍后的活力均高于35%,符合GB20557-2006《山羊冷凍精液》標準。制作凍精應嚴格按照操作規程進行,必須把控好冷凍精液的每一個環節,避免因發生不必要的試驗誤差而影響試驗結果。精子畸形率直接影響體外受精和胚胎移植,接受精子畸形率較高的母羊妊娠幾率較低。本試驗中兩個山羊品種精子畸形率均低于20%,符合GB20557-2006《山羊冷凍精液》標準。