藥企環境菌庫在實際工作中的應用

郭心怡，林 燕*，曹長雷，陳文俊

1.華蘭生物工程重慶有限公司，重慶 涪陵 408100；2.長江師范學院生命科學與技術學院，重慶 涪陵 408100

制藥企業的潔凈生產環境作為一種典型的受控環境，其運行和管理占據著非常重要的地位。

近年來，藥品安全突發事件頻繁發生，這些事件與潔凈室的微生物控制存在著極為密切的聯系。2011年實施的《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》修訂了無菌藥品附錄[1]，對制藥潔凈生產環境提出了更加嚴格的要求，尤其在潔凈環境監測的內容納入2015年版《中國藥典》[2]附錄之后，法規對潔凈環境監測的要求變得越來越高，這就要求制藥企業，尤其是無菌制劑企業要投入更多的人力和物力對生產的潔凈環境進行有效的監控，從而達到提高產品質量的目的。

1 材料與儀器

1.1 主要試劑

革蘭氏染色液、4%氫氧化鉀水溶液、氧化酶檢測指示條、3%過氧化氫溶液、API 鑒定試劑盒、PCR擴增試劑、基因組DNA 提取試劑盒。

1.2 主要儀器

BSC-1000-Ⅱ-A2 生物安全柜、培養箱、顯微鏡、VITEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定系統、全自動快速微生物檢測系統、RiboPrinter 全自動微生物基因指紋鑒定系統、梯度PCR 儀和核酸微量分析儀。

2 方法與結果

2.1 實驗方法

收集從藥品生產潔凈區、制藥用水系統、原輔材料等環境中檢出的微生物，將其分離純化后采用生化鑒定技術和基因型鑒定技術進行鑒定，然后保存并建立環境菌庫，定期進行統計，分析各板塊微生物的分布情況及變化，采取相應的措施，為微生物污染控制提供指導[3]。

2.2 完善性能測試

統計無菌灌裝模擬試驗潔凈環境的微生物數據，根據微生物的種類和占比，選取2 種占比高且分屬不同種屬的微生物作為無菌灌裝模擬中培養基促生長試驗的指示菌。環境中微生物流動性強且高級別潔凈環境中微生物的含量極低，可根據每年微生物的變化調整指示菌，以便于更全面地監測培養基對于環境中微生物的促生長能力。2020年無菌灌裝模擬試驗中增加了科氏葡萄球菌科氏亞種和巨大芽孢桿菌作為環境指示菌，2021年無菌灌裝模擬試驗中選擇表皮葡萄球菌和巨大芽孢桿菌作為環境指示菌（見表1、表2）。

表1 2020年潔凈環境檢出的微生物占比

表2 2021年潔凈環境檢出的微生物占比

2.3 消毒劑效果評價

統計潔凈環境的微生物數據，可知環境中微生物占比最高的為葡萄球菌屬，其次為芽孢桿菌屬。根據微生物的種類和占比，選取科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcus cohniisubsp.cohnii）、阿爾萊特葡萄球菌（Staphylococcus arlettae）、少動鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas paucimobilis）、 云南微球菌（Micrococcus yunnanensis）、 克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）、蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycodes）作為測試菌株；消毒劑選用常見的75%乙醇、0.2%新潔爾滅溶液和0.05%的84 消毒液；將消毒液與高濃度的測試菌株作用1～15 min，發現常用消毒液對無芽孢的污染菌的消殺效果良好，而對含芽孢的污染菌的消殺效果不理想?；诃h境中芽孢桿菌屬微生物占比較高，且該類微生物耐極端環境能力強的特性，選取7.9%過氧化氫殺孢子劑對芽孢桿菌進行消毒效果測試。結果表明7.9%過氧化氫殺孢子劑對含芽孢的污染菌的消殺效果良好（結果見表3、表4）。

表3 6 種測試菌株消毒測試效果

2.4 環境微生物污染控制

結合消毒劑效果試驗結果，對人員、設備和房間清潔消毒程序進行微生物調查，優化程序，采取嚴格的管理措施，并針對空間增設定期的過氧化氫熏蒸。經過1年的控制，觀察發現微生物檢出率和種類明顯下降，特別是人源的G（+）球菌和難消殺的G（+）芽孢桿菌作為環境微生物控制的難點得到了顯著的控制，降低了微生物的污染。微生物的檢出率和種類數對比趨勢見圖1、圖2。

圖1 微生物檢出率對比

圖2 微生物種類數對比

2.5 制藥用水系統質量控制

制藥用水系統中的微生物主要來源于純化水系統。對其中微生物的種類和占比進行統計分析[4]，發現主要為少動鞘氨醇單胞菌和皮氏羅爾斯頓氏菌（見表5）。隨著企業對水系統質量控制要求的不斷提高，2020—2021年持續監控數據顯示菌落數正在穩步下降。通過對數據進行評估分析，可知提高對純化水行動限控制的標準，可以優化純化水系統質量管理。

表5 2020—2021年持續監控數據

2.6 生產工藝中微生物溯源

對原料袋表面清洗消毒調查中微生物的種類和占比進行統計，發現其主要為少動鞘氨醇單胞菌，這種菌是廣泛存在于水源和環境中的微生物。結合原料袋表面清洗消毒工藝分析：微生物的主要來源與消毒效果、原料袋表面清洗水污染或帶入有很大的關系。應當聯合生產部、質量保證部啟動微生物溯源調查，優化消毒劑、消毒方式、清洗消毒工藝，并挖掘根本原因，據此制定有效的控制措施，持續監控并加以改進（表6），加大對微生物污染的控制力度。

表6 2020—2021年持續監控數據

3 結論

如何對生產環境中微生物污染的控制進行有效監控，是制藥企業需要應對的一個難題，這就需要其建立一套科學、嚴格的監督管理模式，從建立環境監測計劃、收集、分離、鑒別環境污染菌以及鑒別數據的應用分析等方面入手實現對潔凈環境中微生物污染的有效監控，以保證潔凈環境處于生產所需的受控狀態。

建立環境的監測計劃，收集、分離、鑒別環境污染菌和鑒別數據的應用分析，可以找出生產中存在的微生物污染情況及其規律，從而更好地對生產過程進行控制，以滿足藥品GMP 的嚴格監管要求。首先，企業可以對通過生產潔凈環境監控建立起的菌庫數據進行分析和統計，從而為制藥企業的相關工藝驗證（例如無菌灌裝模擬試驗、消毒劑效果評價等）提供環境菌和有效的評價；其次，可以根據菌庫數據和微生物溯源對制藥的生產過程進行微生物風險分析，及時發現異常趨勢，并采取有效的措施，降低微生物污染的風險，提高質量管理體系的有效性[5]；最后，持續不斷地對環境菌庫進行更新補充，形成動態管理的環境菌庫，能夠為潔凈環境中的微生物控制提供有效的保障。

實驗結果證實，對制藥潔凈生產環境進行監控、研究并建立環境菌庫，在實際生產過程中非常有必要，發揮的作用也是強大且有效的。