以組合生物合成策略為導向的C-核苷類多氧霉素的研究

劉元園，李天竹，熊 莉，龔 蓉，陳文青

武漢大學藥學院，組合生物合成與新藥發現教育部重點實驗室，湖北 武漢 430071

核苷類抗生素（Nucleoside antibiotics）是一類重要的微生物次級代謝產物，具有抗細菌、抗真菌、抗病毒和除草等多種功效，故在醫藥、化工以及農業等領域被廣泛應用[1-2]；根據糖苷鍵的差異，可將其分為N-核苷和C-核苷類抗生素[3]。

多氧霉素（polyoxin）由可可鏈霉菌阿蘇變種（Streptomyces cacaoi var. asoeinsis）和金產色鏈霉菌（Streptomyces aureochromogenes）產生[4]，由核苷骨架（nucleoside skeleton）、 氨甲酰多聚草氨酸（carbamoylpolyoxamic acid，CPOAA） 及聚肟酸（polyoximic acid，POIA）構成（圖1）。由于多氧霉素與UDP-N-乙酰葡萄糖胺的結構類似，故為幾丁質合成酶的競爭性抑制劑，可阻斷真菌細胞壁的生物合成。因此，對多種植物真菌病害具有良好的防治效果[5]。馬來亞霉素（malayamycin）為重要的C-核苷類抗生素，由馬來西亞鏈霉菌DSM 14072（Streptomyces malaysiensis DSM 14072）產生，因其具有獨特的全氫呋喃并吡喃雙環C-核苷結構（圖1），且能有效抑制小麥穎枯病和白粉病等植物病原真菌而被廣泛關注[6-8]。近期有研究鑒定了S.malaysiensis DSM 14072 中馬來亞霉素的生物合成基因簇，并初步揭示了其生物合成機制[9]。

圖1 多氧霉素和馬來亞霉素的化學結構式及生物合成基因簇

圖2 多氧霉素、馬來亞霉素和雜合抗生素的核苷骨架生物合成途徑

多氧霉素具有顯著的抗真菌活性，但其結構中N-糖苷鍵的穩定性相對較差，會影響其在農業中的應用。本研究采用合成策略將馬來亞霉素基因簇中負責C-核苷的truD 和malO 基因整合到多氧霉素相關的突變株中，設計合成了新型C-核苷類多氧霉素Ψ-polyoxin L 和Ψ-polyoxin K，為今后基于二者的結構設計合成多重雜合抗生素奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒

E.coli DH10B、E.coli ET12567（pUZ8002）、E.coli BW25113（pIJ790）、S.aureochromogenes YB172、SA1、SA2、S. malaysiensis DSM 14072、長柄鏈格孢菌（Alternaria alternate）和皮狀絲孢酵母（Trichosporon cutaneum 3071）均保存于本實驗室。實驗所用質粒及其特征見表1 所列。

表1 本研究所用質粒

1.1.2 工具酶、試劑及藥品

限制性內切酶及T4 DNA 連接酶購自New England Biolabs 公司；高保真PrimeSTAR? Max DNA 聚合酶購自Takara 公司；rTaq DNA 聚合酶和DNA Marker 購自鼎國生物；多片段一步法快速克隆試劑盒購自翌圣生物；質粒提取和DNA 膠回收試劑盒購自Omega 公司；甲酸（質譜級）和甲醇（質譜級）購自上海安譜；相關培養基購自OXOID 公司；其他試劑（分析純）均購買國藥。

1.1.3 引物

本研究中所用引物如表2 所列。

表2 本研究所用引物

1.2 常規方法

大腸桿菌與鏈霉菌的遺傳操作方法分別參考了相關文獻[13]，常規分子的克隆操作均按照說明書進行。

1.3 鏈霉菌菌株的發酵、發酵樣品的生物測定以及LC-MS 檢測

鏈霉菌的搖瓶發酵方法參考相關文獻[14]，相關發酵樣品的處理與生物測定按照參考文獻進行[12]。

1.4 利用PCR-targeting 技術同框缺失pJTU4774中polA 基因

將pJTU4774（含有阿伯拉霉素抗性）轉至E.coli BW25113（pIJ790）后于30 ℃條件下進行培養，后續具體實驗操作參考相關文獻[12]。

2 結果與分析

2.1 新型C-核苷類多氧霉素的生物合成途徑設計

最近研究表明，馬來亞霉素基因簇中有多氧霉素核苷骨架生物合成所需的所有相關同源基因，并與之一一對應。在多氧霉素的合成過程中，以UMP為起始底物，形成含有尿苷的生物合成過程中間體；而馬來亞霉素的生物合成中，以ΨMP 為起始底物，形成含假尿苷的類似中間體。磷酸烯醇式丙酮酰轉移酶PolA 催化UMP 形成3'-EUMP，而MalO 則只能接受ΨMP 為底物形成3'-EΨMP，以確保馬來亞霉素中假尿苷結構的特殊性。隨后，在S-腺苷甲硫氨酸自由基蛋白PolH（MalJ）、磷酸激酶PolQ2（MalE）、磷酸水解酶PolJ（MalL）、α-酮戊二酸/鐵依賴加氧酶PolK（MalM）和轉氨酶PolI（MalK）的催化下，形成AHOAP（5'-amino-6'-hydroxyoctosyl acid 2'-phosphate）。在多氧霉素中，α-酮戊二酸/鐵依賴加氧酶PolD 通過催化C-C 鍵斷裂將AHOAP 轉化為AHAP（Aminohexuronic acid 2'-phosphate）。而在馬來亞霉素生物的合成途徑中，AHOAP 在α-酮戊二酸/鐵依賴加氧酶MalI 和脫氫酶MalB 的共同催化下形成AHHP（5'-amino-6'-hydroxylheptosyl 2'-phosphate）[15-17]。

考慮到多氧霉素和馬來亞霉素核苷骨架生物合成過程的相似性，以及多氧霉素中各結構單元的生物合成相對獨立，本研究計劃中斷相關模塊的生物合成過程。在此過程中，將保留多氧霉素和馬來亞霉素各自生物合成雜合抗生素所需的模塊，并將這些相關模塊組裝形成目標雜合抗生素。

2.2 定向生物合成Ψ-polyoxin L

在前期研究中， 本實驗室構建了S.aureochromogenes YB172 中polF 基因（推測與POIA生物合成有關）同框缺失和polA 基因被tsr 抗性基因中斷的突變菌株SA2，借助SA2 進行Ψ-polyoxin L 的相關研究。首先將truD 克隆至整合型載體pIB139 獲得質粒pIB139/truD。此外，將malO 基因克隆至pJTU968 的NdeI 和EcoRI 酶切位點。然后用MfeI 和EcoRI 酶切獲得帶有紅霉素抗性基因啟動子ermEp*的malO 片段，并將含有ermEp*啟動子的malO 片段克隆至pIB139/truD 的EcoRI 酶切位點上，驗證正確后獲得質粒pIB139/truD&malO。

將構建的質粒pIB139/truD&malO 通過屬間接合轉移導入突變菌株SA2 中，篩選得到重組菌株SA2::pIB139/truD&malO，命名為PA1。將PA1 和負對照SA2::pIB139 進行發酵，發酵完畢后經草酸調節pH 至3-4，并以A. alternate 為指示菌測定生物活性，結果如圖3A 所示：與SA2::pIB139 相比，PA1恢復了微弱的抗真菌活性，表明PA1 菌株可能產生了具有抗真菌活性的新化合物。隨后進行了LCHRMS 檢測分析，相較于SA2::pIB139，重組菌PA1的發酵液中能檢測到質荷比（[M+H]+）為478.139 9的化合物，與Ψ-polyoxin L 的理論值478.141 6 基本一致；其二級斷裂碎片為460.187 1、417.216 9、399.148 7 和288.094 3 等，與Ψ-polyoxin L 的理論斷裂碎片基本一致。實驗結果表明，本研究成功產生了具有抗真菌活性的新型雜合抗生素Ψ-polyoxin L。

圖3 重組菌株PA1 代謝產物的生物活性測定與LC-HRMS 檢測分析

2.3 定向生物合成Ψ-polyoxin K

有研究表明，含有完整結構單元的多氧霉素組分相較于不含POIA 結構單元的組分對T. cutaneum等真菌的抑制活性更強[18]。因此，本研究擬將馬來亞霉素中的C-核苷引入含有完整結構單元的多氧霉素組分中以獲得雜合抗生素Ψ-polyoxin K。前期實驗室保藏了S. aureochromogenes YB172 中polA 基因被tsr 中斷的突變菌株SA1，因此將上述構建的質粒pIB139/truD&malO 通過屬間接合轉移SA1 中篩選得到重組菌株SA1::pIB139/truD&malO，命名為PA2。將PA2 和負對照SA1::pIB139 進行發酵，發酵完畢后經草酸調節pH 至3-4，以T. cutaneum 為指示菌進行生物活性測定，結果如圖4A 所示：相較于SA1::pIB139，PA2 恢復了較強的抗真菌活性。LCHRMS 檢測分析顯示：相較于SA1::pIB139，重組菌PA2 的發酵液中不僅能夠檢測到Ψ-polyoxin L，還能夠檢測到質荷比（[M+H]+）為587.1922 的化合物，其二級斷裂碎片為559.170 3、526.317 9、460.130 2、442.002 4、397.0745 和288.095 7 等，與Ψ-polyoxin K 的理論斷裂碎片基本一致。實驗結果表明重組菌株PA2 定向產生了Ψ-polyoxin L 和Ψ-polyoxin K，并且Ψ-polyoxin K 顯示出了較強的抗真菌活性。

圖4 重組菌PA2 代謝產物的生物活性測定與LC-HRMS 分析

2.4 在重組菌株PA2 中加倍多氧霉素基因簇提高雜合抗生素的產量

綜合生物活性測定和高分辨質譜檢測等手段的應用，確定了重組菌株PA1 能夠產生Ψ-polyoxin L，重組菌株PA2 不僅能夠產生Ψ-polyoxin K，還能產生少量的Ψ-polyoxin L，但二者產量都較低，限制了目標雜合抗生素的開發與應用。因此，本研究擬將多氧霉素相關結構單元生物合成途徑的基因簇加倍，以期提高目標雜合抗生素的產量。在含有多氧霉素完整生物合成基因簇的質粒pJTU4774 的基礎上，采用PCR-targeting 技術將polA 基因進行同框缺失得到質粒pJTU4774ΔpolA（圖5A）。以polAidF/R 為鑒定引物進行PCR 驗證，結果如圖5B 所示：pJTU4774 的PCR 產物大小為1.44 kb，連上卡那霉素抗性基因neo 后的質粒PCR 產物大小為2.06 kb，而pJTU4774ΔpolA 的PCR 產物大小為0.62 kb，隨后將PCR 驗證正確的質粒pJTU4774ΔpolA 進行測序驗證（圖5C）。

圖5 質粒pJTU4774ΔpolA 的構建及驗證

由于pIB139 與pJTU4774 具有相同的抗性，無法同時通過屬間接合轉移的方法整合到底盤菌染色體上。因此，本研究采用了分別帶有ermEp*啟動子的truD 和malO 基因，通過Gibson 重組的方式克隆至pJTU4774ΔpolA 的EcoRI 位點上，得到質粒pJTU4774ΔpolA/truD&malO。隨后，通過屬間接合轉移的方法將其導入SA1 中，篩選得到重組菌株SA1::pJTU4774ΔpolA/truD&malO，命名為PA3（圖6A）。將重組菌株PA3 和PA2 同批次發酵，取等量原始發酵液以T. cutaneum 為指示菌對其進行生物活性測定，檢測結果如圖6B 顯示：重組菌株PA3 相較PA2 對T. cutaneum 的抑制作用更強，表明PA3發酵液中相應目標雜合抗生素的產量相較PA2 有了明顯的提高。進一步的LC-HRMS 分析如圖6C-D所示：PA3 中Ψ-polyoxin L 的產量提高到了原來的150%左右，而Ψ-polyoxin K 的相對產量較PA2 提高到了原來的330%左右。實驗結果表明，通過加倍多氧霉素生物合成基因簇pJTU4774ΔpolA，能顯著提高目標化合物Ψ-polyoxin L 和Ψ-polyoxin K 的產量。

圖6 多氧霉素基因簇加倍重組菌株PA3 構建示意圖及相關雜合抗生素產量比較

3 討論與結論

近年來，面對從天然產物中分離新抗生素越來越緩慢和抗生素耐藥性增長等困境，在全面了解天然抗生素生物合成代謝途徑的基礎上，通過組合生物合成策略對其進行結構改造成為了破解抗生素開發困境的重要途徑之一[19]。本研究中，依循組合生物合成策略的指導， 以多氧霉素工業菌S.aureochromogenes YB172 為底盤菌株，通過改造其生物合成途徑并整合馬來亞霉素中負責C-核苷結構的基因truD 和malO，首次定向產生了具有C-核苷結構的新型雜合抗生素Ψ-polyoxin L 和Ψpolyoxin K。此外，通過增加多氧霉素生物合成基因簇的拷貝數，顯著提高了雜合抗生素Ψ-polyoxin L和Ψ-polyoxin K 的產量。這為今后基于多氧霉素和馬來亞霉素等相關核苷類抗生素設計和合成多重雜合抗生素奠定了基礎。