高良姜素對利血平誘導的抑郁模型小鼠的影響

馮真英, 周中流, 陳丹, 彭素絹, 李觀同, 孫玉香, 黃麗平*

(1. 廣東醫科大學 附屬第二醫院 藥學部, 廣東 湛江 524001; 2. 嶺南師范學院 化學化工學院, 廣東 湛江 524048)

抑郁癥是一類以精神障礙為突出表現的中樞神經系統疾病,癥狀表現為患者長時間和持續的情緒低落,反應遲緩。經世界衛生組織統計,有近4億人正飽受抑郁癥的困擾,約占世界人口的4.4%,特別是在如今新冠病毒大流行的特殊時期,10年后抑郁癥可能成為人類勞動能力低下甚至喪失的首要原因[1]。而目前廣泛使用的抗抑郁藥物具有很大局限性,如SSRIs和三環類等抗抑郁藥物,大多都有明確的不良反應、價格高、停藥易復發等缺點[2],因此開發安全有效的預防抑郁癥及緩解抑郁癥狀的藥物是當今社會亟須解決的問題。近年研究表明,中醫藥防治抑郁癥優勢突出,不僅療效顯著,而且毒性較小,可以長期服用。

高良姜是一種藥食同源的溫里藥,其性味基本穩定,從古至今藥學書籍記載其特性基本一致,多以辛、苦、大溫、無毒為主,在醫用及日常應用方面都有突出的貢獻。高良姜素是高良姜(alpiniaofficinarumhance)中的一種天然黃酮類化合物。近年研究提示,高良姜素具有修護皮膚、抑制炎癥、抗糖尿病、抗腫瘤及其并發癥、抗纖維化、抗病原微生物及神經保護等多種藥理活性[3],其應用前景廣闊。研究表明,高良姜素可改善APP/PS1小鼠海馬神經元受損情況,其機制可能與介導Akt/MEF2D/Beclin-1轉導途徑有關[4]。另外,抑郁患者常常伴有胃腸功能障礙或慢性胃病,而胃腸功能紊亂又會導致抑郁癥的癥狀加劇。高良姜黃酮類成分能顯著改善胃黏膜血管血流、抗氧化和預防胃黏膜損傷[5]。另外,最新研究表明,胃腸道菌群可經腦-腸-菌軸干預消化道疾病的進展,腦腸肽是腦-腸軸的神經肽信號,腦腸肽分泌異常,抑制五-羥色胺(5-HT)的分泌,可刺激胃酸分泌,促進胃腸運動,導致焦慮和抑郁的發生[6]。然而,高良姜素可否通過改善胃腸功能而發揮抗抑郁作用仍未見報道,值得進一步探討?；诖?本研究以氟西汀治療作為陽性對照組,觀察利血平誘導的抑郁小鼠海馬和皮質中應激因子超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及5-HT水平變化和自噬的影響,旨在為其抗抑郁治療提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

60只SPF級小鼠,體質量(20±2)g,6月齡,購自廣東省醫學實驗動物中心,生產許可證:SCXK(粵)2018-0002。溫度指示計維持溫度在18～29℃,相對濕度55%,動物房持續換氣。合格證編號:44007200101764。本研究獲得廣東醫科大學動物倫理委員會批準(審批號:GDY2302382)。

1.1.2 主要試劑

鹽酸氟西汀(廣醫第一附屬醫院藥房,批號:1798A);高良姜素(純度99.94%,成都曼思特生物科技有限公司,貨號:548-83-4);SOD、MDA、GSH-Px和5-HT Elisa試劑盒購自Mlbio公司,貨號分別為:ml29197-1、mlsh0939、m1058194、m1001891;P62、Beclin-1、LC3B和GAPDH一抗均購自英國艾博抗公司,貨號分別為:ab240635,ab302670,ab192890,ab9484;RIPA裂解液購自索萊寶科技公司;BCA、電泳液和轉膜液等均購自Beyotime Biotechnology公司;3MA(貨號R022011)和利血平(貨號R006853)均購自北京索萊寶生物科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模與干預

取模型小鼠60只,隨機分為正常組、模型組、氟西汀組(15 mg/kg)、高良姜素高劑量組(100 mg/kg)、高良姜素低劑量組(25 mg/kg)和自噬抑制組(3MA組)(30 mg/kg),每組10只。按照0.1 mL/10 g對各組小鼠灌胃,連續7 d。第7天灌胃,模型組及各給藥組即刻腹腔注射生理鹽水配制的2.5 mg/kg利血平溶液0.1 mL/10 g,正常組腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.2.2 強迫游泳實驗

實驗在有機玻璃缸(25 cm×10 cm×15 cm),游泳時水溫控制在(24±2)℃,控制水位使小鼠游泳時尾巴不能觸碰到圓筒底部。強迫游泳6 min,觀察記錄后4 min內小鼠累計不動時間。當小鼠浮于液面、停止掙扎時開始記錄累計不動時間[7],每次實驗后清理并更換純凈水。

1.2.3 懸尾實驗

懸尾實驗的累計停滯時間能反映實驗動物的抑郁絕望狀態[8]。計算造模7 d時和給藥后小鼠懸尾不動時間來評估小鼠的絕望情況。將小鼠的尾端距尾尖1 cm處黏貼在盒子頂部。小鼠的頭部向下,距離盒子底部約20 cm。實驗持續5 min。當懸吊的小鼠沒有明顯掙扎時,被認為是靜止的。記錄實驗后5 min內小鼠的累計靜止時間,每次只操作1只小鼠。適應1 min后,待小鼠停止掙扎,靜止不動為懸尾不動時間。

1.2.4 曠場實驗

采用曠場實驗進行小鼠焦慮抑郁程度檢測。將實驗小鼠移置到透明箱子中(50 cm×50 cm×40 cm),以距離箱壁25 cm 的正方形區域為中心區域。小鼠因趨觸性喜歡緊貼墻壁,這在有焦慮樣行為的小鼠中表現更為明顯,即焦慮程度較低的小鼠出現并停留在曠場中心區域的時間更多。每只小鼠分別被放置在箱子中心位置,給藥1 h后,將小鼠放入曠場內,觀察并記錄小鼠在5 min內的運動活動情況,包括水平運動次數、后肢站立次數,每次只操作1只,每次測試后及時清理動物排泄物[9]。

1.2.5 糖水偏好實驗

待給藥結束,各組小鼠單只分籠飼養,籠子里放置2瓶1%糖水的飲水瓶,1 d后更換其中1瓶為純水,放置1 d。適應訓練結束后,禁水1 d后開始實驗:鼠籠放置1%糖水和純水各1瓶,1 d后稱取并記錄糖水和純水的消耗量,計算糖水偏好比。

1.2.6 Elisa檢測應激因子SOD、MDA、GSH-Px和5-HT水平

將各組小鼠皮質加入9 倍預冷生理鹽水并置于勻漿器中研磨,4000 r/min離心10 min,吸取上清液待測,每孔加上清液10 μL和樣品稀釋液90 μL,隨后分別嚴格按SOD、MDA、GSH-Px和5-HT的Elisa試劑盒說明書操作。

1.2.7 免疫熒光檢測LC3B的表達

小鼠腦組織經過4%多聚甲醛固定,脫水包埋處理后,將切片脫蠟至水;在3%H2O2中浸泡10 min;0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液微波加熱對抗原修復;遮光封閉滴加LC3B抗體(1∶50)置于37 ℃恒溫箱1 h,加入羊抗兔二抗置于恒溫箱20 min,抗淬滅封片;PBS作為陰性對照;顯微觀察拍照,呈藍色熒光即為陽性表達,最后進行圖像分析。

1.2.8 Western blot檢測Beclin-1和P62水平

將各組小鼠的海馬組織加入含蛋白酶抑制劑的裂解液,冷凍勻漿,12 000 r/min下低溫離心10 min, BCA法測蛋白質濃度,定量后用于Western blot檢測。在110 V,55 min條件下進行電泳,上樣量為30 μg總蛋白,濕法轉膜,條件為300 mA、90 min,兔抗小鼠Beclin-1、P62和 GAPDH一抗(1∶1000),山羊抗兔二抗(1∶2500),ECL試劑盒在CLD檢測器中檢測。結果以各目的蛋白與GAPDH灰度值比值表示,用Image-pro進行分析。

1.3 統計學分析

統計分析軟件采用SPSS 19.0。計量資料以均數±標準差表示,通過軟件中One-way ANOVA及t檢驗對行為學觀測指標進行統計分析。免疫組化結果采用Image J進行灰密度分析,然后結合SPSS 19.0進行統計分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高良姜素對利血平誘導的抑郁癥小鼠的影響

與正常組相比較,懸尾實驗中模型組小鼠的懸停時間顯著增加(P<0.01);與模型組比,氟西汀組、3MA組、高良姜素高和低劑量組小鼠的懸停時間顯著減少(P<0.01)。與正常對照組比較,強迫游泳實驗中模型組小鼠的浮停時間顯著增加(P<0.01);與模型組比,其余各組小鼠的浮停時間顯著減少(P<0.01)。與正常對照組比較,曠場實驗中模型組小鼠的水平活動次數和站立次數顯著減少(P<0.01);與模型組比,高良姜素各劑量組的水平移動次數和站立次數顯著增加(P<0.01)。與正常組比較,糖水偏好實驗中模型組的糖水偏好度出現顯著降低(P<0.01);與模型組比,氟西汀組、3MA組和高良姜素高劑量組小鼠的糖水偏好度顯著提高(P<0.05),見圖1。

A: 懸尾實驗;B: 強迫游泳實驗;C: 曠場實驗;D: 糖水偏好實驗。與正常對照組相比, 1)P<0.05, 2)P<0.01;與模型組相比, 3)P<0.05, 4)P<0.01。A: Tail suspension test; B: Forced swimming test; C: Open field experiment; D: Sugar water preference experiment. Compared with the normal control group, 1)P<0.05, 2)P<0.01; Compared with the model group, 3)P<0.05, 4)P<0.01.圖1 高良姜素對利血平誘導的抑郁小鼠模型干預作用的影響Figure 1 Effect of galangin on reserpine-induced depressive mouse model

2.2 高良姜素對利血平誘導的抑郁小鼠腦氧化應激和5-HT的影響

經利血平誘導后,與正常組比,模型組表現為SOD、GSH-Px和5-HT水平明顯下降,而MDA濃度明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與模型組比,其余各組小鼠表現為SOD、GSH-Px和5-HT水平明顯提高,而脂質過氧化產物MDA濃度明顯減少(P<0.05或P<0.01),表明高良姜素能一定程度對抗利血平誘導的氧化應激從而發揮抗抑郁作用,見圖2。

與正常對照組相比, 1)P<0.05, 2)P<0.01;與模型組相比, 3)P<0.05, 4)P<0.01。Compared with the normal control group, 1)P<0.05, 2)P<0.01; Compared with the model group, 3)P<0.05, 4)P<0.01.圖2 高良姜素對利血平誘導的抑郁小鼠腦組織中氧化應激因子和5-HT水平的影響Figure 2 Effect of galangin on oxidative stress factor and 5-HT level in brain of depressed rats induced by reserpine

2.3 高良姜素對利血平誘導的抑郁小鼠腦組織中自噬蛋白的影響

免疫熒光檢測LC3B表達情況,與正常對照組相比,模型組小鼠的LC3B表達顯著增加(P<0.01);與模型組比,氟西汀組、高良姜素高劑量組和3MA組小鼠的LC3B表達均明顯降低(P<0.01),見圖3。

A:正常組;B:模型組;C:氟西汀組;D:高良姜素高劑量組;E:3MA(3-甲基腺嘌呤)組;F:LC3B蛋白相對表達量。與正常對照組相比,1)P<0.01;與模型組相比,2)P<0.01。A:Normal group; B:Nodel group; C:Fluoxetine group; D:Galangin high-dose group; E:3MA (3-methyladenine) group; F: Expression level of LC3B. Compared with the normal control group, 1)P<0.01; Compared with the model group, 2)P<0.01.圖3 免疫熒光檢測LC3B表達水平Figure 3 Expression level of LC3B detected by immunofluorescence

2.4 高良姜素對利血平誘導的抑郁小鼠神經元自噬的影響

與正常組相比,模型組小鼠腦組織Beclin-1表達均顯著升高,而P62明顯下降(P<0.05或P<0.01);與模型組相比,氟西汀組、高良姜素高劑量組和3MA組小鼠腦組織Beclin-1表達水平均明顯降低,而P62則明顯上升(P<0.05或P<0.01)。結果提示高良姜素可能通過抑制自噬發揮抗抑郁作用,見圖4。

與正常對照組相比,1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組相比,3)P<0.05,4)P<0.01。Compared with the normal control group, 1)P<0.05, 2)P<0.01;Compared with the model group, 3)P<0.05, 4)P<0.01.圖4 高良姜素對P62和Beclin-1表達的影響Figure 4 Effect of galangin on P62 and Beclin-1 expression

3 討論

利血平誘導急性抑郁癥是常用的抑郁模型構建方法之一[10-12],通過消耗大腦內5-HT等神經遞質,引發運動滯緩、體溫降低及系列生理變化,從而造成抑郁癥[13]。動物的懸尾、強迫游泳、曠場實驗和糖水偏好等行為學實驗廣泛用于抗抑郁藥物的初篩,可全面評價高良姜素抗抑郁藥的作用效果[14]。本研究發現,高良姜素高、低劑量組均能顯著減少小鼠強迫游泳浮停和懸尾不動時間,提高掙扎頻率,增加其運動次數,表現為小鼠水平跨越格子數和后肢站立次數增多,且小鼠對藥物呈現一定的劑量依賴性。此外,結果還發現高良姜素可以顯著提高利血平誘導的急性抑郁模型小鼠海馬腦區中5-HT的水平,提示高良姜素可能通過調節5-HT的水平來改善急性抑郁模型小鼠的抑郁行為。

氧化應激與抑郁癥之間的關系已引起諸多學者的關注。臨床及基礎研究均發現,抑郁癥患者和抑郁動物模型均出現抗氧化指標的減少及氧化有關通路的激活,從而造成蛋白質和DNA損傷,產生過氧化脂質體[15]。研究證實通過抑制氧化應激可減輕抑郁行為[16]。氧化應激的生物標志物中,MDA濃度是反映氧自由基水平的重要指標,MDA的產生過程伴隨著心肌抗氧化代謝酶SOD、過氧化氫酶(CAT)和GSH-Px的消耗,促使氧自由基生成而加劇氧化。高良姜素可激活PI3K/Akt通路,發揮抗過氧化氫誘導的細胞損傷[17],提示其具有明確的抗氧化活性。本研究發現,利血平可以顯著降低小鼠皮質中抗氧化代謝酶SOD和GSH-Px的水平,提高MDA濃度,提示利血平具有增強小鼠氧化應激的作用。結果顯示,高良姜素各劑量組和氟西汀組小鼠腦中SOD、GSH-Px水平顯著高于模型組小鼠,而MDA濃度顯著降低。由此可推測得到,高良姜素能夠顯著提高利血平誘導抑郁模型小鼠腦組織中抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性,減少脂質過氧化中間產物MDA的濃度。

自噬是一種高度保守的細胞質內容物消化和再循環的細胞機制,也是腦神經元死亡的主要形式之一。Beclin-1、LC3和P62均是自噬標志物,其中Beclin-1是自噬調控的標志性蛋白之一,Beclin-1表達增加與自噬活性增強呈正相關[18-19]。Beclin-1是參與刺激自噬特異性基因的正調節因子;LC3是檢測自噬發生的標志蛋白,是首個自噬小體膜蛋白,在前自噬泡及自噬泡表面富集。研究證實,抑郁癥模型大鼠海馬組織中 Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達升高,海馬神經元細胞自噬明顯增多,同時,自噬過度激活,誘發神經元氧化應激損傷,從而加重海馬神經損傷及大鼠的抑郁程度[20]。研究發現,高良姜素可通過調節Akt/MEF2D/Beclin-1信號通路,利用自噬和分子伴侶介導的自噬(CMA)發揮清除海馬神經元內異常蛋白的作用,從而減少阿爾茨海默癥特征性蛋白(p-tau和Aβ42等)的聚積[4],發揮對海馬神經元的保護作用。本研究結果發現,抑郁模型組小鼠海馬中Beclin-1和LC3蛋白表達顯著升高,P62蛋白表達顯著下降;而給予高良姜素干預治療后,高良姜素組小鼠海馬組織中Beclin-1和LC3B水平顯著下降,P62水平顯著升高,結果表明高良姜素能一定程度的抑制抑郁模型小鼠自噬水平。

綜上所述,高良姜素可以改善利血平抑郁模型小鼠的抑郁行為,可使抗利血平誘導的5-HT水平下降,SOD和GSH-Px水平提高,MDA水平降低,以及調節自噬標志物Beclin-1、LC3B和P62的水平,因此推測高良姜素抗抑郁作用機制可能與抑制自噬和氧化應激有關,本研究為高良姜素對抑郁癥的治療作用提供了新的實驗依據,后期將會針對其抗抑郁的作用機制進行深入研究。

作者貢獻聲明

馮真英、陳丹、彭素絹、孫玉香:實驗方案設計、相關文獻資料收集、分析及論文初稿寫作;黃麗平、李觀同:論文框架及關鍵部分修改;周中流:項目指導及負責人,指導論文寫作。

利益沖突聲明

本研究未受到企業、公司等第三方資助,不存在潛在利益沖突。