吸附載體固態發酵的研究進展

馮潤毅，萬 鵬，黃興雅，韓 慧，劉海波，張笑然

（延安大學 化學與化工學院，陜西 延安 716000）

固態發酵是白酒、豆豉等傳統發酵產品常用的生產方式，其歷史悠久，產品多樣。與液態發酵相比，傳統固態發酵的微生物生長環境更接近其自然生長狀態，裝備相對簡單、能耗低，發酵過程廢水產生量較低[1-3]。目前，在傳統固態發酵技術的基礎上，現代固態發酵技術得到了快速發展，已涵蓋淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶等多種酶制劑，有機酸、氨基酸、抗生素等諸多生物化工產品門類[3-4]，在過程控制的精準度、分離提取的便利性、固廢排放量的控制等方面都提出了較傳統固態發酵更高的要求，而傳統固態發酵的物料溫度、含水率、溶氧、營養物和代謝物濃度、微生物的分布密度與生理狀態，在宏觀的反應器尺度和微觀的物料顆粒尺度上都呈現出時空分布不均勻現象，成為限制現代固態發酵擴大生產規模的主要瓶頸之一[2，5]。造成上述現象的原因，除反應器性能外，發酵基質的性質也是重要方面，并已成為國內外研究者的重要關注點。

1 吸附載體固態發酵簡述

1.1 吸附載體固態發酵的概念

作為固態發酵基質的固態物料可分兩類：①固體發酵（營養性載體基質固態發酵）?；|完全由可被微生物利用的營養物質組成，并不斷消耗，顆粒尺度不斷減小且易發生聯（粘） 結，料床易發生收縮、板結，從而嚴重降低其通透性[4，6]。②吸附載體固態發酵。利用不能被發酵微生物利用，且具備吸附、保水能力的惰性載體顆粒，液態培養基吸附在其內部和表面、以供微生物生長、代謝[3，6]。與傳統的固體發酵相比，吸附載體固態發酵具有料床通透性好、不易板結、培養基成分便于調整、供氧更充分、產品更便于分離且部分惰性載體可重復使用等優勢，應用潛力大[3]。

1.2 吸附載體固態發酵的應用領域

目前，吸附載體固態發酵的研究已涉及酶制劑、有機酸、生物燃料、小分子藥物等多種產品門類，其中又以酶制劑類產品最多，如漆酶[7]、纖溶酶[8]及纖維素酶[4]等。有機酸產品主要涉及乳酸[9]、檸檬酸[3]等。小分子藥物報道較多的是莫納可林K[10]。此外,還包括細菌纖維素[11]、香草醇、香草醛和香草酸[12]、黃原膠[13]、丁醇[14]及真菌孢子殺蟲劑[15]等多種產品。

2 固態發酵惰性吸附載體的研究現狀

吸附載體固態發酵技術的關鍵要素是所用的惰性吸附載體，其物理化學性質、生物兼容性、材料學性狀，以及在發酵中的熱力學行為特征都是影響發酵效果的重要因素。惰性吸附載體的關鍵特征是利用發達的內部孔隙提供較強的吸附和保水能力，故此類載體一般為多孔結構，其來源可分為天然來源、人工制造兩類。

2.1 天然來源載體

天然來源載體又可分為農業來源和非農業來源兩類。農業來源載體出現較早，通常為具備一定機械強度，物理化學性質較穩定的多孔性農業廢棄物顆粒，如甘蔗渣、玉米芯等。Lu L P 等人[10]將甘蔗渣載體用于紫紅曲霉固態發酵制備莫納可林K，結果表明，粒徑0.1～3.0 mm 的甘蔗渣顆粒載體中，1 mm粒徑的顆粒產量最高，說明載體粒徑過大雖有利于過程傳熱和傳質，但比表面積小，而過小的載體粒徑又易造成物料結塊，阻礙傳遞過程，粒度適中的顆粒往往更適應固態發酵的要求[16]。此外，玉米芯顆粒[17-18]、燕麥秸稈[19]、花生殼[7]、綠豆殼[16]等也有被用作惰性吸附載體的報道。He Q 等人[14]將蒸汽爆破技術用于玉米秸稈等載體材料的預處理，改善了載體的多孔性，提高了生物丁醇的產率。非農業來源天然載體一般為礦物或巖石顆粒，例如低密度且具備多孔結構的蛭石顆?？捎米髅浊拱l酵產淀粉酶的載體[3，20]，也可用作曲霉屬發酵產纖溶酶的載體[8]。天然來源載體價格低廉、供應充足，但木質纖維素類材料在高溫蒸汽滅菌過程中有可能產生發酵抑制物，且重復使用壽命不及一些人工載體，而礦物顆?？蛇x擇范圍較窄，且存在礦物中某些化學成分被浸出并抑制微生物代謝的風險。因此，能克服或改善上述不足之處的人工載體成為固態發酵吸附載體的發展方向。

2.2 人工制造載體

人工制造載體多為高分子材料，主要包括聚氨酯泡沫（PUF） 和聚苯乙烯（PS），其中又以聚氨酯泡沫應用最廣，已被用于發酵制備淀粉酶[21]、蛋白酶[22]、脂肪酶[23]、核酸酶[24]、纖維素酶[25]等多種酶制劑，乳酸[9]、克拉維酸[26]等有機酸，以及聚不飽和脂肪酸[27]、真菌孢子[15]等多種產品。例如，Rocha-Pino Z 等人[23]分別以PUF 切塊和卷料為載體，利用蠟蚧輪枝菌固態發酵制備脂肪酶，獲得了最高達3.6 U/mg（蛋白質） 的脂肪酶比酶活；Zhi Jin 等人[28]將高密度PUF載體用于綠膿桿菌固態發酵產鼠李糖脂，在容積30 L的固態發酵罐中獲得了39.8 g/L 的產量；Hu T 等人[25]利用PUF 載體制備纖維素酶，其產品的濾紙酶活、CMC 酶活分別比不使用該載體的組別提高了70.6%和60.4%；Ferreira M 等人[27]利用PUF 載體固態發酵制備聚不飽和脂肪酸，獲得了535.41 mg/g（固態基質） 的聚不飽和脂肪酸產量；Buenrostro-Figueroa 等人利用經過預處理的PUF 載體，以石榴皮提取物為原料，采用黑曲霉菌株生物轉化制備抗癌物質鞣花酸，獲得了231.22 mg/g（總石榴多酚） 的轉化率。在多種類型產品中的應用成果，揭示了聚氨酯泡沫作為惰性吸附載體用于固態發酵的巨大潛力。

3 吸附載體固態發酵生產工藝的研究現狀

3.1 載體的幾何外形和物性對發酵的影響

天然載體的顆粒尺寸受原料的自然形態和粉碎工藝的限制，可調整的范圍較小，且粒度的可調性和均一性往往難以同時實現：如稻殼載體，具備較好的均一性，但尺寸范圍較窄；如粉碎后使用，其粒度的均一性又會大幅度下降；蔗渣載體為農產品加工廢棄物，顆粒均一性不高，且顆粒形態一般為絲狀。載體顆粒的不均一性，容易加劇固態發酵料床溫度、含水率分布的不均勻性。另一方面，木質纖維素類天然載體在培養基滅菌的過程中，常常產生醛類和芳香族抑制物，影響微生物的生長和代謝，例如糠醛、5' - 羥甲基糠醛、香草醛等，存在干擾發酵過程的風險。此外，農產品加工廢棄物顆粒的機械強度一般不高，經過反復使用后，破碎的概率較大。因此，粒度均一、外形規整、物性穩定的人造載體在發酵過程控制的精準度、載體的重復使用壽命等方面較天然載體更具優勢。

聚氨酯泡沫載體大多以小型切塊的形式使用，多數報道采用的是邊長10 mm 左右的立方體切塊，但實際上切塊的尺寸和外形對發酵結果也有一定的影響。例如，Hu T 等人[25]在纖維素酶發酵工藝的研究中對比了外形尺寸分別為5 mm×5 mm×5 mm，10 mm×10 mm×5 mm，15 mm×15 mm×5 mm，20 mm×20 mm×5 mm 的不同PUF 切塊，結果表明只有20 mm×20 mm×5 mm 一種切塊產生的CMC 酶活稍低，但對于濾紙酶活，則是10 mm×10 mm×5 mm 規格的切塊產量明顯高于其他類型。又如，Rocha-Pino Z 等人[23]將厚度為10 mm 的薄層片狀PUF 卷成筒狀置于反應器內用于脂肪酶發酵，但產酶效果不及PUF 切塊。此外，在使用前，PUF 切塊往往需要清洗、干燥，以去除可能干擾發酵過程的雜質。目前，已有許多研究報道了聚氨酯泡沫載體在固態發酵中的內部結構。例如，Xu X Q 等人[15]用掃描電子顯微鏡觀察到蠟蚧輪枝菌的營養菌絲在聚氨酯泡沫載體內部小室中的生長狀況，可證實PUF內部小室可以為包括絲狀真菌在內的好氧微生物提供適宜的生長環境。Zhang Z G 等人[13]則通過顯微鏡觀察了黃原膠發酵液吸附于聚氨酯內部小室中的狀態，驗證了PUF 泡沫可以吸附液態培養基，在其內部小室中進行好氧發酵的能力。

3.2 產品的提取工藝

鑒于載體的穩定性，吸附載體固態發酵的產品提取工藝一般較傳統的營養基質固態發酵更加便利。對于天然載體，多用水或溶劑浸提的方式提取產品。例如，以蔗渣為吸附載體發酵產生的莫納克林K，可以用乙醇浸提法分離[10]。對于聚氨酯泡沫載體，在使用水或溶劑浸提時，可以對載體實施擠壓操作以提高提取效率[3]，并且根據Zhi Jin 等人[28]的研究結果，使用聚氨酯泡沫載體發酵制備鼠李糖脂時，提取液的雜質含量也明顯低于使用稻草、蔗渣等天然載體時的雜質含量，進一步顯示出聚氨酯泡沫載體相對于天然載體的優越性。

4 結語

與傳統固態發酵相比，吸附載體固態發酵的應用案例雖然偏少，但該工藝具有較好的應用前景。近年來，其涉及的產品也從早期的常規酶制劑產品向小分子藥物等高附加值產品拓展。作為惰性吸附載體固態發酵的核心要素，惰性吸附載體也在向成分和物性明確、結構均一、穩定性好的人工制造載體方向發展，而聚氨酯泡沫是目前其中的最主要代表。聚氨酯泡沫切塊的尺寸、形狀、密度、硬度和孔隙率等參數都可能影響發酵指標，因而在應用中需要針對不同的發酵產品，充分考查上述因素對發酵指標的影響，同時也有必要進一步建立載體顆粒水平的傳遞動力學微觀模型，對顆粒內部的熱量、水分、溶解氧、營養物等傳遞過程做定量描述，為在載體顆粒的微觀尺度上提高發酵過程調控的精準度創造條件。