miR-196a在劍白香豬不同顏色皮膚組織中的表達及靶基因預測

蒙澤飛, 陳 偉*, 陳 龍, 楊 帥, 劉英渠, 朱紅橙, 羅文怡

(1. 貴州大學動物科學學院高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室,貴州 貴陽 550025;2. 貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室,貴州 貴陽 550025)

劍白香豬是主產于貴州省黔東南苗族侗族自治州劍河縣的小型豬種,皮薄、肉嫩、味香,為國家二級稀有保護動物,頭、尾部毛色為黑色,軀干部為白色(間雜不規則黑斑),具有“兩頭烏”特征[1,2]。豬毛色和皮膚顏色是重要的品種特征之一,可作為遺傳標記判斷品種純度、親緣關系、遺傳穩定性[3]。microRNA(miRNA)是1種廣泛存在于動植物體內的非編碼單鏈小分子RNA,長度為18～25個核苷酸。miRNA通過與靶mRNA的3’-UTR端非編碼區(3’-untranslated regions,3’-UTR)結合抑制靶基因的翻譯或降解靶基因[4]。miR-196a是miR-196家族的重要成員之一,主要參與胚胎發育過程中肢體再生、細胞增殖和分化等過程[5～7]。有研究表明,miR-196a與錦鯉皮膚的色素形成相關[8]。本研究以劍白香豬為研究對象,探究miR-196a在劍白香豬白色和黑色皮膚中的表達差異,并對其靶基因進行預測分析,為miR-196a調控豬皮膚色素沉積的相關機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 皮膚組織樣品

采集貴州大學香豬育種場內飼養的6月齡健康劍白香豬(公豬3頭)耳部黑色皮膚組織和背部白色皮膚組織,大小為2 cm×2 cm,錫箔紙包裹,置于液氮中帶回實驗室 -80 ℃保存備用。

1.2 主要儀器

PCR擴增儀(型號:GeneAmp9600,美國ABI公司)、熒光定量PCR儀(型號:CFX96,美國ABI公司)、超低溫冰箱(型號:Forma 991,美國Thermo Fisher Forma公司)、臺式超速離心機(型號:Optima MAX &TLX,美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.3 主要試劑

Trizol試劑(生工生物工程上海有限公司)、miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)、DNA Marker(50 bp DNA Ladder)(北京鼎國生物技術科技有限公司)、SYBR Green supermix(美國Life technologies公司)。

1.4 引物

以GenBank中的豬miR-196a(ssc-miR-196a)(GeneID:100316567;miRBase:MI0002457)為參考序列,應用primer premier 5.0軟件設計1條特異引物,以snU6(GeneID:100522884)基因為內參,引物送至北京擎科生物科技有限公司(重慶)合成。引物信息見表1。

表1 引物信息

1.5 皮膚總RNA提取和cDNA合成

采用Trizol法分別提取白色和黑色皮膚組織的RNA,按照miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書方法進行mRNA逆轉錄,分別合成cDNA第一鏈。反應體系20 μL:Total RNA 4 μL,2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL,miRNA RT Enzyme Mix 2 μL, RNase-Free ddH2O 4 μL。反應程序:miRNA加A尾反應和逆轉錄42 ℃ 60 min,酶失活95 ℃ 3 min。

1.6 qRT-PCR反應

按照SYBR Green supermix熒光定量檢測試劑盒說明書方法進行miRNA第一鏈cDNA的qRT-PCR反應。反應體系20 μL:50×ROXReference Dye 2 μL,2×miRcute Plus miRNA Premix 10 μL,Reverse Primer(snU6-R)0.4 μL、Forward Primer(snU6-F)0.4 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 6.2 μL。每個皮膚組織cDNA設3個重復。反應程序:95 ℃預變性15 min;94 ℃變性20 s,60 ℃退火34 s,共40個循環。

1.7 ssc-miR-196a的保守性分析

以NCBI數據庫中9個物種的miR-196a成熟序列為參照序列(見表2),使用MEGA11軟件進行多序列比對,分析miR-196a在不同物種間的保守性。

表2 參照序列信息

1.8 ssc-miR-196a的靶基因預測及分析

因靶基因預測軟件無豬物種,多序列比對結果證實人has-miR-196a與豬ssc-miR-196a具有高度保守性,因此以人has-miR-196a-5p(5’序列可產生成熟的miRNA)(GeneID:1008263949)作為靶基因預測對象。使用在線軟件PicTar、TargetScan進行靶基因預測。利用DAVID數據庫進行ssc-miR-196a的GO(Gene Ontology)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。

1.9 數據統計

將qRT-PCR的Ct值導入Microsoft Excel 2010進行統計整理,應用2-ΔΔCt法計算各樣品中miR-196a的相對表達量。計算公式:ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內參基因)。ΔΔCt=ΔCt(黑色/白色皮膚組織)-ΔCt(白色皮膚組織)。

2 結果與分析

2.1 miR-196a在劍白香豬皮膚組織中的表達情況

由圖1可見:miR-196a在劍白香豬白色皮膚組織中的表達量極顯著高于黑色皮膚組織(P<0.01)。

圖1 miR-196a在劍白香豬皮膚組織中的相對表達

2.2 ssc-miR-196a的保守性分析

由圖2可見:ssc-miR-196a成熟序列與9個物種(10條參照序列)的相似度為100%,說明miR-196a在不同物種中具有高度保守性。

圖2 ssc-miR-196a的多序列比對

2.3 hsa-miR-196a-5p靶基因預測及功能分析

(1)由圖3可見:利用在線軟件PicTar、TargetScan分別預測了152、374個hsa-miR-196a-5p的靶基因。利用在線軟件venny 2.1.0對2個預測結果取交集,共產生81個交集靶基因。(2)利用DAVID數據庫對81個交集基因進行GO功能和KEGG通路分析。GO功能分析結果見圖4:生物過程分析結果顯示,hsa-miR-196a-5p靶基因主要富集于轉錄負調控、胚胎骨骼系統形態發生、神經元投射形態發生、皮膚形態發生、傷口愈合等過程;細胞定位分析結果顯示,靶基因主要富集于染色質、核質、核膜、內質網腔、細胞外基質和大分子復合物等位置;分子功能分析結果顯示,靶基因主要富集于生長因子結合、蛋白質結合、轉錄因子結合、雙鏈DNA結合、甲基化組蛋白結合、金屬離子結合等條目。(3)KEGG通路分析結果見圖5:hsa-miR-196a-5p靶基因主要富集于蛋白質消化吸收、癌癥miRNAs、黑色素生成等通路。其中黑色素生成通路富集到神經母細胞瘤RAS病毒(v-ras)、癌基因同系物(NRAS)、腺苷酸環化酶9(ADCY9)、鈣調素 3(CALM3)。

圖3 hsa-miR-196a-5p靶基因預測

圖4 hsa-miR-196a-5p靶基因GO功能富集分析

圖5 hsa-miR-196a-5p靶基因KEGG通路分析

3 結論

miR-196a在劍白香豬白色皮膚組織中的表達量極顯著高于黑色皮膚組織,推測miR-196a與劍白香豬的皮膚顏色遺傳相關。miR-196a-5p靶基因預測及功能分析結果表明,GO功能的生物過程、細胞定位、分子功能分別富集于38、13、27個條目,KEGG通路與黑色素生成有關的基因為NRAS、ADCY9、ALM3。

4 討論

4.1miRNAs可通過調控相關靶基因活性控制皮膚色素沉著。前阿皮黑色素皮質素(POMC)是參與色素形成的基因之一,miR-488可以通過靶向結合POMC的mRNA 3’-UTR種子序列實現對POMC mRNA的降解,從而控制小鼠皮毛的顏色[9]。本研究中miR-196a在劍白香豬白色皮膚組織中的表達量極顯著高于黑色皮膚組織,這與錦鯉紅色、白色皮膚miR-196a的相對表達量顯著高于黑色皮膚的結果一致[10]。推測miR-196a對劍白香豬的色素沉著有調控作用。

4.2在靶基因預測及分析中,KEGG通路富集與黑色素生成有關的基因有CALM3、NRAS、ADCY9。李春青[11]研究發現,ADCY9、NRAS基因對黑色素合成通路有重要作用,與地表型金線鲃相比,ADCY9和NRAS基因在洞穴型金線鲃皮膚中下調表達趨勢更加明顯,可能是限制洞穴型金線鲃黑色素合成的關鍵基因。ADCY9、NRAS基因是否對劍白香豬皮膚組織的黑色素合成過程有調控作用還需要進一步探究。