孤獨癥譜系障礙相關轉錄因子EB基因罕見變異導致神經元軸突發育障礙

胡龍妃, 譚潔瓊, 胡章雪

1.陸軍特色醫學中心兒科,重慶 400010;2.中南大學生命科學學院醫學遺傳學研究中心,湖南長沙 410000

孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)是一種神經發育障礙性疾病,全球患病率約為1%[1],具有高度遺傳性和病因異質性[2-3],ASD發病機制尚不明確,有研究表明,遺傳是ASD的主要病因,其與環境因素交互作用導致神經連接和大腦發育異常,從而導致ASD發生[4]。目前已發現100多個ASD的易感或致病基因[5-8],遺傳學研究提示,染色體異常、常見風險變異、新發和罕見的拷貝數變異及新發和罕見的基因變異等均參與ASD的發生[9-10]。有研究發現,轉錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)的3個罕見新發變異c.A520T、c.G65A和c.C1393T可能與神經發育障礙發生有關[11-12]。TFEB是轉錄因子家族MiTF/TFE的成員之一,可參與調控溶酶體生物發生及功能、細胞代謝及自噬等生命活動[13-14]。本文旨在探究TFEB的3種變異是否參與ASD的發生及其致病機制,為ASD提供新的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、細胞及儀器

Torin1(Selleckchem公司),Rapamycin(Sigma公司),DMSO和DAPI(Sigma-Aldrich公司),DMEM高糖培養基、0.05%胰蛋白酶、Opti-MEM(GibcoTM公司),Lipofectamine 2000及Lipofectamine 3000(Invitrogen公司),QIAGEN質粒Midi試劑盒、Qiagen RNeasy mini Kit、SuperScript III First-Strand Synthesis System(Qiagene公司),SYBR Green qPCR混合物(TAKARA公司),Dual-Luciferase? Reporter(DLRTM)Assay System(Promaga公司)。小鼠腦神經瘤N2a細胞、人胚胎腎細胞293(HEK293細胞)系中南大學生命科學學院醫學遺傳學研究中心保存。神經元細胞取自B6品系小鼠(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)胎鼠。實時定量PCR儀、水平電泳槽、蛋白電泳儀、轉膜儀及電源(Bio-Rad公司),解剖顯微鏡、熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡(Leica公司),超凈工作臺、CO2細胞培養箱(Thermo Scientific公司)。

1.2 構建點突變質粒及細胞轉染

通過生物學信息篩選出TFEB的3個有害變異c.G65A(p.R22Q)、c.A520T(p.I174F)和c.C1393T(p.R465W),構建點突變質粒:引物設計與突變位點兩側的序列互補,突變包含在引物序列的中間。引物退火連接。DpnI酶切1 h、轉化,提取質粒DNA并通過測序驗證。提前將N2a細胞種至24孔板中,待細胞生長至70%～90%匯合時開始轉染,每孔用50 μL Opti-MEM培養基稀釋200 ng質粒DNA,充分混勻后加入0.5 μL NeofectTM試劑,室溫靜置15～30 min。緩慢均勻地添加DNA-脂質體復合物到孔板中,37 ℃孵育細胞24～48 h進行收樣。

1.3 免疫熒光檢測TFEB WT及突變體亞細胞定位

實驗分為過表達TFEB野生型(WT)組、過表達p.R22Q組、過表達p.I174F組及過表達p.R465W組。在N2a細胞中分別轉染各組質粒,培養24 h后分別添加DMSO及1 μmol/L Torin 1(mTOR抑制劑)處理1 h,免疫熒光檢測亞細胞定位:收集細胞,加入4%多聚甲醛固定液室溫固定;PBS漂洗后加入0.1%Triton X-100/PBS室溫透化;PBS漂洗,挑出爬片,封閉1 h;加一抗4 ℃過夜;PBS漂洗,加二抗室溫避光孵育1 h;PBS漂洗,DAPI染核;PBS漂洗,封片,激光共聚焦顯微鏡掃描和拍攝。

1.4 蛋白免疫印跡檢測細胞核質比及蛋白半衰期

為進一步證實突變體是否影響TFEB的細胞定位,N2a細胞分為過表達pEGFP-N1空載體組、過表達TFEB WT組、過表達p.R22Q組、過表達p.I174F組及過表達p.R465W組。細胞進行核質分離、免疫印跡檢測細胞核質比:分別收集細胞核與細胞質,用BCA試劑盒進行蛋白定量。每組取等量樣本進行凝膠電泳,先80 V電泳30 min,后改為120 V電泳60 min。電泳后290 mA恒流轉膜1.5 h,封閉1 h,加一抗,4 ℃過夜,TBST洗膜,加二抗室溫孵育1 h,洗膜,ECL發光法顯影。內參為Lamin B1和Tubin。

變異也可以通過影響蛋白質的穩定性來增強或減弱蛋白功能,為證實突變體對蛋白穩定性的影響,實驗分為過表達TFEB WT組、過表達p.R22Q組、過表達p.I174F組及過表達p.R465W組,通過核糖體抑制劑CHX處理抑制新生蛋白質合成,免疫印跡檢測TFEB WT及點突變蛋白半衰期。各組質粒分別轉染N2a細胞,培養48 h后,將培養基換為無血清培養基,用100 g/L CHX抑制新生蛋白的合成,處理0、6、12 h后用SDS裂解細胞進行免疫印跡檢測TFEB的蛋白水平。內參為Actin。

1.5 原代小鼠神經元培養

將培養板涂覆0.1 g/L poly-D-lysine包被過夜。從E16-E18的小鼠胚胎中分離皮質組織,并小心去除腦膜和血管。將組織在37 ℃下用0.25%Trypsin-EDTA消化15 min,用含10%FBS的DMEM終止消化得到細胞懸液。計數并在添加了B27、GlutaMAX和青霉素/鏈霉素的Neurobasal培養基中以1×105個/cm2種植細胞。將神經元維持在37 ℃、5%CO2的濕潤環境中培養,每3～4天更換一半培養基。

1.6 構建mTFEB-shRNA質粒

利用NCBI及Life Technologies網站設計出3條shRNA序列,通過公司訂購合成引物。引物退火連接,酶切pLKO.1 puro克隆載體,EcoRI/AgeI酶切、連接、轉化。獲得重組質粒-pLKO.1 puro-shRNA-TFEB并經Sanger測序鑒定。

1.7 神經元磷酸鈣轉染

為研究TFEB在神經元軸突發育中的作用,實驗分為干擾組(包括shRNA-NC組、TFEB-shRNA-1組和TFEB-shRNA-2組)和過表達組(包括空載體組、TFEB WT組)。同時共轉染pEGFP-N1質粒以顯示成功轉染的神經元。首先,提前1天在24孔板中接種神經元細胞,次日開始轉染。將2.5 μg待轉染的質粒與1.9 μL 2 mol/L氯化鈣混勻,并加入ddH2O補齊體系至15 μL,再次混勻后緩慢滴加15 μL 2×HBS(pH 7.07),混勻后,室溫下避光靜置30 min。緩慢添加轉染體系到6孔板中,37 ℃孵育80 min。用Wash Solution清洗神經元,在Neurobasal培養基中繼續培養神經元至第5天時進行收樣。

為研究TFEB變異對神經元軸突發育的影響,設置NC組和TFEB-shRNA干擾組(包括過表達NC組、過表達TFEB WT組、過表達p.R22Q組、過表達p.I174F組及過表達p.R465W組)。體外培養2天時分別轉染各組質粒,于3天后收樣,通過免疫熒光檢測神經元軸突長度。

Rapamycin是自噬調控因子mTOR的抑制劑,可以激活自噬-溶酶體功能,因此設置shRNA-NC組、TFEB-shRNA組和TFEB-shRNA+Rapamycin組。在體外培養2天的胎鼠原代皮層神經元細胞中分別轉染各組質粒,于3天后收樣,通過免疫熒光檢測神經元軸突長度。

1.8 實時定量PCR檢測TFEB下游自噬-溶酶體基因表達

提取總RNA,合成互補DNA(cDNA),然后進行qPCR。條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,循環40次。使用2-ΔΔCt方法計算感興趣基因的相對表達水平,以GAPDH基因為內參。所有實驗重復3次?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 實時定量PCR的引物序列

1.9 熒光素酶報告基因測定檢測TFEB變異對其轉錄活動的影響

將HEK293細胞種在24孔板中,然后使用Lipofectamine 2000轉染4×CLEAR熒光素酶報告質粒以及Renilla熒光素酶對照質粒。48 h后,裂解細胞,熒光素酶活性使用Dual-Luciferase? Reporter(DLRTM)Assay System進行檢測。Firefly熒光素酶活性使用Renilla熒光素酶活性來進行標化,以校正轉染效率和細胞活性的變化。

1.10 統計方法

每個實驗至少重復3次,使用Image J軟件對原始圖片進行圖像分析,使用GraphPad Prism9軟件進行統計分析和統計圖像繪制。兩組數據的比較采用t檢驗,3組以上數據采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05為差異具有顯著性。

2 結 果

2.1 變異導致TFEB細胞內分布異常

過表達TFEB WT和突變體免疫熒光結果顯示TFEB亞細胞定位,TFEB WT主要定位于細胞質,突變體p.R22Q及p.R465W主要定位于細胞核,而突變體p.I174F定位于細胞質,但所有的突變體在自噬激活劑Troin處理后,與WT一樣都能正常定位于細胞核內(圖1)。分離細胞質和細胞核,免疫印跡檢測顯示,點突變p.R22Q及p.R465W與野生型相比,核質比增加;而點突變p.I174F核質比較野生型差異無顯著性(圖2)。

圖1 TFEB變異對其亞細胞定位的影響(600×)綠色為TFEB-GFP WT及突變體,藍色為DAPI標記的細胞核。

圖2 變異對TFEB核分布的影響(n=4)a為P<0.05,與WT比較。

2.2 變異不影響TFEB蛋白的穩定性

如圖3所示,TFEB的這3種變異蛋白的穩定性均未發生顯著改變。

圖3 變異對TFEB蛋白穩定性的影響(n=3)

2.3 TFEB調控原代培養神經元的軸突生長

通過在原代培養的神經元中轉染兩個靶向TFEB不同位點的shRNA來干擾TFEB的表達,探討TFEB對神經元軸突發育的影響,結果顯示,TFEB干擾后能顯著減少神經元的軸突長度(圖4A),而過表達TFEB-GFP則能增加神經元軸突的長度(圖4B)。

圖4 TFEB在體外調控原代培養神經元的軸突生長A為干擾內源性TFEB;B為過表達TFEB。a為P<0.001,與shRNA-NC或Vector比較。

2.4 TFEB變異導致軸突長度縮短

如圖5A所示,p.R22、p.I174和p.R465在人、猴、小鼠和大鼠中都非常保守,這些位點的變異可能導致蛋白質功能的改變。在干擾TFEB后,再過表達TFEB WT可以恢復由干擾內源性TFEB引起的神經元突觸縮短,而p.R22Q、p.I174F和p.R465W變異則不能恢復該神經元突觸縮短(圖5B、C),表明這些突變體已經損害了TEFB的神經軸突發育促進功能。

圖5 ASD相關的TFEB變異導致體外原代培養神經元的軸突長度縮短A為TFEB氨基酸序列的保守性分析;B和C為干擾內源性TFEB后分別過表達野生型TFEB及突變體的軸突生長情況。a為P<0.05,b為P<0.01,與WT比較。

2.5 自噬激動劑Rapamycin恢復由TFEB缺陷引起的軸突縮短

Rapamycin可以恢復由TFEB干擾引起的神經元軸突縮短(圖6),這表明TFEB可能通過調節自噬-溶酶體功能影響神經元軸突發育。

圖6 Rapamycin恢復由TFEB缺陷引起的軸突縮短a為P<0.05,b為P<0.01,與shRNA-TFEB比較。

2.6 TFEB變異導致自噬-溶酶體基因表達降低

過表達野生型TFEB可以增加自噬-溶酶體相關基因的表達,而p.R22Q、p.I174F和p.R465W變異則不能(圖7),表明這些突變體已經損害了TEFB的自噬-溶酶體基因的轉錄活性。

圖7 ASD相關的TFEB變異導致自噬-溶酶體基因表達降低A為過表達野生型TFEB和突變體后自噬-溶酶體相關基因的表達水平;B為野生型TFEB及突變體的4X-CLEAR熒光素酶活性。a為P<0.05,b為P<0.01,與WT比較。

3 討 論

自噬是所有真核生物中高度保守的細胞分解過程,參與多種維持細胞穩態的生理過程,例如適應代謝應激、清除細胞異常和防止DNA損傷[15-16]。溶酶體通過mTORC1-TFEB軸在營養感知和信號轉導中發揮積極作用[17-19]。TFEB是自噬-溶酶體形成的最重要的轉錄因子,對細胞代謝、生長、凋亡、分化和其他細胞生理功能起著關鍵作用。TFEB的功能異?？梢詫е伦允?溶酶體功能障礙,Rapamycin是自噬調控因子mTOR的抑制劑,可以激活自噬-溶酶體功能。自噬途徑可能參與了ASD的發病機制。文獻[20]在ASD病例中發現自噬途徑相關的基因外顯子拷貝數變異增加,通過富集和通路分析ASD病例中的相關基因,他們觀察到包括GABARAPL2、GABARAPL1、MAP1LC3A、GABARAP和MAP1LC3B在內的5個與自噬相關的基因的顯著富集,這些基因是酵母自噬基因Atg8的哺乳動物同源物,這項研究表明自噬在ASD中發生了失調。PTEN變異介導的mTOR的激活(抑制自噬)在小鼠中表現出孤獨癥樣行為和異常的神經元樹突結構,這也表明自噬在ASD的發生中可能起重要作用[21]。同時,缺乏ambra-1(beclin-1的一個正調控因子,是自噬體形成的主要參與者)的雌性小鼠觀察到了類似于孤獨癥的表型,這進一步表明ASD中自噬可能存在失調[22]。雷帕霉素作為mTOR的抑制劑可以激活自噬,恢復孤獨癥癥狀,并改善PTEN變異小鼠的異常神經解剖結構[23-24]。最近的研究在ASD患者死亡后的顳葉皮層中也觀察到過度活躍的mTOR和受損的自噬[25]。

總之,本研究發現,作為自噬-溶酶體功能最重要的轉錄調節因子TFEB變異可能參與ASD的發生,導致神經元軸突生長的損害,同時,自噬的激活能恢復TFEB變異引起的神經軸突縮短,提示TFEB和自噬溶酶體功能缺陷參與了ASD疾病的發生。