槲皮素調控Nrf2/HO-1 信號通路抗氧化應激的機制研究

★ 余良昆 李勇 鐘發明 龍世杰 熊朋朋 劉欣 徐王兵（.江西中醫藥大學研究生院 南昌 330004；.江西中醫藥大學附屬醫院脊柱一科 南昌 330006）

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是由多種因素引起的慢性疾病，其特征是骨量下降和骨微結構破壞，導致骨折風險增加［1-2］。隨著人口老齡化的加劇，骨質疏松癥的發病率也在逐年上升［3］。在世界范圍內，每3 s 就會發生一起骨質疏松性骨折，這不僅給病人帶來痛苦，也給社會帶來了沉重的經濟負擔［4］。

研究發現，氧化應激是骨質疏松癥發生和發展的關鍵因素［5-6］。雌激素缺乏和衰老都可以誘導氧化應激，從而增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生，過量的ROS 會導致細胞內脂質、蛋白質和DNA 損害，最終誘導細胞凋亡［7-8］。此外，ROS 會減少成骨細胞形成，提高破骨細胞骨吸收水平［9］。臨床上，一些抗氧化劑如維生素E、維生素C 和乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）已被用作骨質疏松癥的替代治療劑，并取得了可觀的治療效果［10-11］。

槲皮素在植物界分布廣泛，是具有多種生物活性的黃酮醇類化合物，具有抗氧化、抗凋亡和抗骨質疏松的作用［12-13］。槲皮素能夠直接清除自由基、抑制脂質過氧化。有研究表明，槲皮素能促進成骨細胞的分化，抑制破骨細胞的形成［14］。這些證據表明，槲皮素對維持骨穩態具有積極作用，然而槲皮素對氧化應激狀態下的MC3T3-E1 細胞的保護作用及分子機制尚未明確。因此，本研究通過構建氧化應激損傷細胞模型，探討槲皮素對MC3T3-E1細胞的保護作用及潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

槲皮素（純度＞98%，CAS：117-39-5），購自成都瑞芬思生物科技有限公司；3%過氧化氫溶液（hydrogen peroxide，H2O2）、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松購自德國默克公司；胎牛血清、MEMα培養基購自賽默飛生物公司；青霉素、鏈霉素購自?？寺∩锕?；CCK-8 試劑盒、總SOD 活性檢測試劑盒、MDA 檢測試劑盒、堿性磷酸酶染色試劑盒、堿性磷酸酶活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司；茜素紅S 染色溶液購自賽業生物公司；引物合成由北京擎科生物公司完成；一抗Runx2、Osterix、Nrf2、HO-1、β-actin 購自Cell Signaling Technology公司；Bax、Bcl-2、Caspase3 購自Affintiy 公司；二抗購自Affintiy 公司。

1.2 細胞培養

小鼠胚胎成骨細胞（MC3T3-E1）購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。將細胞培養在含有10%胎牛血清和1%抗生素的MEMα 培養基中，細胞每2 d 更換一次培養基，當細胞融合至80%～90%時進行傳代。P3-P6 代細胞用于后續實驗。

1.3 MC3T3-E1 細胞氧化應激模型的構建及藥物干預

本研究使用200 μmol/L H2O2干預細胞構建氧化應激損傷模型［15］，細胞分為對照組、模型組（200 μmol/L H2O2）、低濃度組（200 μmol/L H2O2+2.5 μmol/L 槲皮素）、高濃度組（200 μmol/L H2O2+5 μmol/L 槲皮素）。

1.4 MC3T3-E1 細胞增殖檢測

將細胞接種到96 孔板（每孔3×103個細胞）中，細胞貼壁后，在含或不含H2O2的培養基中加入不同濃度的槲皮素（0，1，2.5，5，10，20，40 μmol/L）干預24 h，干預結束后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h，使用酶標儀檢測450 nm 處的吸光值。

1.5 MC3T3-E1 細胞成骨誘導及ALP、ARS 染色

將細胞接種到12 孔板（每孔1×105個細胞）中，細胞貼壁后分組干預并使用成骨誘導培養基（地塞米松：10 nmol/L，維生素C：50 μg /mL，β-甘油磷酸鈉：10 mmol/L）進行成骨誘導。細胞分為單純成骨誘導組（對照組）、成骨誘導+200 μmol/L H2O2組（模型組）、低濃度組（成骨誘導+200 μmol/L H2O2+2.5 μmol/L 槲皮素）、高濃度組（成骨誘導+200 μmol/L H2O2+5 μmol/L 槲皮素），細胞每3 d更換一次培養基。成骨誘導7 d 后進行ALP 染色，使用PBS 清洗細胞3 遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗3 遍后進行ALP 染色。成骨誘導14 d 后進行ARS 染色，使用PBS 清洗細胞3 遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗3 遍后進行ARS 染色。

1.6 細胞內總SOD 含量檢測

將細胞接種到 6 孔板（每孔3×105個細胞）中，細胞貼壁后按上述分組干預細胞24 h。干預結束后收集各組細胞樣品，按照SOD 活性檢測試劑盒說明書配置工作液，37 ℃孵育30 min 后使用酶標儀檢測450 nm 處的吸光值。根據標準曲線計算各組細胞樣品的SOD 活性。

1.7 細胞內總MDA 含量檢測

細胞干預如前所述，干預結束后收集各組細胞樣品，按照MDA 檢測試劑盒說明書配置工作液，與樣品混勻后100 ℃加熱15 min，水浴冷卻至室溫，1 000 g 室溫離心10 min。取200 μL 上清液加入到96 孔板中，隨后用酶標儀在532 nm 處測定吸光度。根基標準曲線計算各組細胞樣品中的MDA含量。

1.8 qRT-PCR

將細胞以每孔3×105個細胞的密度接種于6 孔板，干預方式如前所述，干預結束后收集各組細胞，使用RNA 提取試劑盒提取總RNA，測量濃度后使用PrimeScript RT reagent 試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA。采用SYBR Green 染色法，以各組cDNA 為模板，加入緩沖液、引物后參考說明書采用以下參數進行PCR 擴增：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 40 s，共40 個循環。以18 s 為內參，采用2-ΔΔCt法計算相對mRNA 表達量。所有引物序列見表1。

表1 引物序列

1.9 Western blot

細胞干預結束后使用Ripa 裂解液提取總蛋白。使用SDS-PAGE 膠電泳分離蛋白，隨后轉移到 PVDF 膜，用5%脫脂牛奶于室溫下封閉 2 h，加入一抗Runx2、Osterix、Nrf2、HO-1、β-actin、Bax、Bcl-2、Caspase3 在4 ℃孵育12 h，孵育結束后使用 TBST 清洗3 遍，二抗孵育1.5 h，TBST 清洗3 次后使用凝膠成像儀進行顯影。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 槲皮素對MC3T3-E1 細胞活力和增殖的影響

CCK-8 結果顯示10 μmol/L 以下濃度的槲皮素對MC3T3-E1 細胞無明顯毒性作用，當槲皮素濃度大于20 μmol/L 時會對細胞的增殖產生明顯的抑制作用（P＜0.05），見表2。此外，200 μmol/L H2O2明顯抑制MC3T3-E1 細胞增殖（P＜0.05），槲皮素（1，2.5，5，10，20 μmol/L）能夠減輕H2O2對MC3T3-E1 細胞增殖抑制（P＜0.05），見表3。這說明槲皮素對氧化應激狀態下的MC3T3-E1 細胞具有保護作用。結果可知2.5，5 μmol/L 濃度的槲皮素對細胞沒有毒性作用，因此選擇2.5，5 μmol/L 濃度的槲皮素進行后續實驗。

表2 槲皮素對MC3T3-E1細胞活性的影響

表3 槲皮素對H2O2誘導的MC3T3-E1細胞活性的影響

2.2 槲皮素對MC3T3-E1 細胞成骨分化功能的影響

通過比較各組ALP、ARS 染色結果，發現200 μmol/L H2O2明顯降低了MC3T3-E1 細胞的成骨分化能力。見圖1。相比于對照組，模型組細胞的ALP 染色顏色更淺；此外，ARS 染色顏色較淺，觀察到的礦化結節數量也較少。然而，槲皮素組的ALP、ARS 染色顏色較模型組深，ARS 染色觀察到更多的礦化結節，表明槲皮素能夠減輕H2O2誘導的MC3T3-E1 細胞成骨分化功能障礙。

圖1 ALP、ARS染色評估槲皮素對H2O2誘導的MC3T3-E1細胞成骨分化功能的影響

2.3 槲皮素對氧化應激的影響

丙二醛（malondialdehyde，MDA）是一種重要的氧化應激物質，能夠誘導活性氧（reactive oxygen species，ROS）的形成。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物體內存在的一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和H2O2，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用。通過檢測細胞內MDA 含量，發現H2O2干預后明顯增加了細胞內MDA 含量（P＜0.05），而槲皮素以濃度依賴的方式降低了細胞內MDA 含量。此外，發現H2O2明顯降低了細胞內SOD 活性，槲皮素干預后增加了細胞內SOD 活性（P＜0.05），表明槲皮素具有很好的抗氧化作用。見表4。

表4 槲皮素對H2O2誘導的MC3T3-E1細胞中MDA、SOD水平的影響

2.4 槲皮素對成骨分化和凋亡的影響

qRT-PCR 檢測結果表明，H2O2干預明顯降低了細胞中Runx2 和Osterix 的表達，槲皮素干預后以劑量依賴方式增加了它們的表達。此外，H2O2干預明顯增加了細胞中凋亡相關基因Bax、Caspase3 的表達，降低了Bcl-2 的表達。然而，槲皮素干預后降低了Bax、Caspase3 的表達，增加了Bcl-2 的表達（P＜0.05），見表5。Western blot 得到了類似的結果，相較于模型組，槲皮素干預后增加了Runx2、Osterix 和Bcl-2 的蛋白表達，降低了Bax、Caspase3 的蛋白表達（P＜0.05），見表6、圖2。這些結果表明，槲皮素能夠減輕H2O2誘導的MC3T3-E1 細胞凋亡，增強MC3T3-E1 細胞氧化應激狀態下的成骨分化功能。

圖2 Western blot檢測Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2和Caspase3的代表性條帶

表5 槲皮素對H2O2誘導的MC3T3-E1細胞中Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2和Caspase3基因表達的影響

表6 槲皮素對H2O2誘導的MC3T3-E1細胞中Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2和Caspase3蛋白表達的影響

2.5 槲皮素對Nrf2/HO-1 信號通路的影響

為進一步研究槲皮素在MC3T3-E1 細胞中的抗氧化機制，Western blot 實驗發現H2O2干預后部分增加了Nrf2、HO-1 的蛋白表達，相較于對照組和模型組，槲皮素干預后明顯增加了Nrf2、HO-1 的蛋白表達（P＜0.05），見圖3、表7。這些結果表明，槲皮素可能是通過激活Nrf2/HO-1 信號通路減輕MC3T3-E1 細胞中H2O2誘導氧化應激損傷。

圖3 Western blot檢測Nrf2和HO-1的代表性條帶

表7 槲皮素對H2O2誘導的MC3T3-E1細胞中Nrf2和HO-1的蛋白表達水平的影響

3 討論

研究表明過量的ROS 會抑制成骨細胞骨形成，增加破骨細胞骨吸收，導致骨丟失和骨質疏松［16］。有研究發現，絕經后骨質疏松癥婦女的BMD 下降與血漿脂質的高氧化性和SOD、H2O2酶和谷胱甘肽過氧化物酶的功效降低有關［17-19］。因此，尋找新的抗氧化劑來抑制氧化損傷已經成為預防和治療骨質疏松癥的策略。H2O2是一種活性氧，它可以穿過生物膜并產生廣泛損傷，據報道，H2O2能夠誘導各種類型細胞的凋亡或壞死［20-21］。Sun等［22］研究表明，200 μmol/L H2O2處理24 h 顯著減低MC3T3-E1 細胞的生存率，200 μmol/L H2O2適合于誘導體外氧化應激模型。因此，在本研究中使用200 μmol/L H2O2構建氧化損傷模型。數據顯示，H2O2處理后明顯增加了細胞內MDA 含量，而槲皮素以濃度依賴的方式降低了細胞內MDA含量。此外，我們發現槲皮素干預后增加了細胞內SOD活性，這表明槲皮素處理后在一定程度上減輕了H2O2的毒性。

據報道，H2O2誘導的氧化損傷會降低成骨分化標志物的表達，抑制成骨細胞分化［23-24］。我們的研究表明，H2O2干預與細胞堿性磷酸酶活性降低、鈣礦化減少、成骨基因Runx2 和Osterix 表達降低有關。此外，數據顯示，槲皮素可以逆轉H2O2誘導的成骨分化抑制。因此，我們推測槲皮素的抗氧化特性提高了MC3T3-E1 細胞的存活率，降低了氧化應激損傷和成骨分化抑制。

細胞凋亡是一種程序性的細胞死亡，受到多種因素的嚴格調控［25］。有研究表明，H2O2可誘發成骨細胞的凋亡，導致骨微結構的改變，從而導致骨質疏松癥［26］。細胞凋亡受到多個基因的嚴格控制，包括Bcl-2 家族和Caspase 家族。Bcl-2 通過調節促凋亡和抗凋亡之間的平衡來維持線粒體的完整性，而Bax 通過增強線粒體膜通透性和改變跨膜電位來促進細胞色素C 從線粒體釋放到細胞質中，引起半胱氨酸天冬氨酸裂解酶的級聯反應，最終導致Caspase3 的激活并引發細胞凋亡［27-28］。在本研究中，Western blot 結果顯示，H2O2處理明顯增加了MC3T3-E1 細胞中Bax 和Caspase3 的蛋白表達，并下調了Bcl-2 的表達。然而，槲皮素干預后降低了Bax 和Caspase3 的表達，增加了Bcl-2的表達。這些結果表明，槲皮素可以減輕氧化應激引起的細胞凋亡。

Nrf2 是一個眾所周知的轉錄因子，在抗氧化中起著關鍵作用。最近，Nrf2/HO-1 信號通路被證明可作為一種內源性抗氧化劑，拮抗多個器官中的氧化應激損傷［29］。實驗證實，激活Nrf2/HO-1 信號通路能夠增強多種抗氧化劑的表達，保護心肌細胞免受氧化應激損傷［30］。

此外，多項研究表明，Nrf2/HO-1 信號通路在骨質疏松癥起重要作用［31］。在本研究中，我們發現槲皮素明顯增加了Nrf2、HO-1 的蛋白表達，這說明槲皮素能夠激活Nrf2/HO-1 信號通路，減輕MC3T3-E1 細胞的氧化應激損傷、凋亡和成骨分化功能障礙。

綜上所述，本研究通過構建體外氧化應激模型研究槲皮素對MC3T3-E1 細胞的保護作用，發現槲皮素能夠減輕H2O2誘導的細胞凋亡和成骨分化功能障礙，這可能是通過Nrf2/HO-1 信號來實現的。