山柰酚對溴氰菊酯誘導鹵蟲氧化應激的保護作用

馬丹丹，隋麗英，周慶禮，郭慶彬，潘娜敏，李貞景

(1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津科技大學海洋與環境學院，天津 300457)

我國是世界上從事水產養殖歷史最悠久的國家之一。近年來，隨著越來越多的消費者對海鮮等水產制品的喜愛，水產養殖業發展迅速，已經成為我國經濟發展的主要產業之一。然而，目前水產養殖動物發病率和死亡率不斷升高，導致水產品質量下降，影響水產養殖業的健康發展。2020 年安徽省水產養殖動物因疫病死亡而帶來的經濟損失約為4.18 億元人民幣，動物平均發病率為 7.59% ，平均死亡率為4.85%[1]。隨著農藥施用量的增加，生態環境監測機構多次從水生動物養殖水體中檢測到農藥殘留，樣品中農藥檢出率高達 55.36% ，其中溴氰菊酯(deltamethrin，DEL)的檢出率為14.41%[2]。溴氰菊酯的化學式為C22H19Br2NO3，是一種Ⅱ型擬除蟲菊酯殺蟲劑，被廣泛用于農作物等生物靶向防蟲除害和水產養殖動物寄生蟲防治[3-4]。然而，隨著溴氰菊酯的廣泛使用，該物質很可能通過地表徑流和生活廢水流入河流和湖泊。在珠江河口、福建近海和渤海灣近海沉積物中檢測到DEL 的殘留濃度為10～100 μg/L，已超過歐盟推薦標準[5]。溴氰菊酯疏水性較強，且在水生生物體內的代謝和排泄能力較弱，極易導致水生動物中毒死亡[6]。目前，溴氰菊酯的生態毒性已經在魚、蝦、蟹等不同種類的水生動物身上得到了研究，溴氰菊酯暴露能顯著引起中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis) 、斑 馬 魚(Danio rerio) 、尼 羅 羅 非 魚(Oreochromis niloticus)等水生生物產生組織損傷、代謝紊亂、免疫毒性和細胞凋亡[7]，導致生物體內丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平顯著升高，以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)的活性降低[8-10]?？寡趸瘎┤缃S素、槲皮素和莧籽提取物在小鼠[11]、翠澧(Channa punctata)[12]和烏澧(Channa argus)[13]等動物中對溴氰菊酯誘導的氧化應激和神經毒性具有明顯的改善作用。這說明抗氧化劑是用于緩解溴氰菊酯誘導的氧化應激和不良影響的潛在治療劑。

山柰酚(kaempferol，Ka)是一種天然多酚類黃酮，主要以山柰酚苷的形式廣泛存在于西蘭花、茶葉、豆類和草莓中[14]，具有抗氧化、抗癌、抗炎和神經保護的作用[15-16]。山柰酚能夠降低油酸誘導的HepG2 細胞的脂質堆積和氧化應激[17]。山柰酚通過調控Nrf2/HO-1 信號通路改善由H2O2和百草枯暴露血管損傷小鼠的氧化應激和炎癥反應[18]。但是，關于山柰酚對水生生物氧化應激改善作用的研究較少。

水生甲殼類動物對溴氰菊酯的毒性也非常敏感[8]。鹵蟲是一種小型、低等的甲殼動物，廣泛分布于鹽田和咸水湖泊，是水產經濟動物苗種的重要開口餌料[19]。鹵蟲因其生命周期短、后代產量大、對污染物高度敏感等特點，成為水生生態毒理學研究中常用的實驗動物[20]。本研究以鹵蟲為研究對象，評估山柰酚對溴氰菊酯誘導鹵蟲抗氧化能力的影響，旨在進一步為黃酮類化合物減輕水生動物氧化損傷提供直接的實驗依據及有效的干預措施。同時，將Ka 作為餌料添加劑投喂水生動物也會降低養殖成本，提高水產行業的經濟效益，具有廣泛的應用前景。

1 材料與方法

1.1 鹵蟲孵化與養殖條件

本實驗所用的孤雌生殖鹵蟲由天津科技大學海洋與環境學院亞洲區域鹵蟲參考中心提供。

鹵蟲的孵化條件：溫度28 ℃，鹽度30 g/L，光照強度 2 000 lx，連續充氣[21]。孵化24 h 后收集鹵蟲無節幼體，轉移至水族箱中進行培養，鹽度30 g/L，保持密度為1 個/mL。養殖管放入水箱中，28 ℃恒溫養殖，光/暗周期為 14 h/10 h，每天分別在 9：00 和21：00 投喂Chlorella，每天的總投喂量為105個/mL，每2 天換1 次水，每隔12 h 及時補充蒸發掉的水。

1.2 試劑與儀器

人造海水(ASW)，鹽度 30 g/L，美國 Instant Ocean 公司；MDA、SOD、CAT、GSH-Px 試劑盒，南京建成生物工程研究所；總 RNA 提取試劑盒、PrimeScriptTMRT 試劑盒，日本Takara 公司。

SZ61型立體顯微鏡，Olympus 公司；SZX12 型體視顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；FLX800TBI 型熒光酶標儀，美國BioTek 儀器公司；NanoDrop 2000 型微量紫外分光光度計，美國Thermo Scientific 公司；

1.3 指標分析

1.3.1 溴氰菊酯對鹵蟲的急性毒性實驗

設定 7 個梯度組(0、0.001、0.01、0.1、1、5、10 μg/L)進行溴氰菊酯暴露實驗，實驗過程中停止投喂餌料。每組設計3 個平行，每個平行為100 只鹵蟲無節幼體，36 h 后對各組鹵蟲進行觀察并記錄鹵蟲的存活率，采用Probit 回歸模型計算溴氰菊酯對鹵蟲的半致死濃度(LC50)。以36 h-LC50為1 個毒性單位(toxic unit)，記為1 TU。

1.3.2 鹵蟲孵化率、體長和存活率的測定

實驗設置空白對照(Control)組、二甲基亞砜(DMSO)組、DEL 組、Ka 組和DEL＋Ka 組，其中選擇0.105 μg/L(0.5 TU)溴氰菊酯和山柰酚(0.01、0.1、0.5、1 mg/mL)進行實驗。Control 組鹵蟲進行常規培養，各處理組鹵蟲分別加入DEL 或Ka 配制培養液，其他培養條件均與Control 組一致。

鹵蟲孵化率的測定：1.60 g 孤雌生殖鹵蟲卵置于含有1 L 孵化液(人造海水)的錐形孵化管中孵化。孵育24 h 后，用50 μL 移液槍分6 次隨機取樣，置于24孔板內，通過SZ61 型立體顯微鏡在計數室中記錄不同處理組中樣品的無節幼體、傘狀幼體和未孵化卵的數量，每個處理組設置3 個平行。孵化率(H)按式(1)計算。

式中：n1、n2、n3分別為無節幼體、傘狀幼體和未孵化卵的數量。

鹵蟲生長實驗：將同一時間孵化的、大小均勻的Ⅰ期無節幼體轉移到1 L 孵化管中培養，養殖密度為1 個/mL。在16 d 的培養過程中，每2 d 從孵化管中分3 次隨機取出150 mL 培養液，統計各組取樣液中鹵蟲的存活率。同時，每2 d 從各處理組中取出15 只鹵蟲，用SZX12 型體視顯微鏡及其軟件進行圖像采集并測定其體長。

1.3.3 鹵蟲抗氧化酶活性和脂質過氧化物含量的測定

實驗設置Control 組、DEL 組、Ka 組和DEL＋Ka 組，其中DEL 質量濃度為0.105 μg/L，根據不同處理組鹵蟲個體水平相關指標測定結果，本實驗選擇0.1 mg/mL Ka 進行實驗。將大小均勻、生長良好的無節幼體鹵蟲轉移至200 mL 錐形培養管中，培養液中分別溶解不同濃度的DEL 或Ka，每組約200 只鹵蟲，培養至成熟期(約16 d)，每組設置3 個平行。從各給藥組中隨機取出50 只鹵蟲，用相同溫度的清水清洗3 次，除去鹵蟲表面的鹽漬；收集各處理組的鹵蟲置于5 mL 離心管中，用生理鹽水(質量體積比1∶9)均質。組織勻漿在4 ℃、12 000 g 條件下離心15 min，取上清液。上清液用試劑盒測定抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)及丙二醛(MDA)的含量。

采用熒光染料2′，7′-二氯乙酸熒光素(DCFHDA)測定不同處理組鹵蟲的ROS 水平。將上清液轉移至96 孔板，用10 μmol/L DCFH-DA 在37 ℃黑暗環境下孵育30 min，利用FLX800TBI 型熒光酶標儀測定不同處理組鹵蟲的熒光強度(激發波長488 nm，發射波長525 nm)。

1.3.4 實時熒光定量PCR

實驗按照1.3.3 節的方法處理鹵蟲。處理結束后，隨機取出10 只鹵蟲成體，除去表面的鹽漬，收集在1.5 mL 離心管中，在冰上進行RNA 提取。鹵蟲總RNA 采用Trizol 法提取，采用NanoDrop 2000 型微量紫外分光光度計對提取的RNA 進行定量和定性測定。僅采用高質量RNA(A260/A280范圍為1.8～2.2，RIN 8.0)進行實時熒光定量 PCR 分析。使用PrimeScriptTMRT 試劑盒進行cDNA 合成。以β-actin基因為管家基因[22]，利用實時熒光定量引物設計軟件Primer Premier 5.0 設計引物(表1)。采用SYBR Green 法進行實時熒光定量 PCR。將20 μL(0.8 μL正向引物、0.8 μL 反向引物、10 μL 2×TB Green Premic Ex TaqⅡ、2.4 μL cDNA 和6.0 μL RNase-free water)反應物混合，95 ℃擴增30 s，95 ℃ 5 s，退火30 s，循環40 次，72 ℃擴增30 s，每組樣品進行3 次技術重復。靶基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

表1 引物Tab.1 Primers

1.3 數據統計學分析

使用Excel 和GraphPad Prism 軟件對數據進行記錄、統計分析并作圖。對統計結果進行單因素方差分析，用Duncan’s 多重比較分析檢測顯著性差異，不同字母表示組間具有顯著性差異(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 溴氰菊酯對鹵蟲的急性毒性

不同質量濃度溴氰菊酯脅迫鹵蟲的存活率如圖1 所示。溴氰菊酯和鹵蟲存活率之間具有良好的劑量-效應關系。溴氰菊酯對鹵蟲的 LC50為0.210 μg/mL，95%可信區間為0.097～0.401，回歸方程為 y ＝-0.634-0.909 x，R2＝0.983。按照 GB/T 15670—2017《農藥登記毒理學試驗方法》農藥毒性分級標準，溴氰菊酯的安全質量濃度為0.001 2 μg/L，因此溴氰菊酯對于鹵蟲屬于劇毒性污染物。

圖1 不同質量濃度溴氰菊酯脅迫鹵蟲的存活率Fig.1 Survival rates of Artemia when exposed to different concentrations of deltamethrin for 36 h

2.2 山柰酚對鹵蟲孵化率、存活率和體長的影響

溴氰菊酯和不同濃度的山柰酚對鹵蟲孵化率的影響如圖2 所示。DMSO 組鹵蟲孵化率與Control 組沒有顯著差異(P＞0.05)。DEL 組鹵蟲的孵化率和Control 組相比顯著下降(P＜0.05)。在溴氰菊酯暴露鹵蟲培養液中加入不同質量濃度Ka 后，和DEL 組相比，DEL＋0.01 Ka 組、DEL＋0.1 Ka 組和DEL＋0.5 Ka 組鹵蟲的孵化率顯著提高(P＜0.05)，DEL＋1 Ka 組鹵蟲孵化率顯著下降(P＜0.05)。當不同質量濃度Ka 單獨培養時，和Control 組相比，0.01 Ka 組鹵蟲孵化率顯著下降(P＜0.05)，0.1 Ka 組和0.5 Ka組鹵蟲的孵化率沒有顯著差異(P＞0.05)，1 Ka 組鹵蟲的孵化率顯著下降(P＜0.05)。

圖2 溴氰菊酯和不同質量濃度的山柰酚對鹵蟲孵化率的影響Fig.2 Hatching percentage of Artemia when exposed to DEL and different concentrations of Ka

溴氰菊酯和不同質量濃度的山柰酚對鹵蟲存活率和體長的影響如圖3 所示。由圖3(a)可知：DMSO組鹵蟲存活率與Control 組沒有顯著差異(P＞0.05)。在溴氰菊酯誘導鹵蟲的1～5 d，各處理組鹵蟲的存活率和Control 組沒有顯著差異(P＞0.05)。隨著培養時間的增加，DEL 組鹵蟲的存活率顯著低于Control 組(P＜0.05)。在DEL 處理鹵蟲的培養液中同時加入不同濃度Ka，與DEL 組相比，DEL＋0.01 Ka 組存活率沒有顯著差異(P＞0.05)，DEL＋0.1 Ka 組和DEL＋0.5 Ka 組存活率顯著提高(P＜0.05)，DEL＋1 Ka 組存活率顯著降低(P＜0.05)，但以上處理組和Control組相比，存活率顯著降低(P＜0.05)。在鹵蟲的培養液中單獨加入Ka 時，Ka 對鹵蟲的存活率也有顯著的影響。與Control 組相比，0.01 Ka 組存活率沒有顯著差異(P＞0.05)，0.1 Ka 組和0.5 Ka 組存活率顯著提高(P＜0.05)，1 Ka 組存活率顯著降低(P＜0.05)。通過整個實驗周期的存活率測定，溴氰菊酯和山柰酚對鹵蟲存活率的影響主要體現在鹵蟲的成體期。

圖3 溴氰菊酯和不同質量濃度的山柰酚對鹵蟲存活率和體長的影響Fig.3 Effects of DEL and different concentrations of Ka on the survival rate and body length of Artemia

由圖3(b)可知：DMSO 組鹵蟲體長與Control 組沒有顯著差異(P＞0.05)。溴氰菊酯在給藥第4 天開始對鹵蟲生長具有抑制作用。同時給藥DEL 和不同質量濃度Ka 后，DEL＋0.01 Ka 組、DEL＋0.5 Ka 組、DEL＋1 Ka 組與DEL 組沒有顯著差異(P＞0.05)，DEL＋0.1 Ka 組鹵蟲體長在第10 天開始顯著提高(P＜0.05)，但仍低于Control 組。鹵蟲單獨給藥Ka時，與Control 組相比，0.01 Ka 組和0.5 Ka 組無顯著差異(P＞0.05)，1 Ka 組顯著降低(P＜0.05)，0.1 Ka組顯著提高(P＜0.05)。山柰酚的改善作用主要從第10 天開始體現。

2.3 山柰酚對鹵蟲抗氧化酶及脂質過氧化物含量的影響

溴氰菊酯和山柰酚對鹵蟲SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA 含量的影響如圖4 所示。

圖4 溴氰菊酯和山柰酚對鹵蟲SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA含量的影響Fig.4 Effects of DEL and Ka on the SOD，CAT，GSH-Px enzyme activities and MDA contents in Artemia

與Control 組相比，溴氰菊酯能夠顯著降低鹵蟲體內SOD、CAT、GSH-Px 活性，MDA 含量顯著上升(P＜0.05)。當單獨加入0.1 mg/mL 山柰酚時，鹵蟲的SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA 含量與Control 組沒有顯著差異(P＞0.05)。在溴氰菊酯暴露鹵蟲的培養液中加入0.1 mg/mL 山柰酚后，鹵蟲的CAT 和GSH-Px 活性和DEL 組相比顯著提高(P＜0.05)，但仍低于Control 組；MDA 含量下降，但沒有顯著差異(P＞0.05)；鹵蟲的SOD 活性和Control 組相比沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.4 山柰酚對鹵蟲ROS含量的影響

溴氰菊酯暴露和山柰酚對鹵蟲ROS 水平的影響如圖5 所示。與Control 組相比，DEL 組ROS 水平顯著增加(P＜0.05)。與DEL 組相比，Ka 組和DEL＋Ka 組鹵蟲的ROS 水平顯著下降(P＜0.05)，但與Control 組沒有顯著差異(P＞0.05)。

圖5 溴氰菊酯和山柰酚對鹵蟲ROS水平的影響Fig.5 Effect of DEL and Ka on ROS production in Artemia

2.5 山柰酚對鹵蟲Nrf2 信號通路相關基因表達量的影響

溴氰菊酯和山柰酚對鹵蟲Nrf2 信號通路中相關基因的影響如圖6 所示。

圖6 溴氰菊酯和山柰酚對鹵蟲Nrf2 信號通路關鍵基因表達的影響Fig.6 Effects of DEL and Ka on the expression of key genes in the Nrf2 signaling pathway of Artemia

與Control 組相比，DEL 組中基因SOD、GST、NOQ1 和HO-1 的表達量顯著下降(P＜0.05)，基因CAT 和Nrf2 表達量下降，但沒有顯著性差異(P＞0.05)，基因Keap1 的表達量顯著上升(P＜0.05)。Ka組鹵蟲中基因SOD、CAT、GST、Keap1、NOQ1 和HO-1 的表達量和Control 組均沒有顯著差異(P＞0.05)，Nrf2 的表達量高于Control 組(P＜0.05)。與DEL 組相比，DEL＋Ka 組鹵蟲中基因CAT、GST、Nrf2、NOQ1 和HO-1 顯著上升(P＜0.05)，但基因SOD 表達量沒有顯著差異(P＞0.05)，基因Keap1 表達量顯著下降(P＜0.05)。

3 討 論

甲殼類動物是對擬除蟲菊酯化合物最敏感的物種群[23]。將甲殼類動物草蝦(Palaemonetes pugio)作為毒性測試物種進行急性毒性實驗，結果表明，5 種擬除蟲菊酯均具有不同程度的毒性作用。其中，溴氰菊酯是毒性最大的化合物，在4 ng/L 時造成約20%的草蝦死亡，在11 ng/L 時導致約100%的草蝦死亡[23]。鹵蟲是海水魚、蝦、蟹育苗的重要生物餌料，同時也是毒理學優良的實驗動物。在本研究中，首先采用急性毒性實驗觀察鹵蟲暴露溴氰菊酯36 h 后的毒性反應，計算LC50并進行毒性分級。研究結果顯示溴氰菊酯對鹵蟲36 h 的LC50為0.210 μg/L，按照GB/T 15670—2017《農藥登記毒理學試驗方法》農藥毒性分級標準，判定溴氰菊酯為劇毒性農藥。卵的孵化和生長是評估鹵蟲發育狀況最直接的指標。與Control 組相比，溴氰菊酯暴露的鹵蟲的孵化率、存活率和體長均顯著降低(P＜0.05)，而0.1、0.5 mg/mL山柰酚能夠顯著提高溴氰菊酯暴露鹵蟲的孵化率和存活率，0.1 mg/mL 山柰酚能夠顯著提高鹵蟲的體長(P＜0.05)，這可能是山柰酚發揮了其抗氧化活性，有效緩解了由溴氰菊酯暴露引起的氧化損傷，從而提高了鹵蟲的孵化率和存活率。此外，1 mg/mL 山柰酚會抑制鹵蟲的生長發育，表明山柰酚對鹵蟲的作用效果呈現高濃度抑制，需要控制山柰酚對鹵蟲的給藥濃度。在溴氰菊酯暴露下給藥一定濃度的山柰酚，鹵蟲的生長發育指標和單獨暴露溴氰菊酯時相比有一定的緩解作用，但仍然低于Control 組，這表明山柰酚僅能對鹵蟲的生長起到一定的改善作用，但無法完全治療氧化損傷的鹵蟲。此外，通過對鹵蟲整個發育周期的暴露實驗發現，成熟時期鹵蟲對溴氰菊酯最敏感，并且山柰酚的改善作用最為顯著。

在水生動物中，ROS 對正常細胞功能不可或缺，并在細胞防御過程中發揮重要作用。然而，過量的ROS 會導致組織或細胞的氧化損傷[24]。為防止過多ROS 對機體造成的氧化損傷，機體的抗氧化系統發揮了作用。SOD 將超氧陰離子(·O2-)和H+代謝為O2和H2O2，隨后通過CAT 和GSH-Px 轉化為H2O[25]。因此，這些抗氧化酶常被用作生態毒理學研究中的生物標志物，評估一些污染物對甲殼類動物的亞致死影響[13,26]。MDA 是脂質過氧化的主要產物，其含量反映了脂質過氧化程度[27]。在本研究中，溴氰菊酯暴露于成體鹵蟲之后，鹵蟲的SOD、CAT 和GSH-Px 活性受到抑制，MDA 含量和ROS 水平顯著上升，這些抗氧化酶活性的降低可能是過量ROS 產生造成相應蛋白的損傷所致，這說明溴氰菊酯能夠引起鹵蟲嚴重的氧化應激反應。單獨加入山柰酚之后，鹵蟲的酶活性與Control 組相比沒有顯著差異(P＞0.05)。然而，在溴氰菊酯暴露鹵蟲的培養液中加入0.1 mg/mL 山柰酚，和DEL 組相比，加入山柰酚0.1 mg/mL 組鹵蟲的SOD、CAT 和GSH-Px 活性顯著上升，MDA 含量和ROS 水平下降，山柰酚可能增強了應激狀態下鹵蟲的抗氧化能力，并消除鹵蟲氧化應激期間產生的過量ROS 。研究[28]發現，DEL 暴露導致虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)體內SOD、CAT 和GST 活性持續降低。相反，山柰酚能夠顯著提高鏈脲佐菌素誘導糖尿病大鼠的抗氧化酶活性，降低脂質過氧化物含量[29]，這與本研究結果一致。

Keap1/Nrf2/ARE 信號通路是水生動物抗氧化應激最重要的機制[30]。研究[31]表明，溴氰菊酯暴露使烏澧(Channa argus)的肝臟和腸道中基因SOD、Nrf2、NOQ1 和HO-1 表達水平降低。本研究利用實時熒光定量PCR 檢測該通路中的關鍵基因發現，溴氰菊酯暴露導致鹵蟲體內SOD、Nrf2、GST、NQO1、HO-1和CAT 的mRNA 表達減少，Keap1 的mRNA 表達增加。在鹵蟲的培養液中單獨加入山柰酚之后，鹵蟲的Nrf2 信號通路中相關基因的表達量與Control 組相比沒有顯著差異(P＞0.05)。然而，與DEL 組相比，DEL＋Ka 組中SOD、Nrf2、GST、NQO1、HO-1 和CAT 的mRNA 表達水平上調，而Keap1 基因的mRNA 表達水平下調。當溴氰菊酯暴露時，鹵蟲過量的ROS 暴露導致氧化系統和抗氧化系統之間失去平衡。山柰酚能夠激活Keap1/Nrf2/ARE 信號通路，促使Nrf2 從Keap1 中解離，轉入細胞核，并與轉錄因子結合。然后，復合物與Maf 蛋白結合形成二聚體后與抗氧化反應元件(ARE)結合，促進抗氧化基因的轉錄。Keap1 是一種負調節Nrf2 活性的胞漿蛋白[32]。研究顯示溴氰菊酯暴露提高了鹵蟲基因Keap1 的表達，山柰酚顯著抑制了溴氰菊酯誘導的Keap1 的高表達，表明山柰酚緩解溴氰菊酯誘導鹵蟲氧化應激可能是通過抑制Keap1 的表達和激活Nrf2/ARE 信號通路實現的。

4 結 論

溴氰菊酯暴露鹵蟲的孵化率、存活率和體長顯著降低，并誘導鹵蟲產生氧化應激損傷。山柰酚能夠促進溴氰菊酯誘導鹵蟲的生長發育，同時能夠提高鹵蟲的抗氧化能力和Nrf2 通路中關鍵基因的表達，對溴氰菊酯誘導鹵蟲的氧化應激具有緩解作用。本研究以鹵蟲為實驗動物，進一步拓寬了山柰酚的應用領域，同時也為農藥殘留物對水生甲殼類動物的氧化應激損傷提供了一種有效的解決方法，有助于水生動物的健康發展。