Collagen V在推拿促進長期大負荷運動大鼠肌肉干細胞自我更新中的作用研究*

張瑞馳，靳松林，李倫宇，阿衣留布，丁海麗

（成都體育學院，四川 成都 610041）

超負荷原則是現代運動訓練體系的主要原則，人體不斷適應增加的運動負荷，從而使身體機能和運動能力得到提升[1]。在此過程中，若運動負荷長時間過度超出機體承受能力，可能會導致骨骼肌損傷發生，損傷又需要足夠的時間修復[2]，但實際情況下訓練與損傷修復的時間平衡點往往難以把控。若損傷未愈仍持續大負荷運動，可導致機體組織損傷進一步累積并遷延[3]，影響運動表現。競技體育中，推拿常被應用于運動員訓練及賽后的肌肉疲勞恢復和損傷治療，效果顯著。目前，現有研究在免疫調節[4]、蛋白合成/分解代謝[5-6]和細胞外基質[7]等方面進行了探究，證實推拿以力學形式作用于損傷或疼痛部位軟組織，從而達到緩解癥狀和促進組織修復的效果[8]。但其具體作用分子機制仍不清晰，有待進一步探討。

肌衛星細胞（Muscle Satellite Cells, MSC）具有干細胞特性，即肌肉干細胞，是成體骨骼肌再生修復的主要細胞類型，通常處于靜息狀態[9]。當骨骼肌遭受損傷性刺激時，MSC 被激活并大量增殖，以滿足機體干細胞需求，這一過程中，部分激活和增殖的MSC 會重新退回靜息狀態以維持骨骼肌再生潛能，影響損傷修復[10]。V 型膠原蛋白（Collagen V,COLV）由MSC 分泌并通過作用于MSC 表面降鈣素受體介導MSC 靜息狀態的維持，是MSC 靜息生態位關鍵組成成分[11-12]。

課題組前期研究發現[13]，推拿可上調一次性大負荷運動骨骼肌損傷的Collagen V表達，促進損傷修復。然而，推拿對長期大負荷運動骨骼肌損傷的干預效果及機制仍不明晰。本實驗旨在觀察長期大負荷運動后推拿對Collagen V表達及損傷修復的影響，探討推拿能否介導Collagen V表達促進MSC 自我更新。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組8 周齡健康SPF 級雄性SD 大鼠共32 只，初始體重185±6g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，許可證號：SYXK（川）2020-030。實驗動物在成都體育學院標準動物房內分籠飼養，整個實驗過程中保持自由飲食、飲水，室溫20℃～24℃，相對濕度30%～60%，12h 光照/黑暗模擬晝夜交替環境。適應性喂養3 天后，所有大鼠按隨機數字表法分為空白對照組（C 組，n=8）、長期大負荷運動組（E 組，n=8）、長期大負荷運動+推拿組（ET 組，n=8）、長期大負荷運動+假推拿組（ES組，n=8）。本實驗過程中對動物所有處理均遵循動物倫理學標準，并得到成都體育學院動物倫理委員會批準。

1.2 試劑與器材免疫染色封閉液、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒、ECL試劑盒：碧云天。反轉錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit）、熒光定量試劑盒（TB Green TM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus））：寶日醫。BCA 蛋白濃度測定試劑盒：博士德。Collagen V 抗體：Thermo Fisher Scientific。Pax7 抗體：圣克魯斯。MyoD1 抗體、Myf5 抗體：Affinity Biosciences。HRP 標記抗兔二抗：成都正能。TSAPLus 熒光雙重染色試劑盒、Fitc 標記抗兔二抗、Cy3 標記抗小鼠二抗：賽維爾。Finger-8-TR 型推拿量化儀：蘇州長顯光電科技。YLS-13A 大小鼠抓力測定儀：徐州利華電子科技。

1.3 造模方案所有大鼠進入動物房后適應性喂養3天，其中E、ES、ET 組大鼠進行1 周適應性運動并參考張學林[14]所用方法建立4 周大負荷運動損傷模型，C組不進行運動作為對照，運動方案見表1。

表1 大鼠大負荷運動方案

1.4 干預措施根據《靈樞·經筋》中“以痛為腧”，推拿操作主要利用阿是穴原理，對損傷部位進行揉按，將機械力刺激傳遞至損傷部位。自正式運動起，每日運動結束后6h，除E組不予處理外，高年資中醫推拿科主治醫師參照鄭氏手法操作要求[15]對ET 組大鼠小腿三頭肌施以揉法為主的推拿手法，每側5min，每天1次，每周6天，休息1天，操作過程中借助Finger-8-TR 型FSR 薄膜式壓力傳感器對推拿參數進行量化和監測，根據團隊前期實驗結果[13]，并參照文獻[16]，控制推拿力度為4N 左右，頻率為120 次/min。僅對ES 組大鼠于小腿三頭肌處皮膚施以輕撫，頻率和時間同ET組。

1.5 樣本采集與處理于末次干預后24h 采用1%戊巴比妥鈉30mg/kg 腹腔麻醉，剝離兩側腓腸肌組織，左側腓腸肌內側頭采用3%戊二醛固定用于透射電子顯微鏡檢測；右側腓腸肌組織分為兩份，一份采用環保型GD 肌肉固定液固定用于后續免疫組化和免疫熒光染色，另一份以-80℃保存用于后續Western Bolt和實時熒光定量PCR檢測。

1.6 觀察指標

1.6.1 后肢抓力測試參照Wang H等[17]的方法，使用YLS-13A 大小鼠抓力測定儀進行檢測：右手抓住大鼠背部將其放于網格抓桿，使其下肢抓住抓桿，左手托起大鼠上半身緩緩將其放平，然后右手握該大鼠尾部，將抓力儀推至前端，踩踏板清零，待大鼠抓牢后，緩緩拉動大鼠尾部，直至其脫落或計數截止。抓力測定儀能夠準確記錄大鼠后肢抓力的最大值，每只大鼠重復測試3次，取平均值。

1.6.2 透射電鏡 腓腸肌組織于3%戊二醛預固定后，1%四氧化鋨再固定。丙酮逐級脫水后，將樣品先經脫水劑處理，又用環氧樹脂包埋，再經加溫聚合后切片。采用超薄切片機制備約50nm切片后，漂浮于刀槽液面上，再撈至銅網。室溫下用醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色液染色，運用JEM-1400PLUS 透射電鏡觀察超微結構并采集圖像。

1.6.3 免疫組織化學染色將固定后的組織經全自動脫水機脫水，石蠟包埋，7μm 切片，脫蠟后的切片經3%甲醇雙氧水阻斷內源性過氧化物酶，滴加免疫染色封閉液進行抗原修復，室溫封閉20min，加入一抗Collagen V（1：100），4℃孵育過夜。于次日PBS 水洗后，加入山羊抗兔二抗（1：1000），37℃孵育30min，再次PBS水洗。使用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。使用BA200Digital 數碼顯微攝像系統對切片進行圖像采集。采用Imagepro Plus 6.0 分析同一參數下總和光密度值，根據圖片總面積計算平均光密度值。

1.6.4 實時熒光定量PCR 各大鼠取100mg骨骼肌組織，采用Trizol法提取mRNA，并將獲得的mRNA 經超微量分光光度計（Thermo）檢驗純度和濃度。使用PrimeScript RT reagent Kit 試劑盒進行基因組DNA 除去反應和逆轉錄反應，獲得樣品cDNA。按照TB Green TM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）建立20μL 預混液反應體系，95℃預變性30s，95℃變性5s，55℃退火30s，72℃充分延伸30s，45 循環，并用PIKORed 96實時熒光定量儀進行擴增和采集熒光。使用PikoReal 軟件分析各檢測樣本的CT（Threshold cycle）值，通過2-△△CT計算Col5a1 和Col5a3 相對mRNA 表達水平。引物均由上海生工生物工程股份有限公司設計合成，序列如下：Col5a1:5'-GGACTCCGACTCCAATGTCTCTCC-3'；Col5a1:5'-GGCTCAATGATGGCTGGTTCTCC-3'；Col5a3:5'-TGAGAAGCTGCCGGAGACTGG-3'；Col5a3:5'-CCCTATGCACACCCAAGGTTTCC-3'；β-actin:5'-GAAGATCAAGATCATTGCTCC-3'；β-actin:5'-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3'。

1.6.5 Western Blot 各大鼠取20mg 腓腸肌組織與裂解液混合并勻漿，4℃、12000r/min離心5min，取上清液采用BCA 法測定蛋白濃度，加熱變性制作蛋白樣品。獲得樣品后加入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進行電泳（濃縮：80V 30min；分離：120V 90min），再以200mA 轉膜90min。用含5% 脫脂奶粉的TBST 封閉2h，分別加入Pax7（1：600）、MyoD1（1：1000）、Myf5（1：500）、β-actin（1：50000）一抗，4℃孵育過夜，TBST 充分洗滌，加入山羊抗兔二抗（1：10000），37℃孵育2h，TBST 再次充分洗滌，使用增強ECL 化學發光液顯影、定影，采用Image-J 軟件分析目標蛋白及內參蛋白的灰度值并計算比值。

1.6.6 免疫熒光共定位將固定后的組織經全自動脫水機脫水，石蠟包埋，7μm 切片。經梯度乙醇脫蠟后，使用EDTA（pH 8.0）對玻片進行抗原修復。滴加免疫染色封閉液室溫封閉10min 后，分別添加一定比例Collagen V（1：500）、Pax7（1：300）一抗混合液，室溫孵育1～2h 后轉移至4℃過夜。次日PBS 水洗后，滴加Fitc 標記山羊抗兔和Cy3 標記山羊抗小鼠二抗，室溫孵育2h。再次PBS 水洗，滴加DAPI，室溫孵育10min，用抗熒光淬滅封片劑封片。采用Pannoramic 250 全自動數字掃描顯微鏡進行拍照觀察，隨機選取視野采集。

1.7 統計方法采用SPSS 25.0 軟件進行統計分析，實驗數據均以均值加減標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。方差齊性檢驗采用Brown-Forsythe test和Bartlett's test，方差齊時，采用LSD檢驗；方差不齊時，采用Tamhan's T2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠后肢抓力測試各組間初始后肢抓力無顯著性差異（P＞0.05）。E 組、ES 組與ET 組4 周后抓力較C 組均顯著增加（P＜0.01）。經校準，E 組與ES 組在完成運動方案后抓力增加值較C組具有顯著性差異（P＜0.05），ET 組也具有顯著性差異（P＜0.01）；同時，ET 組較E 組和ES 組抓力增加值也具有顯著性差異（P＜0.05）；E組與ES組無顯著性差異（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠后肢抓力變化（g）

2.2 透射電鏡觀察腓腸肌超微結構C 組大鼠腓腸肌肌原纖維排列整齊，肌節明暗帶清晰可見，線粒體完整且有規律地排列在Z 線兩側。E 組與ES 組大鼠腓腸肌超微結構發生改變，肌原纖維發生斷裂和降解、Z 線斷裂、肌漿網腫脹、線粒體結構不清且腫脹。ET 組大鼠腓腸肌超微結構較E 組和ES 有明顯改善，肌原纖維排列整齊、肌漿網完整，但仍有部分線粒體結構不清，見圖2。

圖2 各組大鼠腓腸肌超微結構（×20000）

2.3 免疫組織化學染色各組大鼠腓腸肌組織均出現深棕色顆粒陽性表達，其中C組和ET組深棕色顆粒顯著多于E 組和ES 組。E 組與ES 組Collagen V表達水平較C 組均呈下降趨勢，其中E 組降低具有顯著性（P＜0.05）；ET 組Collagen V表達較其余三組均顯著升高（P＜0.01）；E 組與ES 組無顯著性差異（P＞0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠Collagen V表達（×400）

2.4 實時熒光定量PCR E 組、ES 組與ET 組Col5a1mRNA 表達水平較C 組均顯著降低（P＜0.01）；ET 組表達較E 組和ES 組呈上升趨勢，其中較E 組升高具有顯著性（P＜0.05）。E 組與ES 組Col5a3 mRNA 表達水平較C 組均顯著降低（P＜0.01）；ET 組表達較C組顯著升高（P＜0.05），同時較E 組與ES 組也顯著升高（P＜0.01）；E 組與ES 組無顯著性差異（P＞0.05），見圖4。2.5 Western Blot E 組Pax7 蛋白表達水平較C 組降低（P＜0.01），同時ES 組Pax7 蛋白表達較C 組也降低（P＜0.05），兩組MyoD 和Myf5 蛋白表達較C 組均降低（P＜0.01）；而ET 組較C 組除Pax7 蛋白表達無顯著差異（P＞0.05）外，其Pax7蛋白表達較E組和ES組顯著升高（P＜0.01），且MyoD 和Myf5 蛋白表達較另三組均顯著升高（P＜0.01）；ES 組較E 組除MyoD蛋白表達升高顯著（P＜0.05）外，其余蛋白表達均無顯著差異（P＞0.05），見圖5。

圖4 各組大鼠Col5a1和Col5a3 mRNA表達

圖5 各組大鼠Pax7、MyoD和Myf5蛋白表達

2.6 免疫熒光共定位紅色熒光標記Pax7，綠色熒光標記Collagen V，Pax7 與Collagen V共定位呈現黃色熒光。E組和ES組黃色熒光信號較C組減少；ET組黃色熒光信號較C 組無明顯差異，而較E 組和ES組增加；E 組和ES 組黃色熒光信號無明顯差異，見圖6。E 組與ES 組Pax7 與Collagen V的Overlap 系數較C 組均顯著降低（P＜0.01）；ET 組較C 組無顯著性差異（P＞0.05），而較E 組和ES 組均顯著升高（P＜0.01）；E組與ES組無顯著性差異（P＞0.05），見圖7。

圖6 各組大鼠Collagen V與Pax7免疫熒光共定位結果（×400）

圖7 各組大鼠Collagen V與Pax7共定位表達

3 討論

推拿作為中國傳統療法之一，常應用于治療長期過度使用骨骼肌引起的慢性肌肉勞損，緩解肌肉酸痛和疲勞無力等癥狀[18]。競技運動中，運動員平日反復進行的高強度訓練導致骨骼肌重復性微損傷積累，造成骨骼肌過度使用，久之則易形成慢性勞損[19-20]。有研究證實，離心大負荷運動易造成骨骼肌超微結構變化，導致骨骼肌微損傷[21-22]。而長期大負荷運動過程中，為適應骨骼肌的過度使用，其超微結構損傷及重復性微損傷會累積，出現組織炎癥浸潤及纖維化等現象[23]。推拿已被證實具有加速運動所致骨骼肌損傷修復的作用[24]，與團隊前期研究發現推拿可加速一次性大負荷運動骨骼肌超微結構損傷修復結果一致[13]。且有研究表明，通過推拿給予機體一定機械力刺激可誘導細胞骨架蛋白重塑[25]，這也對骨骼肌超微結構損傷修復具有重要意義。本研究運用大鼠四周遞增連續離心下坡跑模擬運動員長期大負荷運動狀態，通過透射電鏡觀察到大鼠腓腸肌超微結構發生了肌原纖維斷裂及降解、Z線斷裂等改變，而經推拿干預的大鼠腓腸肌超微結構有明顯改善，提示推拿可促進長期大負荷運動所致骨骼肌損傷修復。此外，另有研究表明推拿在促進損傷修復的同時還能有效改善肌肉力量[26]。本研究結果顯示，推拿組大鼠后肢抓力的提升遠超單純運動大鼠，這進一步說明推拿促進損傷修復的同時，能更有效地鞏固并增強長期大負荷運動產生的肌肉力量。

MSC 自我更新是骨骼肌損傷修復的內源性動力，該過程受MSC 生態位嚴格調控。Pax7 是MSC及其自我更新的關鍵標志物，參與維持MSC 生態位、調控其自我更新且持續表達抑制成肌細胞肌源性分化程序[27]。與此同時，骨骼肌再生修復依賴肌源性調節因子來調節分化程序[28]。MSC 通常處于靜息狀態，穩定表達Pax7，當受到損傷刺激活化后，則開始表達MyoD 和Myf5，參與肌肉中成纖維細胞等非肌肉細胞向肌肉的轉化過程。本研究檢測了大鼠腓腸肌中Pax7、MyoD 和Myf5 蛋白表達情況，以探究推拿對MSC自我更新的影響。有證據證明，運動引起的重復性損傷會降低MyoD 和Myf5 表達[29]，本研究發現單純運動組中Pax7、MyoD 和Myf5蛋白表達均降低，這說明長期大負荷運動可能導致重復性損傷。而推拿組相較于空白對照組MyoD 和Myf5 蛋白表達顯著升高，提示骨骼肌損傷后推拿有助于MSC自我更新。另一方面，推拿組三種蛋白表達較單純運動組和假推組均顯著升高，結合透射電鏡結果，提示推拿可能因促進MSC自我更新而加速長期大負荷運動所致骨骼肌損傷修復。

Collagen V是MSC 生態位關鍵組成成分，對維持MSC靜息態起重要作用。Baghdadi MB等[11]發現Collagen V缺失時，會導致MSC進入異常細胞周期，消耗干細胞池，影響MSC 生態位穩定，進而導致自我更新受損。為驗證推拿能否通過干預Collagen V表達，影響MSC 自我更新，本研究采用免疫組織化學染色法檢測Collagen V表達，發現長期大負荷運動后Collagen V表達顯著降低，而介入推拿會上調Collagen V表達，與團隊前期研究推拿對一次性大負荷運動所致骨骼肌損傷Collagen V表達變化趨勢一致[13]。與此同時，本研究還檢測了Collagen V主要基因Col5a1和Col5a3 mRNA表達，推拿干預下兩基因mRNA 表達升高，與免疫組織化學染色結果類似，這提示長期推拿有助于上調Collagen V表達。為進一步探究Collagen V在推拿干預下對MSC 自我更新的作用，本研究就Collagen V與Pax7 進行免疫熒光共定位，結果顯示長期大負荷運動后Collagen V與Pax7 共定位程度降低，而長期推拿使共定位程度有所提高，這說明Collagen V參與推拿促進MSC 自我更新過程。由此推測，推拿的確可能通過上調Collagen V表達，促進長期大負荷運動大鼠骨骼肌損傷中所進行的MSC自我更新。

綜上所述，本研究探究了推拿可能通過上調Collagen V表達的方式，促進MSC自我更新，從而加速長期大負荷運動導致骨骼肌損傷的修復，并增強肌肉力量。但由于MSC生態位成分復雜，是否還有其他細胞和因子參與推拿修復骨骼肌損傷過程，或參與調控Collagen V來間接影響其損傷修復，仍有待進一步研究。