不同產地寬筋藤藥材質量研究*

許廣寧，曹斯瓊，何嘉瑩，邱韻靜，胡綺萍，潘禮業，孫冬梅△

（1.廣東省藥品監督管理局審評認證中心，廣東 廣州 510000；2.廣東一方制藥有限公司·廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244）

寬筋藤又名伸筋藤、寬根藤等，為防己科植物中華青牛膽Tinospora sinensis（Lour.）Merr.的干燥藤莖，主產于廣東、廣西、云南、湖南等地，野生于村邊、山坡、溝邊疏林或灌木叢中[1]；其味苦性微寒，功效舒筋活絡、祛風止痛，臨床常用于風濕痹痛、筋脈拘攣、屈伸不利、跌打損傷[2]。寬筋藤作為骨科臨床常用藥材[3-4]，在民間以跌打風濕藥應用歷史悠久，主要含有黃酮類、木脂素類、苯丙素類、萜類、生物堿類等化學成分[5-8]，現代藥理研究表明其具有鎮痛、抗類風濕性關節炎等藥理活性[9-11]。歷版《中國藥典》均未收載寬筋藤，作為地方用藥，目前有關寬筋藤的質量評價研究較少[12]，與其產地相關的研究更少。由于寬筋藤的產地分布較廣，在南方地區一帶均有分布，因此對不同產地的寬筋藤藥材進行研究，為其商品藥材品質提供參考，具有十分重要的意義。本研究通過建立寬筋藤的超高效液相色譜（UPLC）特征圖譜，并同法進行含量測定，對不同產地的寬筋藤藥材質量進行綜合評價，以期為寬筋藤藥材及其制劑的質量控制提供參考。

1 儀器與材料

Thermo 高效液相色譜儀（vanquish，賽默飛公司），萬分之一天平（AP224W，梅特勒-托利多公司），百萬分之一天平（XBR36，梅特勒-托利多公司），恒溫水浴鍋（HWS28 型，上海一恒科技有限公司），超純水系統（Comfort 1，德國賽多利斯公司）。

紫丁香苷對照品（含量：95.20%，批號：111574-201605），中國食品藥品檢定研究院；木蘭花堿對照品（含量：98%，批號：wkq-20031310），四川省維克奇生物科技有限公司。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

21 批寬筋藤藥材信息詳見表1，經孫冬梅主任藥師鑒定，為防己科植物中華青牛膽Tinospora sinensis（Lour.）Merr.的干燥藤莖。

表1 寬筋藤藥材樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 選擇Waters HSS T3 C18（2.1×150mm，1.8μm）為色譜柱，以乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～9min，8%A；9～19min，8%→10%A；19～25min，10%→17%A；25～28min，17%→40%A；28～30min，40%→95%A）；檢測波長為264nm，進樣量為1μL，流速為0.35mL/min，柱溫為30℃。

2.2 供試品溶液制備精密稱定本品粉末（過三號篩）1g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，補重，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 對照品溶液制備精密稱取紫丁香苷對照品、木蘭花堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL各含20μg的混合溶液，作為對照品參照物溶液。

2.4 特征圖譜研究

2.4.1 特征圖譜方法學驗證

2.4.1.1 精密度考察取同一份供試品溶液（S14），按“2.1”項色譜條件連續進樣6 次，以15 號峰木蘭花堿為參照峰，分別計算20 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.1.2 重復性考察 取同一批次藥材（S14），采用“2.1”項下方法制備供試品溶液，平行制備6 份，按“2.2”項色譜條件分別進樣，以15號峰木蘭花堿為參照峰，分別計算20 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.4.1.3 穩定性考察取同一份供試品溶液（S14），采用“2.1”項色譜條件，分別室溫放置0、2、4、6、8、12h進行測定，以15 號峰木蘭花堿為參照峰，分別計算20 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3%，表明樣品在室溫放置12h穩定。

2.4.2 特征圖譜建立及共有峰指認取21 批寬筋藤樣品，按“2.2”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，峰面積結果見表2。將所得色譜數據導入中藥色譜特征圖譜相似度評價系統（國家藥典委員會，2012.0 版）進行結果分析，確定20 個共有峰，并生成了對照特征圖譜R，計算各批次樣品與對照特征圖譜的相似度，結果均大于0.9，說明樣品間質量較為接近，結果見圖1、表3。通過與混合對照品指認，確定2個色譜峰的成分，分別為紫丁香苷（峰5）、木蘭花堿（峰15），其中15號峰（木蘭花堿）分離度較好，響應較高，位置居中，故以15號峰為參照峰S，見圖2。

圖1 21批寬筋藤藥材UPLC特征圖譜共有峰

圖2 特征圖譜共有峰指認

表2 21批寬筋藤藥材UPLC特征圖譜共有峰相對峰面積

表3 21批寬筋藤藥材UPLC特征圖譜相似度結果表

2.4.3 寬筋藤樣品聚類分析將各色譜峰面積相對于稱樣量量化，運用SPSS 20.0軟件對4個產地寬筋藤樣品進行系統聚類，采用組間平均數聯結法，以夾角余弦作為樣品相似度的距離公式。聚類分析將寬筋藤樣品分為2 類，I類包括S1～S10，即廣東肇慶和廣東陽江聚為一類；Ⅱ類包括S11～S21，即廣西河池與廣西百色聚為一類，詳見圖3。

圖3 聚類分析結果

2.4.4 偏最小二乘法分析以21 批不同產地的寬筋藤樣品中20 個色譜峰相對峰面積作為變量，通過SIMCA 14.1 軟件進行判別分析，共得到2 個主成分，其模型解釋率參數R2X為0.679，R2Y為0.804，Q2為0.626，模型的預測能力較好（見圖4），并通過20折置換檢驗，得到R2擬合Y 坐標的截距為0.261，小于0.3，說明模型擬合較好；Q2 擬合Y 坐標的截距為-0.195，小于0.05，說明模型未過度擬合，見圖5。21批樣品的得分圖見圖6，廣東肇慶、廣東陽江分為一類，廣西百色、廣西河池分為一類，與聚類分析的結果一致。對主要影響的變量VIP 值進行分析（見圖7），以VIP 值大于1 限度，得到7 個貢獻度高的差異性化合物，分別為峰12、峰18、峰11、峰7、峰2、峰17、峰20，說明上述幾個成分可能為寬筋藤的潛在質量標志物。

圖4 2個主成分累計貢獻率

圖5 置換驗證圖

圖6 不同樣品PLS-DA得分圖

圖7 PLS-DA VIP值圖

2.5 含量測定研究

2.5.1 線性考察精密稱取木蘭花堿對照品2.270mg于10mL量瓶中，加甲醇制成223.0956μg/mL的對照品母液。精密量取上述木蘭花堿對照品母液0.1mL，置50mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1mL 含木蘭花堿對照品0.446μg 的對照品溶液；精密量取上述母液0.10.4mL、0.4mL，分別置5mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1mL 含木蘭花堿對照品4.462μg、17.848μg 的對照品溶液；精密量取上述對照品母液0.2mL、0.3mL、0.7mL、1mL，分別置2mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1mL 含木蘭花堿對照品22.310μg、33.464μg、78.083μg、111.548μg 的對照品溶液；分別按照“2.1”項下色譜條件依次進樣1μL，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標（y），對照品濃度為橫坐標（x）繪制標準曲線，線性回歸方程為：y=5292.6x+4400.4，相關系數r=0.9996，表明在濃度為0.446μg/mL～111.548μg/mL的范圍內線性關系良好。

2.5.2 精密度考察精密吸取木蘭花堿對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件連續進樣6 次，以木蘭花堿峰面積計算RSD為0.98%，說明儀器精密度良好。

2.5.3 穩定性考察取本品粉末（S19），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12h 進樣測定，計算峰面積RSD 值為2.10%，說明供試品溶液在12h內穩定性良好。

2.5.4 重復性考察取同一批藥材粉末（S19）約1g，精密稱定，平行稱定6 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液6 份，按“2.1”項下色譜條件測定，計算含量RSD值為1.46%，該分析方法的重復性良好。

2.5.5 加樣回收率考察取本品粉末（S19）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行制備6 份，每份按照對照品與樣品含量比例為1：1 加入對照品，按“2.2”項下確定的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，測定，計算加樣回收率范圍為94.92%～102.89%，RSD值為2.99%，結果表明回收率良好。

2.5.6 樣品測定取21 批寬筋藤樣品按上述方法進行含量測定，結果見表4。根據結果可知木蘭花堿含量均值為0.64mg/g，RSD 為30.60%，實測范圍0.35～1.31mg/g，廣東肇慶的含量均值為0.76mg/g，廣東陽江的含量均值為0.66mg/g，廣西河池的含量均值為0.52mg/g，廣西百色的含量均值為0.63mg/g，說明不同產地間的含量波動較大。

表4 21批寬筋藤樣品含量測定結果

3 討論

本文采用超高效液相色譜法（UPLC）建立了同法測定寬筋藤特征圖譜及含量測定的方法，對21批來自廣東肇慶、廣東陽江、廣西河池、廣西百色的寬筋藤進行系統研究。寬筋藤化學成分豐富，利用超高效液相色譜法（UPLC）分析時間短、效率高的優勢，可以實現快速分析。同時對不同檢測波長進行了考察，最終選擇了色譜峰信息最豐富的264nm 為檢測波長，并在此基礎上對流動相進行考察，選擇乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相系統，所建立的方法科學合理。

特征圖譜研究結果顯示，不同產地間的樣品質量較為接近，相似度達到0.9 以上。聚類分析及偏最小二乘法分析結果顯示，廣東肇慶、廣東陽江的樣品可以分為一類，廣西百色、廣西河池的樣品可以分為一類，兩者結果一致。偏最小二乘法分析結果同時提取了7 個成分，可能為寬筋藤的潛在質量標志物，但本研究尚未能明確其具體成分，有所不足，下一步可繼續研究。文獻研究顯示，生物堿是寬筋藤的藥理藥效成分之一，因此本研究對特征圖譜中確認的生物堿成分木蘭花堿進行了定量研究。含量測定結果顯示，不同產地的寬筋藤藥材木蘭花堿的含量波動較大，因此可以選擇木蘭花堿作為寬筋藤的質量控制指標，從而客觀反映寬筋藤藥材的質量差異[8]。有文獻報道寬筋藤藥材在全國分布無明顯地域特征，但在一些相鄰的省份藥材質量較為相似[13]。本研究選定的4 個產地均為嶺南地區，為亞熱帶季風氣候，光熱充沛，雨熱同季，夏長冬短，因此受環境影響，寬筋藤藥材的質量從特征圖譜可見整體相對穩定。但廣東肇慶、廣東陽江為北回歸線附近地區，沿海氣候，而廣西河池、廣西百色地處云貴高原南麓，是典型的山區環境，因此地區環境差異導致不同產地寬筋藤藥材質量的略有不同。

本研究通過建立寬筋藤藥材的UPLC特征圖譜及含量測定方法，對4 個不同產地的21 批寬筋藤藥材進行了綜合評價，結果能更全面反映不同產地寬筋藤藥材的質量，為寬筋藤藥材的質量控制提供了參考。